本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種能夠合成甘草次酸的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，包括了含有甘草次酸生物合成途徑的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

萜類是自然界中具有代表性的生物活性分子，是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的物質(zhì)，在植物與環(huán)境相互作用中扮演重要角色，同時(shí)也是香料、藥物、殺蟲劑、甜味劑等產(chǎn)品的工業(yè)原材料。甘草次酸是一種五環(huán)三萜化合物，由于比甘草主要活性成分甘草酸少兩分子葡萄糖酸酸，使其更易穿透細(xì)胞膜，更易在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗炎、抗病毒、降血脂、防治腫瘤和抗艾滋病等作用。受表觀遺傳等因素影響，甘草次酸在甘草中累積量很低，目前主要通過(guò)化學(xué)水解甘草酸而獲得，成本高、周期長(zhǎng)、工藝污染大；而高度復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)使得利用傳統(tǒng)化學(xué)合成也難以實(shí)現(xiàn)。

相反，甘草次酸生物合成途徑的解析為構(gòu)建人工合成體系提供了機(jī)會(huì)，利用微生物可以利用廉價(jià)碳源、生長(zhǎng)周期短、更易控制等優(yōu)勢(shì)發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸將有利于提高高值化學(xué)品的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，且符合綠色發(fā)展理念。

目前還未在微生物中發(fā)現(xiàn)甘草次酸合成相關(guān)的酶或基因，僅在植物中存在關(guān)鍵合成酶或基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)甘草次酸水解生產(chǎn)和化學(xué)合成方法的局限和困難的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用釀酒酵母合成甘草次酸的方法。本發(fā)明構(gòu)建的釀酒酵母工程菌，將多個(gè)基因表達(dá)盒通過(guò)酵母強(qiáng)大的同源重組系統(tǒng)重組至酵母基因組中，表達(dá)遺傳更穩(wěn)定，無(wú)需額外添加抗生素控制外源基因的穩(wěn)定性。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種能夠合成甘草次酸的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，首先利用來(lái)源于光果甘草的β-香樹脂醇合酶ggbas基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab037203)、來(lái)源于烏拉爾甘草的細(xì)胞色素p450氧化酶cyp88d6基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab433179)和細(xì)胞色素p450氧化酶cyp72a154基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab558146)、以及來(lái)源于擬南芥的細(xì)胞色素還原酶cpr1基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab433179)和細(xì)胞色素還原酶cpr2基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab558146)制備獲得ggbas基因片段、cyp88d6基因片段、cyp72a154基因片段、cpr1基因片段以及cpr2基因片段，分別上述基因片段與酵母啟動(dòng)子和酵母終止子通過(guò)兩步重疊延伸pcr連接，得到基因表達(dá)盒fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t和gpm1p-cpr2-cyc1t；然后將共轉(zhuǎn)化上述基因表達(dá)盒于釀酒酵母cen.pk2-1c中，利用酵母同源重組能力組裝形成具有完整甘草次酸生物合成途徑的釀酒酵母工程菌。

進(jìn)一步地，ggbas基因片段的制備具體為：利用釀酒酵母密碼子偏好性對(duì)光果甘草中的β-香樹脂醇合酶ggbas基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab037203)進(jìn)行密碼子優(yōu)化并化學(xué)合成，然后擴(kuò)增獲得ggbas基因片段(如seq.idno.1所示)；

進(jìn)一步地，cyp88d6基因片段的制備具體為：利用釀酒酵母密碼子偏好性對(duì)烏拉爾甘草中的細(xì)胞色素p450氧化酶cyp88d6基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab433179)進(jìn)行密碼子優(yōu)化并化學(xué)合成，然后擴(kuò)增獲得cyp88d6基因片段(如seq.idno.4所示)；

進(jìn)一步地，cyp72a154基因片段的制備具體為：利用釀酒酵母密碼子偏好性對(duì)烏拉爾甘草中的細(xì)胞色素p450氧化酶cyp72a154基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab558146)進(jìn)行密碼子優(yōu)化并化學(xué)合成，然后擴(kuò)增獲得cyp72a154基因片段(如seqidno.7所示)；

進(jìn)一步地，cpr1基因片段的制備具體為：從擬南芥葉中提取總rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，以擬南芥細(xì)胞色素還原酶cpr1基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab433179)設(shè)計(jì)引物，利用cdna為模板擴(kuò)增獲得cpr1基因片段(如seqidno.10所示)；

進(jìn)一步地，cpr2基因片段的制備具體為：從擬南芥葉中提取總rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，以擬南芥細(xì)胞色素還原酶cpr2基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab558146)設(shè)計(jì)引物，利用cdna為模板擴(kuò)增獲得cpr2基因片段(如seqidno.13所示)；

進(jìn)一步地，所述基因表達(dá)盒的制備具體為：分別將酵母啟動(dòng)子fba1p、終止子fba1t和所述ggbas基因片段，酵母啟動(dòng)子pgk1p、終止子gmp1t和所述cyp88d6基因片段，酵母啟動(dòng)子eno2p、終止子tys1t和所述cyp72a154基因片段，酵母啟動(dòng)子ala1p、終止子ala1t和所述cpr1基因片段，酵母啟動(dòng)子gpm1p、終止子cyc1t和所述cpr2基因片段通過(guò)兩步重疊延伸pcr連接，得到基因表達(dá)盒fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t和gpm1p-cpr2-cyc1t。

所述具有完整甘草次酸生物合成途徑的釀酒酵母工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果：

(1)本發(fā)明所述方法在釀酒酵母工程菌中導(dǎo)入了完整甘草次酸合成途徑，能夠發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸，實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母中甘草次酸的人工合成。

(2)本發(fā)明所述方法制備獲得的釀酒酵母工程菌，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明所構(gòu)建的釀酒酵母工程菌，將多個(gè)基因表達(dá)盒通過(guò)酵母強(qiáng)大的同源重組系統(tǒng)重組至酵母基因組中，表達(dá)遺傳更穩(wěn)定，無(wú)需額外添加抗生素控制外源基因的穩(wěn)定性。

本發(fā)明所構(gòu)建的釀酒酵母工程菌中，甘草次酸合成途徑受組成型啟動(dòng)子控制，發(fā)酵過(guò)程無(wú)需添加誘導(dǎo)劑、效應(yīng)劑，節(jié)約了發(fā)酵成本，且發(fā)酵過(guò)程控制更加簡(jiǎn)單。

本發(fā)明的釀酒酵母工程菌可利用酵母自身代謝提供甘草次酸合成的前體物，能夠以葡萄糖或乙醇為原料合成甘草次酸，原料成本低。

附圖說(shuō)明

圖1為甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品的組分分析離子流圖；

圖2為本發(fā)明中釀酒酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸的組分分析離子流圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

相反，本發(fā)明涵蓋任何由權(quán)利要求定義的在本發(fā)明的精髓和范圍上做的替代、修改、等效方法以及方案。進(jìn)一步，為了使公眾對(duì)本發(fā)明有更好的了解，在下文對(duì)本發(fā)明的細(xì)節(jié)描述中，詳盡描述了一些特定的細(xì)節(jié)部分。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)沒(méi)有這些細(xì)節(jié)部分的描述也可以完全理解本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種能夠合成甘草次酸的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，首先利用來(lái)源于光果甘草的β-香樹脂醇合酶ggbas基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab037203)、來(lái)源于烏拉爾甘草的細(xì)胞色素p450氧化酶cyp88d6基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab433179)和細(xì)胞色素p450氧化酶cyp72a154基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab558146)、以及來(lái)源于擬南芥的細(xì)胞色素還原酶cpr1基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab433179)和細(xì)胞色素還原酶cpr2基因(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab558146)制備獲得ggbas基因片段、cyp88d6基因片段、cyp72a154基因片段、cpr1基因片段以及cpr2基因片段，分別上述基因片段與酵母啟動(dòng)子和酵母終止子通過(guò)兩步重疊延伸pcr連接，得到基因表達(dá)盒fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t和gpm1p-cpr2-cyc1t；然后將共轉(zhuǎn)化上述基因表達(dá)盒于釀酒酵母cen.pk2-1c中，利用酵母同源重組能力組裝形成具有完整甘草次酸生物合成途徑的釀酒酵母工程菌。

其中，釀酒酵母作為真核微生物，具有合成萜類化合物所必需的前體物，且遺傳背景清楚，遺傳操作簡(jiǎn)單，具有完整蛋白質(zhì)翻譯后修飾功能，因此是表達(dá)植物源基因合成甘草次酸的優(yōu)秀潛在宿主。通過(guò)引入甘草次酸合成必需的β-香樹脂醇合酶、細(xì)胞色素p450氧化酶和細(xì)胞色素p450氧化還原酶實(shí)現(xiàn)釀酒酵母生產(chǎn)三萜化合物，將為其它復(fù)雜結(jié)構(gòu)萜類化合物的微生物人工高效合成提供技術(shù)支持。

所述構(gòu)建方法具體包括如下步驟：

1.基因表達(dá)盒的構(gòu)建

(1)從genbank基因庫(kù)中查詢獲得光果甘草β-香樹脂醇合酶ggbas基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab037203)，利用釀酒酵母密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，化學(xué)合成后擴(kuò)增獲得ggbas基因片段(如seq.idno.1所示)。

引物序列為：

5’>ttgtcatatataaccataaccaagtaatacatattcaaaatgtggagattgaagatcgc<3’(如seq.idno.2所示)；和

5’>atactcattaaaaaactatatcaattaatttgaattaacttaagtcaaacaaactggag<3’(如seqidno.3所示)；

(2)從genbank基因庫(kù)中查詢獲得烏拉爾甘草細(xì)胞色素p450氧化酶cyp88d6基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab433179)，利用釀酒酵母密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，化學(xué)合成后擴(kuò)增獲得cyp88d6基因片段(如seqidno.4所示)。引物序列為：

5’>aggaagtaattatctactttttacaacaaatataaaacaatggaagtacattgggtttg<3’(如seqidno.5所示)；和

5’>gagggaaaaagaaatcatcaaatcattcattcttcagacttaagcacaagaaaccttga<3’(如seqidno.6所示)。

(3)從genbank基因庫(kù)中查詢獲得烏拉爾甘草細(xì)胞色素p450氧化酶cyp72a154基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab558146)，利用釀酒酵母密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，化學(xué)合成后擴(kuò)增獲得cyp72a154基因片段(如seqidno.7所示)。引物序列為：

5’>cataacaccaagcaactaatactataacatacaataataatggacgcttcttctactcc<3’(如seqidno.8所示)；和

5’>ttattatattatgaatcgtgaaaacggattaagctatgcttacaacttgtgcaagatga<3’(如seqidno.9所示)；

(4)從新鮮的擬南芥葉中提取總rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，以genbank基因庫(kù)中查詢獲得的擬南芥細(xì)胞色素還原酶cpr1基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab433179)設(shè)計(jì)引物，利用cdna為模板擴(kuò)增獲得cpr1基因片段(如seqidno.10所示)。引物序列為：

5’>tctttcaagaagcaattaactacatcaactagaaccataatgacttctgctttgtatgc<3’(如seqidno.11所示)；和

5’>agaactcctatgcattatttttcgttttattttaacttctcaccagacatctctgaggt<3’(如seqidno.12所示)；

(5)從新鮮的擬南芥葉中提取總rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna，以genbank基因庫(kù)中查詢獲得的擬南芥細(xì)胞色素還原酶cpr2基因序列(genbank注冊(cè)序列號(hào)為ab558146)設(shè)計(jì)引物，利用cdna為模板擴(kuò)增獲得cpr2基因片段(如seqidno.13所示)。引物序列為：

5’>ttcttcttaataatccaaacaaacacacatattacaataatgtcctcttcttcttcttc<3’(如seqidno.14所示)；和

5’>gagggcgtgaatgtaagcgtgacataactaattacatgattaccatacatctctaagat<3’(如seqidno.15所示)。

2.分別將酵母啟動(dòng)子fba1p、終止子fba1t和所述ggbas基因片段，酵母啟動(dòng)子pgk1p、終止子gmp1t和所述cyp88d6基因片段，酵母啟動(dòng)子eno2p、終止子tys1t和所述cyp72a154基因片段，酵母啟動(dòng)子ala1p、終止子ala1t和所述cpr1基因片段，酵母啟動(dòng)子gpm1p、終止子cyc1t和所述cpr2基因片段通過(guò)兩步重疊延伸pcr連接，得到基因表達(dá)盒fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t和gpm1p-cpr2-cyc1t。

3.甘草次酸生物合成途徑的構(gòu)建

(1)重組同源臂的克隆

以釀酒酵母cen.pk2-1c基因組為模板，設(shè)計(jì)引物5’>gaagtacctcccaactacttttcctcac<3’(如seqidno.16所示)和5’>gccaagtaggcaattatttagtactgtcagtattgttatgatagtttaacggaaacgca<3’(如seqidno.17所示)，擴(kuò)增rdna序列得到左同源臂nts2(如seqidno.18所示)。設(shè)計(jì)引物

5’>ttatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacggcggttgcggccatatctacca<3’(如seqidno.19所示)；和

5’>cgttgcaaagatgggttgaaagag<3’(如seqidno.20所示)擴(kuò)增rdna序列得到右同源臂nts1(如seqidno.21所示)。

(2)抗性篩選標(biāo)記的克隆

以質(zhì)粒prs41h為模板，設(shè)計(jì)引物5’>ttatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacggccagcgacatggaggcccaga<3’(如seqidno.22所示)；和

5’>gacgggaaacggtgctttctggtagatatggccgcaaccgccgtcccaaaaccttctca<3’(如seqidno.23所示)擴(kuò)增獲得潮霉素篩選標(biāo)記tef1p-hphnt1-cyct。

(3)同源臂與基因表達(dá)盒或抗性篩選標(biāo)記的連接

將左同源臂nts2與β-香樹脂醇合酶基因表達(dá)盒fba1p-ggbas-fba1t通過(guò)重疊延伸pcr連接，得到nts2-fba1p-ggbas-fba1t。

將右同源臂nts1與潮霉素篩選標(biāo)記tef1p-hphnt1-cyct通過(guò)重疊延伸pcr連接，得到tef1p-hphnt1-cyct-nts1。

(4)甘草次酸生物合成途徑的組裝

將nts2-fba1p-ggbas-fba1t、pgk1p-cyp88d6-gmp1t、ala1p-cpr1-ala1t、eno2p-cyp72a154-tys1t、gpm1p-cpr2-cyc1t和tef1p-hphnt1-cyct-nts1基因表達(dá)盒利用電擊法轉(zhuǎn)化釀酒酵母cen.pk2-1c，利用釀酒酵母的同源重組能力將甘草次酸合成途徑插入到酵母基因組上。

4.釀酒酵母工程菌的鑒定

將上述電擊轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母cen.pk2-1c涂布在含有潮霉素b抗性篩選平板上，由于重組模塊含有潮霉素b抗性基因，轉(zhuǎn)化成功的工程菌株在潮霉素b抗性平板上生長(zhǎng)。進(jìn)一步利用菌落pcr篩選鑒定陽(yáng)性克隆，獲得釀酒酵母工程菌。

實(shí)施例2

釀酒酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸的驗(yàn)證

挑選實(shí)施例1篩選出的釀酒酵母工程菌，在含有2％的葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母粉的培養(yǎng)基中30℃搖瓶培養(yǎng)，7天后取50ml培養(yǎng)后的釀酒酵母菌液8000rpm離心10min，去掉培養(yǎng)基，用30ml無(wú)菌水清洗，8000rpm離心10min，棄上清，用2ml飽和氯化鈉溶液重懸細(xì)胞。利用細(xì)胞柱打破碎儀打碎細(xì)胞5次5min，向離心管中加入等體積乙酸乙酯，渦旋震蕩3min，充分萃取酵母提取物。8000rpm離心10min，吸取有機(jī)相到雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干乙酸乙酯，加入1ml甲醇充分溶解，過(guò)0.22μm濾膜，將處理完的樣品進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(hplc-ms)檢測(cè)，進(jìn)行釀酒酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸的分析，在釀酒酵母工程菌細(xì)胞提取液離子流圖(如圖2所示)中與甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品一致的離子流圖(如圖1所示)，結(jié)果說(shuō)明成功構(gòu)建生物合成甘草次酸的釀酒酵母工程菌，能夠合成甘草次酸。

實(shí)施例3

釀酒酵母工程菌發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸

挑選實(shí)施例1篩選出的釀酒酵母工程菌單菌落，接種于含有2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母粉的30ml培養(yǎng)基中，30℃、150rpm振蕩培養(yǎng)，36h后的培養(yǎng)液作為種子液。將種子液按照10％的接種量接種至于盛有150ml培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，30℃、170rpm振蕩培養(yǎng)，24h后每隔12h補(bǔ)加葡糖糖濃度至0.5～1.0％，發(fā)酵5天后測(cè)定釀酒酵母細(xì)胞中甘草次酸含量，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母工程菌合成甘草次酸35.5μg/l。

發(fā)酵24h后利用乙醇為碳源每隔12h補(bǔ)料，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)加濃度在0.4～0.6％時(shí)，發(fā)酵5天后測(cè)得細(xì)胞中甘草次酸濃度為48.6μg/l。

sequencelisting

<110>石河子大學(xué)

<120>一種能夠合成甘草次酸的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法

<160>23

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2298

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<223>引物

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