技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株生產(chǎn)c23h26o4的簡單節(jié)桿菌菌株，相關(guān)液體菌劑及其在生產(chǎn)c23h26o4中的應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及一株發(fā)酵生產(chǎn)c23h26o4的簡單節(jié)桿菌菌株，含有菌株的菌劑及在生產(chǎn)c23h26o4中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：c23h26o4做為一個甾體中間體，是合成地塞米松、倍他米松、布地奈德、環(huán)索萘德等甾體藥品的重要中間體。在一般從c23h28o4發(fā)酵生成c23h26o4的過程中，會伴隨c17位尾鏈-醋酸酯的水解，產(chǎn)物是一個混合物，在提取后還需要做一步酯化，才能達到單一的c23h26o4。選擇一個合適的菌株，定向微生物脫氫得到c23h26o4是目前甾體微生物研究的一個重要方向。技術(shù)實現(xiàn)要素：：本發(fā)明的第一個目的是提供一株簡單節(jié)桿菌突變株，使用該突變株，可將c23h26o4轉(zhuǎn)化為c23h26o4，且該突變株不會對c17位尾鏈水解，且雜質(zhì)含量少。本發(fā)明的第二個目的是提供一種含有簡單節(jié)桿菌突變株的液體菌劑。在必要的時候，該液體菌劑還可以包含菌劑制備常用的載體和輔料。本發(fā)明的第三個目的是提供簡單節(jié)桿菌突變株及其菌劑在發(fā)酵生產(chǎn)c23h26o4中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個目的是提供發(fā)酵生產(chǎn)c23h26o4高產(chǎn)能的方法。本發(fā)明公開了一株簡單節(jié)桿菌(arthrobactersimplex)突變株sz-bbc-102，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號是cgmccno.13665，保藏日期是2017年02月17日。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心簡稱cgmcc，位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。本發(fā)明中公開的簡單節(jié)桿菌(arthrobactersimplex)突變株sz-bbc-102，cgmccno.13665通過如下方式選育獲得：菌種分離：菌種的分離基物是土壤，使用固體培養(yǎng)基劃線，31～32℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，挑選單菌落表面光滑，邊緣規(guī)則，顏色為灰白色，顯微鏡微觀為短桿狀進行再培養(yǎng)，使用液體培養(yǎng)基在31～32℃，210rpm培養(yǎng)。菌種誘導：當菌體密度生長至108個/ml，離心收集菌體，用檸檬酸鈉溶液洗菌，并用檸檬酸鈉溶液將菌體稀釋到原體積，并加入亞硝基胍，制成菌懸液，菌懸液35℃水浴30分鐘，再次離心，菌體用磷酸緩沖液沖洗，并重新在磷酸緩沖液中懸浮分散。菌株生長篩選：將誘變后的菌懸液進行稀釋涂布至初篩固體培養(yǎng)基上，于31～32℃培養(yǎng)2天，挑取單菌落接種到復(fù)篩固體培養(yǎng)基中，凡在復(fù)篩培養(yǎng)基中不能生長的菌體，用初篩培養(yǎng)基進行進一步的純化培養(yǎng)，得到誘變后的菌株。菌株轉(zhuǎn)化篩選：將誘變后的菌株接種到液體培養(yǎng)基上，31～32℃，210rpm培養(yǎng)24小時，再接種到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，接種量10％，在32℃，210rpm，轉(zhuǎn)化72小時，取樣送液相檢測，根據(jù)液相結(jié)果確定誘變后菌株轉(zhuǎn)化生成c23h26o4能力的優(yōu)略。經(jīng)過以上誘變篩選工作，得到一株優(yōu)良的變異菌株，并命名為簡單節(jié)桿菌(arthrobactersimplex)突變株sz-bbc-102，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號是cgmccno.13665，保藏日期是2017年02月17日。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心簡稱cgmcc，位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。簡單節(jié)桿菌突變株sz-bbc-102，cgmccno.13665有如下形態(tài)學特征：菌體形態(tài)呈短桿狀，菌落表面光滑，邊緣規(guī)則，顏色為灰白色，菌體尺寸較一般細菌小，長約0.6～1.0微米，寬0.3～0.4微米?？蓪23h28o4轉(zhuǎn)化為c23h26o4，重量收率可達90～95％，達到工業(yè)化生產(chǎn)標準。本發(fā)明的發(fā)酵反應(yīng)如附圖1所示。本發(fā)明還公開了含有簡單節(jié)桿菌突變株sz-bbc-102，cgmccno.13665的液體菌劑，按重量計，該菌劑含菌體生物量是1.5％～2.0％，余量為培養(yǎng)過cgmccno.13665的液體培養(yǎng)基。本發(fā)明還公開了制備簡單節(jié)桿菌突變株及其液體菌劑的方法。生產(chǎn)液體菌劑的方法包括下列步驟：a斜面種子培養(yǎng)：將cgmccno.13665接種于固體培養(yǎng)基上，31～32℃培養(yǎng)；b液體種子培養(yǎng)：從a項培養(yǎng)的固體斜面上刮取菌體，接種到液體培養(yǎng)基中，210rpm，31～32℃培養(yǎng)；c計數(shù)：按重量計，含菌體生物量是1.5％～2.0％，余量為培養(yǎng)過cgmccno.13665的液體培養(yǎng)基，得液體菌劑；其中，固體培養(yǎng)基組分是：蛋白胨5g/l，酵母膏1.5g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氫二鉀1.5g/l，瓊脂1.5％～2.0％，余量為水，ph7.0～7.2；液體培養(yǎng)基組分是：蛋白胨5g/l，牛肉膏3g/l，ppe消泡劑0.5g/l，余量為水，ph7.0～7.2。本發(fā)明還公開了簡單節(jié)桿菌突變株及其菌劑在發(fā)酵生產(chǎn)c23h26o4中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了生產(chǎn)c23h26o4的方法，該方法包括下列步驟：①發(fā)酵培養(yǎng)：將權(quán)利要求2所述液體菌劑接種到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為5％～10％，于31℃，轉(zhuǎn)速180rpm，空氣流量30l/min，罐壓0.05mpa條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24小時，而后進行底物投料，底物投料濃度為2.0％，投料完成后于32℃，轉(zhuǎn)速210rpm，空氣流量15l/min，罐壓0.05mpa條件下轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時間為72小時；②分離提?。弘x心收集菌體(菌泥)，菌泥乙醇萃取，萃取液濃縮，離心，水洗，離心，干燥得c23h26o4；其中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組分為：蛋白胨3g/l，酵母膏1g/l，葡萄糖10g/l，磷酸二氫鉀2.5g/l，玉米漿10g/l，誘導物0.5g/l，消泡劑1g/l，余量為水，ph值8.0～8.5；所述誘導物為c23h28o4。在本發(fā)明中底物和誘導物均為c23h28o4。在本發(fā)明中，c23h26o4是地塞米松、倍他米松、甲基強的松龍等重要中間體。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明中的突變的簡單節(jié)桿菌在9,11位雙鍵結(jié)構(gòu)下，仍具有較強的1,2位脫氫能力；本發(fā)明利用一株突變的簡單節(jié)桿菌發(fā)酵生產(chǎn)c23h26o4，使用合適的發(fā)酵液，接種濃度和發(fā)酵培養(yǎng)條件，顯著提高了簡單節(jié)桿菌生產(chǎn)c23h26o4的效率，并縮短的發(fā)酵工藝流程，節(jié)約發(fā)酵時間，并顯著減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生；本發(fā)明采用的簡單節(jié)桿菌生產(chǎn)c23h26o4，該突變株不會對c17位尾鏈進行水解，有效的保留了c17位尾鏈結(jié)構(gòu)；本發(fā)明的制備c23h26o4的方法還具有下面特點：底物投料量大,重量收率可達90～95％，獲得的c23h26o4成品純度高達94.7％,且雜質(zhì)量較少，生產(chǎn)成本較低，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，為利用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)c23h26o4提供了新的思路。本發(fā)明涉及的突變菌株以及相關(guān)發(fā)酵方法具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。附圖說明圖1是生物發(fā)酵反應(yīng)示意圖，其中a表示c23h28o4，b表示c23h26o4。圖2是c23h26o4精致成品的高效液相色譜圖。具體實施方式下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1簡單節(jié)桿菌突變株sz-bbc-102的選育獲得。1.1菌種分離：在本工廠廠區(qū)存放植物甾醇的廠房附近的土壤取樣，使用固體培養(yǎng)基劃線，31℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，挑選單菌落表面濕潤光滑，邊緣規(guī)則，顏色為乳白色，顯微鏡微觀為短桿狀進行再培養(yǎng)，使用液體培養(yǎng)基在31℃，150rpm培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基配方及配制方法：蛋白胨5g/l，酵母膏1.5g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氫二鉀1.5g/l，按實際需要秤取以上物質(zhì)，加入純化水定容至1l，攪拌溶解，1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)ph7.0～7.2，加入瓊脂2.0％，加熱溶清，如制作斜面，溶清后分裝至試管或茄型瓶中，121℃滅菌20分鐘，冷卻到70℃擺放斜面或倒平板，冷卻至室溫凝固后，31℃空培養(yǎng)48小時，無菌落出現(xiàn)則可以使用。液體培養(yǎng)基配方及配制方法：蛋白胨5g/l，牛肉膏3g/l，ppe消泡劑0.5g/l，1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)ph7.0～7.2，用純化水定容至1l，121℃滅菌20分鐘。1.2菌體誘變：當菌體生長密度達到108個/ml，將液體菌劑涂布于固體培養(yǎng)基平板上，并于涂布接種后再在固體培養(yǎng)基平板中央及周邊數(shù)處均勻點放亞硝基胍小顆粒，31℃培養(yǎng)7天后，用接種環(huán)緊靠各個亞硝基胍抑菌圈外側(cè)，將菌苔挑于無菌生理鹽水中制成菌懸液，用以進行突變株篩選。1.3突變株篩選：將誘變后的菌懸液進行稀釋涂布，培養(yǎng)基使用初篩培養(yǎng)基，于31℃培養(yǎng)7天。挑取單菌落接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，凡是在復(fù)篩培養(yǎng)基中不能生長的菌體，用初篩培養(yǎng)基進行進一步的純化培養(yǎng)，得到誘變后的菌株。初篩培養(yǎng)基配方及配制方法：葡萄糖10g/l，磷酸氫二鈉4g/l，磷酸二氫鉀4g/l，七水硫酸鎂0.3g/l，七水硫酸亞鐵0.05g/l，瓊脂20g/l，ph7.0～7.2，培養(yǎng)基121℃滅菌20分鐘。復(fù)篩培養(yǎng)基配方及配制方法：c23h26o45g/l，磷酸氫二鈉4g/l，磷酸二氫鉀4g/l，七水硫酸鎂0.3g/l，七水硫酸亞鐵0.05g/l，瓊脂20g/l，ph7.0～7.2，培養(yǎng)基121℃滅菌20分鐘。1.4菌種搖瓶轉(zhuǎn)化能力測試：將誘變后的菌株接種到液體培養(yǎng)基上，31℃，210rpm，培養(yǎng)24小時，再接種到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，接種量10％，于31℃，轉(zhuǎn)速180rpm，空氣流量30l/min，罐壓0.05mpa條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時，而后進行底物投料，底物投料濃度為2.0％，投料完成后于32℃，轉(zhuǎn)速210rpm，空氣流量15l/min，罐壓0.05mpa條件下轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化72小時，取樣送液相檢測，根據(jù)液相結(jié)果對比突變后的菌株轉(zhuǎn)化能力優(yōu)劣，最終確定目標菌株。液體培養(yǎng)基配方及配制方法：蛋白胨5g/l，牛肉膏3g/l，ppe消泡劑0.5g/l，余量為水，1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)ph7.0～7.2，121℃滅菌20分鐘。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方及配制方法：蛋白胨3g/l，酵母膏1g/l，葡萄糖10g/l，磷酸二氫鉀2.5g/l，玉米漿10g/l，誘導物0.5g/l，消泡劑1g/l，余量為水，ph值8.0～8.5。經(jīng)過以上誘變選育工作，得到一株優(yōu)良的突變株，分類命名為簡單節(jié)桿菌(arthrobactersimplex)突變株sz-bbc-102，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號是cgmccno.13665，保藏日期是2017年02月17日。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心簡稱cgmcc，位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。簡單節(jié)桿菌突變株sz-bbc-102，cgmcc9725有如下特征：在不同生長環(huán)境下，菌體形態(tài)呈現(xiàn)差別，但基本上均為短桿狀，菌落表面粗糙，邊緣不規(guī)則，顏色為灰白色或淡黃色，菌體尺寸較一般細菌小，長約0.6～1.0微米，寬0.3～0.4微米?？蓪23h28o4脫氫轉(zhuǎn)化為c23h26o4，雜質(zhì)少，純化方便，產(chǎn)率高。實施例2簡單節(jié)桿菌突變株sz-bbc-102液體菌劑制備方法。2.1斜面固體培養(yǎng)基的配制蛋白胨5g/l，酵母膏1.5g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氫二鉀1.5g/l，按實際需要秤取以上物質(zhì)，加入純化水定容至1l，攪拌溶解，1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)ph7.0～7.2，加入瓊脂2.0％，加熱溶清，分裝至茄型瓶中，加入量約為茄型瓶的20％，然后塞好膠塞，于121℃滅菌20分鐘，冷卻到70℃擺放斜面，冷卻至室溫凝固后，31℃空培48小時，無菌落出現(xiàn)則可以使用。2.2液體種子培養(yǎng)基的配制：蛋白胨5g/l，牛肉膏3g/l，ppe消泡劑0.5g/l，余量為水，1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)ph7.0～7.2，121℃滅菌20分鐘，冷卻到室溫。2.3將簡單節(jié)桿菌突變株sz-bbc-102接種到斜面固體培養(yǎng)基上，于31℃培養(yǎng)48小時。從斜面固體培養(yǎng)基上刮取菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，在31℃，210rpm，培養(yǎng)24小時，得液體菌劑。2.4取樣計數(shù)，按生物量測定方法測菌體含量，按重量計，該液體菌劑的含生物量約為1％～1.5％，余量為培養(yǎng)過簡單節(jié)桿菌突變株的培養(yǎng)基。生物量測定方法：取100ml樣品，抽濾，濾渣刮下，放置在濾紙上將培養(yǎng)基吸干，稱重結(jié)果如下。實驗批次菌體重量生物量余量201502011.25g1.25％培養(yǎng)基201502021.39g1.39％培養(yǎng)基201502031.00g1.00％培養(yǎng)基201503011.47g1.47％培養(yǎng)基201503021.50g1.50％培養(yǎng)基201503031.12g1.12％培養(yǎng)基實施例3簡單節(jié)桿菌突變株sz-bbc-102菌株及液體菌劑的應(yīng)用。3.1檢測方法(1)高效液相色譜檢測條件流動相：甲醇：水＝65:35，流速：1.0ml/min，檢測波長：240nm，柱溫：30℃，進樣量：10μl，溶液配制：準確稱取15mg供試品，用甲醇稀釋至50ml，操作：分別進10μl空白溶液和測試液。(2)重量收率＝(c23h26o4重量÷底物重量)×100％。3.25l搖瓶轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)：將液體菌劑接種到滅菌后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，接種量為10％，于31℃，210rpm，培養(yǎng)24小時，而后進行底物投料，底物投料濃度為2.0％，投料完成后于32℃，轉(zhuǎn)速210rpm，轉(zhuǎn)化72小時，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨3g/l，酵母膏1g/l，葡萄糖10g/l，磷酸二氫鉀2.5g/l，玉米漿10g/l，誘導物0.5g/l，消泡劑1g/l，余量為水，ph值8.0～8.5；分離提?。喝?，薄層色譜(tlc)點板檢測，轉(zhuǎn)化≥90％，停止轉(zhuǎn)化，離心收集菌體(菌泥)，用10體積95％乙醇萃取兩次，乙醇萃取液濃縮至絕大部分結(jié)晶析出，離心得到c23h26o4萃取粗品，2體積的水拌洗兩遍，離心分離得到c23h26o4精制半成品，70℃，-0.07mpa，干燥12小時，得到c23h26o4精制成品，送高效液相色譜檢測含量，c23h26o4重量收率如下：實驗批次重量收率2014060191.3％2014060295.0％2014070192.7％2014070294.5％2014080192.6％2014080290.0％3.350l發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)：將液體菌劑接種到滅菌后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基裝樣量為27l，接種量為10％，共計30l，于31℃，轉(zhuǎn)速180rpm，空氣流量30l/min，罐壓0.05mpa條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時，而后進行底物投料，底物投料濃度為2.0％，投料完成后于32℃，轉(zhuǎn)速210rpm，空氣流量15l/min，罐壓0.05mpa條件下轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化72小時。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨3g/l，酵母膏1g/l，葡萄糖10g/l，磷酸二氫鉀2.5g/l，玉米漿10g/l，誘導物0.5g/l，消泡劑1g/l，余量為水，ph值8.0～8.5。分離提?。喝樱由V(tlc)點板檢測，轉(zhuǎn)化≥90％，停止轉(zhuǎn)化，離心收集菌體(菌泥)，用10體積95％乙醇萃取兩次，乙醇萃取液濃縮至絕大部分結(jié)晶析出，離心得到c23h26o4萃取粗品，2體積的水拌洗兩遍，離心分離得到c23h26o4精制半成品，70℃，-0.07mpa，干燥12小時，得到c23h26o4精制成品，送高效液相色譜檢測，高效液相色譜譜圖見圖2，c23h26o4重量收率93.6％。根據(jù)圖2顯示的產(chǎn)物及雜質(zhì)如下：以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12