本發(fā)明涉及一株光合細(xì)菌莢膜紅細(xì)菌及其在甲醛和苯系物凈化中的應(yīng)用，屬于污水處理領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

苯系物是環(huán)境中常見的污染物，有致癌、致畸、致突變毒性，國家有關(guān)飲用水的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)均將其列為監(jiān)測項(xiàng)目。長期接觸苯即可能慢性中毒，導(dǎo)致再生障礙性貧血以及白血病。其主要污染來源于裝潢材料及油漆等行業(yè)排放的廢氣，作為消毒劑應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、水產(chǎn)行業(yè)產(chǎn)生的廢水等。甲醛(hcho)，又名“蟻醛”，在常溫下甲醛是一種無色易溶且具有高生物活性和潛在致癌性的微刺激性氣體，其對人體的危害具有長期性、潛伏性和隱蔽性的特點(diǎn)。甲醛對人體的傷害，主要是對皮膚、眼睛、粘膜的刺激，進(jìn)而產(chǎn)生皮炎、眼痛、流淚等癥狀。甲醛還能損傷人體細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)，其中最敏感的就是對嗅覺的刺激。長期慢性吸入濃度為0.45mg/m³的甲醛可增加慢性呼吸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)；吸入高濃度甲醛（>60mg/m³）可導(dǎo)致喉嚨和肺水腫、肺炎、支氣管痙攣、喘息、泡沫痰甚至呼吸循環(huán)衰竭致死。國際癌癥研究中心(iarc)在2004年的“致癌公報(bào)”上，公布了甲醛能引起鼻腔癌和鼻竇癌，并將甲醛列為致癌物。甲醛污染的來源主要包括：木材工業(yè)、織布產(chǎn)業(yè)、農(nóng)藥、防腐技術(shù)與消毒劑中大量應(yīng)用的甲醛，其中殘留的和未反應(yīng)的會逐漸釋放到周圍環(huán)境，煤、石油、液化氣和煤氣等燃料燃燒時(shí)也會產(chǎn)生醛類污染物。目前，凈化苯系物和甲醛的方法主要有化學(xué)反應(yīng)方法、物理吸附技術(shù)、植物凈化等，但是這些方法存在成本高，處理時(shí)間長等缺點(diǎn)。相比之下，微生物對污染物有較強(qiáng)的降解能力、成本低，效果好，而且無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，利用微生物治理污染物已成為了目前重點(diǎn)研究的方向。光合細(xì)菌（photosyntheticbacteria，簡稱psb）是一類以光作為能源、能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中的有機(jī)物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進(jìn)行光合作用的微生物的總稱。光合細(xì)菌廣泛分布于自然界的土壤、水田、沼澤、湖泊、江海等處，主要分布于水生環(huán)境中光線能透射到的缺氧區(qū)。相比真菌來說，光合細(xì)菌可在惡劣條件下處理有機(jī)物，并且其生命力強(qiáng)，營養(yǎng)要求低，容易培養(yǎng)，生長繁殖速度快，本身無毒，富含蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素、維他命，在分解有機(jī)物的同時(shí)并不會對環(huán)境造成二次污染等特點(diǎn)，為微生物治理苯系物污染方面提供了廣泛的應(yīng)用前景。

目前國內(nèi)外關(guān)于能降解苯系物和甲醛的光合細(xì)菌報(bào)道很少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供了一株從昆明滇池濕地公園入口處污水中分離篩選得到的莢膜紅細(xì)菌（rhodobactercapsulatusstrain）dc-1，其于2016年11月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢，武漢大學(xué)；保藏編號為cctccno：m2016676。

本發(fā)明另一目的是將上述菌種應(yīng)用在處理苯系物污染水體中。

本發(fā)明另一目的是將上述菌種應(yīng)用在處理甲醛污染水體中。

本發(fā)明中莢膜紅細(xì)菌dc-1具有以下微生物學(xué)特性：

1、本發(fā)明莢膜紅細(xì)菌dc-1最適生長的培養(yǎng)基組分為ch3ch2coona5g/l、(nh4)2so42.0g/l、mgso4?7h2o0.2g/l、nah2po4?h2o0.5g/l、k2hpo40.66g/l、cacl2?2h2o0.1g/l。

2、形態(tài)學(xué)特征

本發(fā)明菌株dc-1的菌落呈暗紅色、有光澤、透明，菌落呈圓形且較大；菌株的菌體細(xì)胞呈彎曲的桿狀，且為革蘭氏陰性菌，菌體大小為（0.7～0.9）μm×（1.5～2.0）μm；

3、生理生化特征

菌株dc-1最適溫度為30℃，最適ph值為7～8，最適接種量為20%～25%，且在厭氧條件下更適合菌株dc-1的生長；菌株dc-1的生理生化特征如下（見表1）；

表1本發(fā)明菌株的生理生化特征

注：“+”代表陽性，“-”代表陰性。

4、本發(fā)明菌種在200-800nm波長范圍內(nèi)有4個(gè)特征吸收峰，分別位于375、475、509、590nm處；說明該菌種中含有細(xì)菌葉綠素a和類胡蘿卜素。

5、本發(fā)明中所述菌株dc-1能夠利用乙醇、甘油、葡萄糖、乙酸鈉、丙酸鈉、硫代硫酸鈉等為碳源來進(jìn)行生長繁殖；能夠利用蛋白胨、酵母膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、碳酸氫銨、硝酸鈉等為氮源來進(jìn)行生長繁殖，菌株dc-1可利用碳源和氮源范圍廣。

6、本發(fā)明中所述菌株dc-1，其16srdna序列具有seqidno：1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果：

通過對該菌株的生理活性進(jìn)行研究，用分子生物學(xué)方法確定它的分類地位；證明本發(fā)明提供的莢膜紅細(xì)菌具有以下優(yōu)點(diǎn)：生長速度快、生長力強(qiáng)、可利用碳源和氮源范圍廣等優(yōu)點(diǎn)；并且該菌株對苯和甲醛的耐受濃度及去除效果較好，能將4mm/l的苯和2mm/l的甲醛全部降解；可用于處理苯系物和甲醛污染的污水，且此菌株培養(yǎng)條件簡單，易于工業(yè)產(chǎn)業(yè)化實(shí)施。

附圖說明

圖1為本發(fā)明菌株形態(tài)學(xué)示意圖；

圖2為本發(fā)明菌株dc-1的顯微示意圖；

圖3為菌株dc-1吸收光譜；

圖4為不同碳源對菌株dc-1生長的影響；

圖5為不同氮源對菌株dc-1生長的影響；

圖6為溫度對菌株dc-1生長的影響；

圖7為ph值對菌株dc-1生長的影響；

圖8為接種量對菌株dc-1生長的影響；

圖9為氧氣對菌株dc-1生長的影響；

圖10為不同苯濃度下菌株dc-1的生長情況；

圖11為不同苯濃度下菌株dc-1凈化苯的能力；

圖12為不同甲醛濃度下菌株dc-1的生長情況；

圖13為不同甲醛濃度下菌株dc-1凈化甲醛的能力。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。實(shí)施例中方法如無特殊說明，按常規(guī)操作進(jìn)行，如無特殊說明使用試劑均為常規(guī)購試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。

實(shí)施例1：莢膜紅細(xì)菌dc-1的分離、純化和鑒定

1、將從昆明滇池濕地公園入口處采集到污水除雜后，倒入裝有500ml富集培養(yǎng)液（配方nacl2.5g、mgso4·7h2o0.05g、nh4cl1.0g、nahco32.5g、kh2po42.75g、ch3coona6g、酵母粉2g，蒸餾水1000ml，ph值為7.0）的礦泉水瓶中，混合均勻，封口；最后置于28℃，60w白熾燈下光照培養(yǎng)7-8天；待培養(yǎng)液變成紅色或者血紅色，吸出50ml紅色液體，倒入裝有新鮮富集培養(yǎng)液的礦泉水瓶中，連續(xù)富集培養(yǎng)3次；用rcvbn培養(yǎng)液（配方為ch3coona5.0g、ch3ch2coona3.0g、nacl2.5g、mgso4·7h2o1.5g、(nh4)2so40.5g、kh2po41.5g、k2hpo40.6g、cacl20.05g、mnso45mg、feso45mg、酵母膏0.5g、蛋白胨20mg、谷氨酸0.5mg、h2o1000ml、ph7.0）對富集液中的光合細(xì)菌進(jìn)行篩選分離；用1ml移液管取不同稀釋度的樣品菌液(10^-5、10^-6、10^-7、10^-8cfu/ml)加到滅菌的試管中，后加入15ml滅菌的45℃光合細(xì)菌分離培養(yǎng)基(配方為乙酸鈉3.0g、酵母膏3.0g、氯化鈣0.3g、硫酸鎂0.5g、調(diào)節(jié)ph值至7.4；其中底層培養(yǎng)基：瓊脂0.8%；上層培養(yǎng)基：瓊脂1%)，混合均勻后，倒入平皿；待培養(yǎng)基冷凝后，上層加5ml分離培養(yǎng)基，冷卻后置于28℃、60w的白熾燈照射下培養(yǎng)7天，如果菌落不明顯，則繼續(xù)培養(yǎng)；挑取紅色不同形態(tài)菌落，采用雙層平板法，用純化培養(yǎng)基反復(fù)劃線純化2-3次，將獲得了純凈單菌落（見圖1）。圖為菌株dc-1雙層平層法照片，由圖可以看出菌株dc-1的菌落，呈暗紅色、有光澤、透明，菌落呈圓形且較大。

2、用滅菌的牙簽挑取平板上的純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)入裝有rcvbn培養(yǎng)液的25ml厭氧管中，混合均勻，裝滿密封，置于28℃，60w白熾燈下光照培養(yǎng)7-8天；待培養(yǎng)液變成血紅色。

3、對平板上純化的單菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，取菌體涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)（見圖2）；圖2為菌株dc-1的顯微觀察，由圖可以看出菌株dc-1的菌體細(xì)胞呈彎曲的桿狀，且為革蘭氏陰性菌，菌體大小為（0.7～0.9）μm×（1.5～2.0）μm。

4、生理生化特征

菌株dc-1的生理生化參照常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊方法進(jìn)行，結(jié)果見下表：

注：“+”代表陽性，“-”代表陰性。

5、光合細(xì)菌吸光度的測定

將光合細(xì)菌種子液接種于含有rcvbn培養(yǎng)液的厭氧管中，培養(yǎng)至液體顏色變紅。無菌條件下用移液管取2ml培養(yǎng)液至離心管中，8000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘，用生理鹽水將活細(xì)胞離心洗滌3次后，重新懸浮于60%（600g/l）的蔗糖溶液中。用60%的蔗糖溶液作空白對照，在波長200-800nm范圍內(nèi)測定該細(xì)菌的吸光度值，繪制吸光度曲線。圖3為菌株dc-1吸收光譜，由圖可以看出菌株dc-1在200-800nm波長范圍內(nèi)有4個(gè)特征吸收峰，分別位于375、475、509、590nm處。在475nm和509nm處有一個(gè)特殊吸收雙峰，說明活細(xì)胞中存在類胡蘿卜素；在375nm和590nm處都有吸收峰，說明活細(xì)胞中存在細(xì)菌葉綠素a。光合細(xì)菌的吸收光譜主要受類胡蘿卜素和細(xì)菌葉綠素a成分的影響；通過光合細(xì)菌吸光度的測定來確定該菌株的最大吸收峰值。

6、碳源和氮源的利用情況

6.1碳源利用試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：(nh4)2so42.0g、mgso4?7h2o0.2g、nah2po4?h2o0.5g、k2hpo40.5g、cacl2?2h2o0.1g、蒸餾水1000ml、調(diào)節(jié)ph值至7.0。

分別加入碳源：乙醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、丙酸鈉、硫代硫酸鈉、碳酸氫鈉、l-蘋果酸、l-谷氨酸，其中糖醇類添加量為0.5%，其他碳源添加量為0.2%；利用25ml的厭氧管，接種量為20%、ph為7、溫度為28℃，60w白熾燈下培養(yǎng)7d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在375nm下測定菌液的吸光度值；圖4為不同碳源對菌株dc-1生長的影響，由圖可以看出菌株dc-1較適宜的碳源為丙酸鈉。

6.2氮源利用試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：kh2po41.36g、cacl2?2h2o0.5g、na2hpo42.13g、葡萄糖10g、mgso4?7h2o0.2g、feso4?7h2o0.05g蒸餾水1000ml、ph值調(diào)節(jié)至7.0；分別加入氮源（濃度為0.1%）蛋白胨、酵母膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、碳酸氫銨、硝酸鈉。

利用25ml的厭氧管，接種量為20%、ph為7、溫度為28℃，60w白熾燈下培養(yǎng)7d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在375nm下測定菌液的吸光度值；圖5為不同氮源對菌株dc-1生長的影響，由圖可以看出菌株dc-1較適宜的氮源為硫酸銨。

7、莢膜紅細(xì)菌dc-1的分子鑒定

pcr引物由昆明碩擎生物科技有限公司提供，其中上游引物27f:5-agagtttgatcctggctcag-3；下游引物1492r：5-ggttaccttgttacgactt-3；

擴(kuò)增體系(47μl):27f1μl、1492r1μl，金牌mix45μl，加入光合細(xì)菌單菌落量（直接用牙簽挑取細(xì)菌菌落）。

擴(kuò)增條件：98℃2min；（98℃10s，58℃15s，72℃，30s）30個(gè)循環(huán)；72℃5min；

16srdnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，將pcr產(chǎn)物交由昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測序，將所測得的16srdna序列在genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對，比對結(jié)果顯示和rhodobactercapsulatussb1003nc014034.1的相似性為99%，確定該菌種為莢膜紅細(xì)菌，命名為rhodobactercapsulatusdc-1。

實(shí)施例2：光合細(xì)菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1、溫度的確定在25ml的厭氧管中接入20%的種子液，用液體培養(yǎng)基（配方為ch3ch2coona5g/l、(nh4)2so42.0g/l、mgso4?7h2o0.2g/l、nah2po4?h2o0.5g/l、k2hpo40.66g/l、cacl2?2h2o0.1g/l。）裝滿厭氧管，在ph為7的條件下，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為20、25、30、35℃；光照培養(yǎng)7d,實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每隔24h測定菌體培養(yǎng)液在375nm下的od值，來確定最佳培養(yǎng)溫度。圖6為溫度對菌株dc-1生長的影響，由圖6可以看出菌株dc-1最佳培養(yǎng)溫度為30℃。

2、ph的確定在25ml的厭氧管中接入20%的種子液，用液體培養(yǎng)基（配方為ch3ch2coona5g/l、(nh4)2so42.0g/l、mgso4?7h2o0.2g/l、nah2po4?h2o0.5g/l、k2hpo40.66g/l、cacl2?2h2o0.1g/l。）裝滿厭氧管，在溫度為30℃的條件下，將培養(yǎng)ph值分別設(shè)定為5、6、7、8、9。光照培養(yǎng)7d,實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每隔24h測定菌體培養(yǎng)液在375nm下的od值，來確定最佳培養(yǎng)ph。圖7為ph值對菌株dc-1生長的影響，由圖7可以看出菌株dc-1最佳培養(yǎng)ph7～8。

3、接種量的確定在溫度為30℃、ph值為7的條件下，分別在25ml的厭氧管中接入體積為10%、15%、20%、25%、30%種子液，用液體培養(yǎng)基（配方為ch3ch2coona5g/l、(nh4)2so42.0g/l、mgso4?7h2o0.2g/l、nah2po4?h2o0.5g/l、k2hpo40.66g/l、cacl2?2h2o0.1g/l。）裝滿厭氧管，光照培養(yǎng)7d實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每隔24h測定菌體培養(yǎng)液在375nm下的od值，來確定菌種最佳接種。圖8為ph值對菌株dc-1生長的影響，由圖可以看出菌株dc-1最佳接種量為20%～25%。

4、氧氣對光合細(xì)菌生長情況的影響

a組：在25ml的厭氧管中裝1/3容量的接種液體培養(yǎng)基，在厭氧管外罩有黑色塑料袋，搖床振蕩培養(yǎng)（120r/min）；b組：在25ml的厭氧管中裝1/2容量的接種液體培養(yǎng)基；c組：在25ml的厭氧管中接種的液體培養(yǎng)基，密封，靜置培養(yǎng)，5d后取樣，在375nm下測定培養(yǎng)物的od值，來確定菌種需氧條件。圖9為氧氣對菌株dc-1生長的影響，由圖可以看出菌株dc-1在厭氧條件下生長較好。

實(shí)施例3：菌株dc-1凈化苯系物的能力

菌株dc-1濃度為20%的液體培養(yǎng)物分別接種于含有2mm、4mm、6mm苯的液體培養(yǎng)基中，30℃，60w白熾燈下光照培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7、8d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別測定其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)菌株dc-1的菌體濃度及剩余液體苯濃度；苯含量測定的具體步驟如下：

1、甲醛-硫酸溶液的配制：在100ml優(yōu)級濃硫酸中加0.10ml10%甲醛溶液混合，冰冷保存(用時(shí)制備)；

（在硫酸存在下，苯系物與甲醛反應(yīng)生成黃棕色二苯基甲烷聚合體，該有色化合物的最大吸收波長為465nm，用1cm比色皿，以純水為參比，測其吸光值。）

2、苯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：在50ml容量瓶中加25ml乙醇，準(zhǔn)確稱重之后，加入約0.5ml新蒸餾過的苯，再準(zhǔn)確稱重，兩次重量之差即為苯的重量，用純水稀釋至刻度，計(jì)算其濃度。使用時(shí)用純水配成100、200、300、500、1000μg／ml的苯標(biāo)準(zhǔn)溶液；

3、5ml的反應(yīng)體系包括甲醛-硫酸溶液4.9ml，苯標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10ml，反應(yīng)體系混勻后，在水中放置5min，在波長465nm處，用1cm比色皿，以純水為參比，測定其吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算苯的濃度；計(jì)算苯的濃度。

圖10為不同苯濃度下菌株dc-1的生長情況，由圖可以看出菌株dc-1在苯濃度為2-4mm/l時(shí)，菌體濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加；當(dāng)苯濃度為6mm/l時(shí)，菌體濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而減少，所以菌株dc-1對苯的耐受濃度為6mm/l。

圖11不同苯濃度下菌株dc-1凈化苯的能力,由圖可以看出菌株dc-1,6d可將2mm/l的苯全部降解，8d可將4mm/l的苯全部降解。菌株dc-1對苯的降解作用比較強(qiáng)。

實(shí)施例4：菌株dc-1凈化甲醛的能力

菌株dc-1濃度為20%的液體培養(yǎng)物分別接種于含有2mm、4mm、6mm甲醛的液體培養(yǎng)基中，30℃，60w白熾燈下光照培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7、8d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別測定其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)剩余液體甲醛濃度。液體甲醛濃度的測定方法：按照宋中邦等人文獻(xiàn)中所報(bào)道的方法來測定。

圖12為不同甲醛濃度下菌株dc-1的生長情況，由圖可以看出菌株dc-1在苯濃度為2～4mm/l時(shí)，菌體濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加；當(dāng)苯濃度為6mm/l時(shí)，菌體濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而減少，所以菌株dc-1對苯的耐受濃度為6mm/l。

圖13不同甲醛濃度下菌株dc-1凈化甲醛的能力,由圖可以看出菌株dc-1,8d可將2mm/l的甲醛全部降解；菌株dc-1對甲醛具有一定的降解作用。

序列表

<110>昆明理工大學(xué)

<120>一株莢膜紅細(xì)菌及其應(yīng)用

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1305

<212>dna

<213>莢膜紅細(xì)菌dc-1

<400>1

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