本發(fā)明屬于微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及高產(chǎn)monacolink的紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

紅曲霉(monascuspurpureuswent.)中文別名紅曲、紅糟、紅大米，存在于樹木、土壤和堆積物等。是我國重要的微生物資源，能產(chǎn)生廣泛的具有生物活性的天然產(chǎn)物，具有很高的商業(yè)價(jià)值。紅曲霉生長適應(yīng)的溫度范圍很廣，一般溫度15～42℃，最適溫度為25～30℃，生長最適ph值為3.5～5，可耐濃度高達(dá)10％的乙醇。在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落初為白色，老熟后變成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成紅色。

紅曲的應(yīng)用已有上千年的歷史，其醫(yī)療功效在中國古籍中早有記載，可用于釀酒、制醋、做豆腐乳的著色劑和調(diào)味劑，也可做中藥?，F(xiàn)有研究表明，紅曲具有降血脂、降血壓、抗氧化、抗癌、抗菌、抗疲勞、預(yù)防老年癡呆癥等多重功效。

monacolins是紅曲霉的主要代謝產(chǎn)物之一。研究表明monacolink(又稱lovastain、mevinollin和mewacor)是一種抑制膽固醇合成的藥物，最初由日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章于1979年從紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)。monacolink具有抑制膽固醇合成系統(tǒng)中的限制酶3-羥基-3-甲基戊二酰coa還原酶(hmg-coa)活性，從而降低人體和動(dòng)物血漿中的膽固醇水平，是良好的血脂調(diào)節(jié)物質(zhì)。此外，monacolink還具有抑制腫瘤、預(yù)防和治療動(dòng)脈硬化、冠心病、高血壓、肥胖癥等的作用。

目前，monacolink主要是以紅曲霉通過固態(tài)發(fā)酵或液態(tài)發(fā)酵的方式進(jìn)行生產(chǎn)。菌株產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)的能力是影響微生物發(fā)酵生產(chǎn)功能性物質(zhì)的產(chǎn)量的首要因素。因此，需要不斷的研究篩選出高產(chǎn)目的產(chǎn)物的菌株。基因工程菌是獲得高產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物菌株的一個(gè)重要手段。目前，還沒有采用基因工程的方法獲得高產(chǎn)monacolink的紅曲霉的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高產(chǎn)monacolink的紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，利用本發(fā)明方法，可以增強(qiáng)紅曲霉中monacolink的代謝途徑，進(jìn)而從根本上解決紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物中monacolink產(chǎn)量低的問題。不僅如此，本發(fā)明還意外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明工程菌可以降低桔霉素的含量，達(dá)到改善紅曲產(chǎn)品質(zhì)量、保證紅曲產(chǎn)品的安全性的目的。

為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，因此，本發(fā)明第一方面，提供一種高產(chǎn)monacolink的紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法，通過在紅曲霉菌中過表達(dá)monacolink編碼基因mok基因，獲得高產(chǎn)monacolink的紅曲霉基因工程菌。所述mok基因?yàn)閙okc基因、mokd基因、moke基因、moki基因中的一種。

所述mokc、mokd、moke、moki基因的堿基序列分別如seqidno.1至seqidno.4所示。

進(jìn)一步，所述紅曲霉菌為低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌。

具體的，本發(fā)明高產(chǎn)monacolink的紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)以紅曲霉cdna為模板，用特異引物擴(kuò)增monacolink編碼基因mok基因片段；

(2)構(gòu)建紅曲霉m1的monacolink基因的克隆質(zhì)粒載體pbc-hygro-mok(mokc/mokd/moke/moki)；

(3)將構(gòu)建好的質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入紅曲霉感受態(tài)細(xì)胞中，潮霉素b抗性篩選轉(zhuǎn)基因菌株。

所述步驟(1)特異引物序列上游引物和下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)，引物序列如表1所示的seqidno.5-seqidno.12：

表1.特異性引物表

另一方面，本發(fā)明還提供了所構(gòu)建的高產(chǎn)monacolink的紅曲霉基因工程菌在發(fā)酵獲得高產(chǎn)量、低桔霉素的monacolink的用途。monacolink的產(chǎn)量較出發(fā)菌紅曲霉最高提高2.3倍，而桔霉素含量低于0.25μg/l。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明成功擴(kuò)增到mok的mokc、mokd、moke、moki四個(gè)基因片段。我們在研究中發(fā)現(xiàn)以cdna為模板，設(shè)計(jì)能夠完整擴(kuò)增目的條帶、并且兩端包含合適的酶切位點(diǎn)的特異性引物十分困難。發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)引物設(shè)計(jì)-合成-pcr測序結(jié)果驗(yàn)證，才獲得了本發(fā)明表1所用的4對(duì)特異性引物。

(2)本發(fā)明成功構(gòu)建紅曲霉m1的monacolink基因的克隆載體pbc-hygro-mok。本發(fā)明通過特異性引物的設(shè)計(jì)，可成功酶切pbc-hygro和mokc/mokd/moke/moki片段，然后連接后獲得重組質(zhì)粒，本發(fā)明方法方便、高效。

(3)本發(fā)明采用基于原生質(zhì)體的電擊轉(zhuǎn)化介導(dǎo)紅曲霉m1的monacolink基因過表達(dá)方法，可一次轉(zhuǎn)入大量質(zhì)粒，不會(huì)影響到紅曲霉基因組序列長度和堿基序列。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前熱門的remi轉(zhuǎn)化方法并不適用于本發(fā)明，因?yàn)閞emi轉(zhuǎn)化不能夠?qū)①|(zhì)粒切開后連接于紅曲霉基因的dna上。經(jīng)過大量研究和篩查，最終確定采用本發(fā)明提供的電擊轉(zhuǎn)化的方法和條件。

(4)本發(fā)明所得基因工程菌產(chǎn)monacolink能力強(qiáng)，產(chǎn)monacolink的能力比其出發(fā)菌紅曲霉最高提高2.3倍。

(5)本發(fā)明所得基因工程菌在高產(chǎn)monacolink的同時(shí)，將桔霉素含量降低至0.25μg/l以下，遠(yuǎn)低于國標(biāo)中相關(guān)規(guī)定(液態(tài)樣品中桔霉素的定量限為50μg/l，對(duì)固態(tài)樣品中桔霉素的定量限為1mg/kg)。進(jìn)而保證紅曲產(chǎn)品的安全性，達(dá)到改善紅曲產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

附圖說明

圖1為過表達(dá)質(zhì)粒pbc-hygro-mok的構(gòu)建技術(shù)路線示意圖(以pbc-hygro-mokc為例)。

圖2為紫色紅曲霉m1轉(zhuǎn)錄組rna的瓊脂糖凝膠電泳圖；m：dl2000dnamarker；泳道1-3：紫色紅曲霉m1轉(zhuǎn)錄組rna。

圖3為目標(biāo)基因pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；m：dl2000dnamarker；泳道1-3：mokc基因的pcr產(chǎn)物。

圖4為目標(biāo)基因pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；m：dl2000dnamarker；泳道1-5：mokd基因的pcr產(chǎn)物。

圖5為目標(biāo)基因pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；m：dl2000dnamarker；泳道1-5：moke基因的pcr產(chǎn)物。

圖6為目標(biāo)基因pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；m：dl2000dnamarker；泳道1-5：moki基因的pcr產(chǎn)物。

圖7為重組質(zhì)粒pbc-hygro-mokc酶切驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳圖；m：dl10000dnamarker；泳道1：pbc-hygro-mokc/quickcutsmai+quickcutnoti；泳道2：pbc-hygro/quickcutsmai+quickcutnoti。

圖8為重組質(zhì)粒pbc-hygro-mokd酶切驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳圖；m：dl10000dnamarker；泳道1：pbc-hygro-mokc/quickcutsmai+quickcutnoti；泳道2：pbc-hygro/quickcutsmai+quickcutnoti。

圖9為重組質(zhì)粒pbc-hygro-moke酶切驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳圖；m：dl10000dnamarker；泳道1：pbc-hygro-mokc/quickcutsmai+quickcutnoti；泳道2：pbc-hygro/quickcutsmai+quickcutnoti。

圖10為重組質(zhì)粒pbc-hygro-moki酶切驗(yàn)證的瓊脂糖凝膠電泳圖；m：dl10000dnamarker；泳道1：pbc-hygro-mokc/quickcutsmai+quickcutnoti；泳道2：pbc-hygro/quickcutsmai+quickcutnoti。

圖11為重組質(zhì)粒pcr驗(yàn)證；m：dl2000dnamarker；泳道1：pbc-hygro-mokc；泳道2：pbc-hygro。

圖12為重組質(zhì)粒pcr驗(yàn)證；m：dl2000dnamarker；泳道1：pbc-hygro-mokd；泳道2：pbc-hygro。

圖13為重組質(zhì)粒pcr驗(yàn)證；m：dl2000dnamarker；泳道1：pbc-hygro-moke；泳道2：pbc-hygro。

圖14為重組質(zhì)粒pcr驗(yàn)證；m：dl2000dnamarker；泳道1：pbc-hygro-moki；泳道2：pbc-hygro。

圖15為紫色紅曲霉m1對(duì)潮霉素b的耐受濃度以及電擊條件篩選。

圖16為紫色紅曲霉m1電擊轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒后在不同濃度潮霉素平板上的生長情況。

圖17為導(dǎo)入pbc-hygro質(zhì)粒的紅曲霉轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量分析

圖18為導(dǎo)入pbc-hygro-mokc質(zhì)粒的紅曲霉轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量分析。

圖19為導(dǎo)入pbc-hygro-mokd質(zhì)粒的紅曲霉轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量分析。

圖20為導(dǎo)入pbc-hygro-moke質(zhì)粒的紅曲霉轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量分析。

圖21為導(dǎo)入pbc-hygro-moki質(zhì)粒的紅曲霉轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量分析。

圖22為導(dǎo)入mok基因的紅曲霉轉(zhuǎn)化子及空白質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子與原始出發(fā)菌株的桔霉素產(chǎn)量比較。

圖23為紅曲霉轉(zhuǎn)化菌株潮霉素轉(zhuǎn)錄組的pcr電泳結(jié)果。

m：dl2000dnamarker；泳道1-2：pbc5、pbc6菌株cdna的pcr；泳道3-4：c2、c8菌株cdna的pcr；泳道5-6：d7、d8菌株cdna的pcr。

圖24為潮霉素基因測序結(jié)果比對(duì)(mokc)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體試驗(yàn)方法和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案及其所產(chǎn)生的技術(shù)效果做進(jìn)一步的闡述，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述方法如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。所用試劑如無特殊說明，均可以從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例一、高產(chǎn)monacolink的紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建

1.過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)路線

本發(fā)明高產(chǎn)monacolink的紅曲霉基因工程菌，以pbc-hygro質(zhì)粒為過表達(dá)質(zhì)粒，過表達(dá)mokc或mokd或moke或moki基因獲得。路線是：提取紅曲霉rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，以cdna為模板擴(kuò)增目的片段。將目的片段分別雙酶切連接后，構(gòu)建重組質(zhì)粒，以pbc-hygro-mokc為例，技術(shù)路線如圖1所示。

2.紅曲霉rna的提取

將發(fā)酵培養(yǎng)至第8d的紫色紅曲霉m1菌絲體純化后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組rna的提取，提取方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法。取7μlrna樣品進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果如圖2所示，得到清晰的rna條帶，且28s條帶的亮度是18s的二倍，說明rna提取成功。

3.cdna的反轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒(常規(guī)市售反轉(zhuǎn)錄試劑盒即可，如fermentask1622revertaid^tmfirststrandcdnasynthesiskit反轉(zhuǎn)錄試劑盒)步驟，將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。

4.目的基因的擴(kuò)增

以紫色紅曲霉m1的cdna為模版，用上下游引物來擴(kuò)增mokc/mokd/moke/moki基因。用來擴(kuò)增mokc/mokd/moke/moki基因的特異性引物序列如表1所示。

pcr反應(yīng)體系和pcr反應(yīng)條件如下所示：

表2.擴(kuò)增mok基因的pcr反應(yīng)體系

pcr反應(yīng)條件：

取7μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，電泳結(jié)果如圖3至圖6所示，pcr擴(kuò)增后均得到單一條帶，圖3所示擴(kuò)增條帶長度約1500bp；圖4所示擴(kuò)增條帶長度約0.8kb；圖5所示擴(kuò)增條帶長度約1.0kb；圖6所示擴(kuò)增條帶長度約1.8kb；條帶長度分別與ncbi上公布的mokc/mokd/moke/moki基因片段大小一致，并且測序驗(yàn)證相似度高達(dá)100％，表明目標(biāo)基因擴(kuò)增成功。切膠回收獲得目的片段。

表1.特異性引物表

5.pbc-hygro-mok重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證

分別用內(nèi)切酶酶切pbc-hygro和mokc/mokd/moke/moki片段，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)dh5α，在34μg/ml氯霉素平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，取7μl重組質(zhì)粒與原始質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測，重組質(zhì)粒長度與預(yù)期大小相符。

將大小正確的重組質(zhì)粒用同一組內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，取7μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，如圖7至圖10所示，經(jīng)過雙酶切后分別得到大小在1500bp、0.8kb、1.0kb、1.8kb左右的目的片段帶，與預(yù)期大小相符，初步預(yù)測質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將大小正確的重組質(zhì)粒和原始質(zhì)粒分別用表1的特異性引物進(jìn)行pcr驗(yàn)證，pcr條件同上。結(jié)果如圖11至圖14所示，重組質(zhì)粒中有一條大小正確的擴(kuò)增條帶，原始質(zhì)粒中沒有擴(kuò)增條帶，進(jìn)一步表明本發(fā)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將上述重組質(zhì)粒的pcr產(chǎn)物酶切回收后進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果與ncbi公布的mokc/mokd/moke/moki基因進(jìn)行序列比對(duì)，同源性為100％，充分證明本發(fā)明pbc-hygro-mok重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

其中，酶切體系如下：

37℃酶切90min。

連接體系如下：

16℃條件下孵育過夜。

6.紅曲霉原生質(zhì)體的制備

(1)紅曲霉接種至斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)7d～10d。

(2)用0.9％無菌生理鹽水洗滌斜面并收集孢子，制備成均一濃度的孢子懸液(1×10⁸-1×10⁹個(gè)/ml)。

(3)取200μl均一孢子懸液涂布在已鋪有玻璃紙的pda固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)40-45h。

(4)用涂布棒刮取玻璃紙上的菌絲體并收集到500目尼龍布上，用0.6mmgso4溶液洗1-2次。

(5)取約0.3g菌絲體于100ml三角瓶中，并加入30ml裂解酶液，于30℃，60r/min酶解2.5h，然后用四層擦鏡試紙過濾，濾液于4℃，7000r/min離心10min，棄上清。收集原生質(zhì)體。

7.紅曲霉潮霉素耐受性檢測及電壓條件篩選

將上述步驟6獲得的紫色紅曲霉m1的原生質(zhì)體涂布于含不同濃度梯度的潮霉素b抗性平板上，30℃培養(yǎng)4-5d，抑菌情況如圖15所示。從圖中可以看出，隨著潮霉素b濃度的增長，紫色紅曲霉m1的菌落數(shù)逐漸減少，當(dāng)潮霉素b濃度為10μg/ml時(shí)，紫色紅曲霉m1基本不生長，當(dāng)潮霉素b濃度為10μg/ml時(shí)，加入質(zhì)粒與不加入質(zhì)粒的紫色紅曲霉m1生長情況出現(xiàn)差異。因此，將濃度為10μg/ml潮霉素b確定為m1的最佳抑制濃度。

在現(xiàn)有電擊轉(zhuǎn)化條件的基礎(chǔ)上，對(duì)紅曲霉m1的電擊轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行篩選，如圖15所示，當(dāng)電壓在3.0kv/cm時(shí)，10μg/ml的潮霉素b平板上的單菌落數(shù)量相對(duì)較多，因此，將電壓在3.0kv/cm、潮霉素b濃度為10μg/ml作為實(shí)驗(yàn)電擊轉(zhuǎn)化條件。

8.基于原生質(zhì)體的電擊轉(zhuǎn)化

將上述步驟5構(gòu)建的重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入紅曲霉感受態(tài)細(xì)胞中，生長結(jié)果如圖16所示。將10μg/ml的潮霉素b平板上的單菌落在潮霉素平板上傳代培養(yǎng)5代，獲得基因工程菌。

電擊轉(zhuǎn)化步驟如下：

(1)紅曲霉原生質(zhì)體準(zhǔn)備

將收集的原生質(zhì)體沉淀用1.0mol/l預(yù)冷的山梨醇溶液洗滌2次，然后再將其平均分成2份。一份用預(yù)冷的1.0mol/l山梨醇溶液重懸后，于-80℃保存。另一份則用1.0mol/l山梨醇溶液重懸后置于冰上備用。

(2)基于原生質(zhì)體的電擊轉(zhuǎn)化

①將重懸于預(yù)冷山梨醇溶液中的原生質(zhì)體離心，棄上清，重懸于電擊轉(zhuǎn)化液i中，調(diào)整原生質(zhì)體濃度至5x10⁷個(gè)/ml；

②取70μl電機(jī)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，加入1μg質(zhì)粒；

③將電擊轉(zhuǎn)化杯預(yù)冷，在電壓強(qiáng)度為2.5kv/cm時(shí)進(jìn)行電擊；

④點(diǎn)擊后立即加入900μl預(yù)冷的復(fù)蘇培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入1.5ml無菌離心管中，冰浴10min；

⑤30℃、100r/min培養(yǎng)2h；

⑥取200μl轉(zhuǎn)化液涂布于含0、5、8、10、20μg/ml潮霉素b的再生培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4-5天。

9.基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)

將上述步驟8的基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，條件如下：菌株在pda斜面30℃培養(yǎng)7d～10d，收集孢子并制備成均一的孢子懸液濃度為1×10⁷～1×10⁸個(gè)/ml。10％接種量接種裝有30ml馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶，200r/min，30℃培養(yǎng)2天。以15％的接種量轉(zhuǎn)接裝有70mlyes液體培養(yǎng)基(4％蔗糖，2％酵母浸提物)的500ml搖瓶，28℃靜止培養(yǎng)14天。

10.含不同轉(zhuǎn)化子的基因工程菌的monacolink產(chǎn)量檢測

monacolink的檢測：采用hplc法，色譜柱：inertsilods-3c18(150mm×4.6mm×5μm)，流動(dòng)相：0.1％磷酸：甲醇＝1：3，流速1ml/min，檢測器為紫外檢測器(pda)，檢測波長237nm，檢測溫度30℃，進(jìn)樣量10μl。

空載質(zhì)粒(pbc-hygro)轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量如圖17。取產(chǎn)量處于平均值的pbc5或pbc6作為對(duì)照菌株進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)量比較研究。

導(dǎo)入pbc-hygro-mokc質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量如圖18，與對(duì)照菌株(pbc5或pbc6)相比，c2，c8轉(zhuǎn)化子的monacolink產(chǎn)量增加最為顯著，即c2、c8轉(zhuǎn)化子的monacolink產(chǎn)量分別上調(diào)了2.0、2.3倍。

導(dǎo)入pbc-hygro-mokd質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量如圖19，與對(duì)照菌株(pbc5或pbc6)相比，d7、d8轉(zhuǎn)化子的monacolink產(chǎn)量增加最為顯著，即d7、d8轉(zhuǎn)化子的monacolink產(chǎn)量分別上調(diào)了1.5、2.2倍。

導(dǎo)入pbc-hygro-moke質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量如圖20，與對(duì)照菌株(pbc5或pbc6)相比，e1、e3轉(zhuǎn)化子的monacolink產(chǎn)量增加最為顯著，即e1、e3轉(zhuǎn)化子的monacolink產(chǎn)量分別上調(diào)了0.7、0.9倍。

導(dǎo)入pbc-hygro-moki質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子monacolink產(chǎn)量如圖21，與對(duì)照菌株(pbc5或pbc6)相比，i1轉(zhuǎn)化子的monacolink產(chǎn)量增加最為顯著，即i1轉(zhuǎn)化子的monacolink產(chǎn)量分別上調(diào)了0.1倍。

因此，選取monacolink產(chǎn)量處于平均值的pbc5、pbc6作為候選對(duì)照菌株，選取monacolink產(chǎn)量最高的c2、、c8作為候選mokc基因的過表達(dá)菌株，選取monacolink產(chǎn)量最高的d7、d8作為候選mokd基因的過表達(dá)菌株，選取monacolink產(chǎn)量最高的e1、e3作為候選mokd基因的過表達(dá)菌株，選取monacolink產(chǎn)量最高的i1作為候選moki基因的過表達(dá)菌株，進(jìn)行潮霉素驗(yàn)證。

11.含不同轉(zhuǎn)化子的基因工程菌的桔霉素產(chǎn)量檢測

桔霉素檢測——hplc法：將發(fā)酵液與菌絲體混合研磨，取10ml研碎液，加乙醇定容至30ml，混勻，60℃水浴1h。3000r/min離心15min。用孔徑為0.45μm偏氟微孔濾膜微濾后直接用于hplc分析。檢測條件：熒光檢測波長λex＝331nm，λem＝500nm；流動(dòng)相：v乙氟：v水＝35:65(ph調(diào)2.5)；出峰時(shí)間：12.324min，流速：1.0ml/min，柱溫：28℃。

將導(dǎo)入pbc-hygro-mokc/mokd/moke/moki質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子c8、d8、e3、i1的桔霉素產(chǎn)量與原始出發(fā)菌株m1(來自中國普通微生物菌種保藏管理中心cgmcc3.0568)的桔霉素產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比，以導(dǎo)入pbc-hygro空白質(zhì)粒的pbc5為空白對(duì)照。結(jié)果如表3及圖22所示。

表3.各菌株桔霉素產(chǎn)量

由以上結(jié)果可以看出，導(dǎo)入mok基因的轉(zhuǎn)化子c8、d8、e3、i1中沒有檢測到桔霉素，說明過表達(dá)mokc/mokd/moke/moki基因后，對(duì)桔霉素的編碼基因的表達(dá)起到了一定的抑制作用。

12.轉(zhuǎn)化子的潮霉素pcr驗(yàn)證

提取紅曲霉轉(zhuǎn)化子pbc5，pbc6，c2，c8，d7，d8，e1，e3，i1，i5的rna，反轉(zhuǎn)錄cdna，以cdna為模板，以hph-f和hph-r為引物(序列如表4)，pcr潮霉素基因，pcr結(jié)果如圖23。從圖中看出，可以準(zhǔn)確擴(kuò)增出1000bp左右條帶，初步證明過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。將潮霉素片段切膠回收后，進(jìn)行測序分析，與原質(zhì)粒中潮霉素片段進(jìn)行對(duì)比分析，相似度高達(dá)99％(圖24，以mokc為例)，證明過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

表4.潮霉素引物

sequencelisting

<110>北京工商大學(xué)

<120>高產(chǎn)monacolink的紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

<130>

<160>14

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1575

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<213>monascuspurpureuswent.

<400>1

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<213>人工序列

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<400>14

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