專利名稱：一株莢膜紅細菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株莢膜紅細菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硒是瑞典化學(xué)家Berzelius于1817年在生產(chǎn)硫酸的尾礦中發(fā)現(xiàn)的，當時被認為是一種有毒元素。1957年，Schwarz等首次證明硒是動物的必需營養(yǎng)元素，人們才對硒的營養(yǎng)保健作用有所認識。1973年，Rotmck等發(fā)現(xiàn)和證實硒是動物和人體谷胱甘肽過氧化物酶的組成成分以后，硒的重要性受到了空前的重視。1973年，世界衛(wèi)生組織宣布硒是人體必需的生命元素。近年來的醫(yī)學(xué)研究表明，硒缺乏會導(dǎo)致40多種疾病的發(fā)生，尤其會導(dǎo)致以下疾病(I)克山病、大骨節(jié)?。?2)各種癌癥；(3)男性不育癥和婦女妊娠性高血壓；(4)輻射損傷與衰老；(5)免疫功能低下與艾滋??；(6)重金屬毒性與職業(yè)?。?7)心血管??；(8)流行性出血熱。補充一定量的硒能夠很好地預(yù)防上述疾病的發(fā)生，保證人體健康。硒在地球上分布不均衡，已知有40多個國家和地區(qū)缺硒。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國約72%的地區(qū)處于缺硒、低硒帶。膳食中硒攝入量的不足嚴重影響著我國幾億人口的身體健康，根據(jù)中國營養(yǎng)學(xué)會調(diào)查報告，我國成人每日的硒攝入量僅為26. 63 μ g，距中國營養(yǎng)學(xué)會和國際硒學(xué)會推薦的日攝入量50 μ g和60 μ g相差甚遠。人體主要是通過膳食攝入硒，從不同形態(tài)硒源對人體的補硒作用來看，無機硒有一定毒性，吸收率又低，而通過生物轉(zhuǎn)化作用將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，可降低無機硒的毒性，提高硒的生理活性與吸收率。因此，目前都把有機硒補硒視為最安全最有效的手段。有機硒源中的植物硒源比動物性硒源要好。在植物性硒源中，富硒茶是一種理想的補硒源之一。茶樹是一種天然富硒植物，產(chǎn)于富硒區(qū)的茶葉即為富硒茶，即使是種在低硒土壤上的茶樹也可以通過人工增硒方法生產(chǎn)富硒茶。茶葉中的硒80%是對人體有益的有機硒。茶葉是世界三大保健飲料之一，我國人民有著長久的飲茶習(xí)慣，因此開發(fā)富硒茶對人體健康有著重要的意義。隨著人們保健意識的增強，人們對富硒茶的需求將會不斷增加。我國是低硒國家，天然富硒茶的產(chǎn)地比較少，所以通過人工增硒途徑增加茶葉中的硒含量有一定意義。茶葉增硒途徑有很多種。天然的富硒茶園中，因為土壤含硒量高，茶葉當中的含硒量自然就高。但含硒量高的土壤畢竟分配范圍有限，很難滿足廣大的市場需求，需要采用人工增硒。人工增硒主要有兩種途徑一是土壤施硒肥，二是進行茶葉的葉面噴灑。茶園土壤增施硒肥后，大量的硒并不能很好的被茶樹吸收，茶葉中的硒含量增加緩慢，增幅很小。葉面噴施硒肥后，可迅速提高茶葉中的硒含量，茶葉硒含量與噴施硒肥的量成正比，葉面噴硒尤應(yīng)注意選擇適宜噴硒濃度和合理的采摘時間，處于探索階段，仍然不能保證茶葉對硒元素的利用率。光合細菌(Photosynthetic Bacteria,縮寫PSB)是水域微生物中的一種,是地球上最早出現(xiàn)的具有原始光能合成系統(tǒng)的原核生物，它廣泛分布在各類水體的厭氧層中。現(xiàn)已知光合細菌存在著色桿菌科、外硫紅螺菌科、紫色非硫細菌、綠色硫細菌、多細胞絲狀綠細菌、螺旋桿菌科、含細菌葉綠素的專性好氧菌等7大群共約50個屬。光合細菌作為自然界中重要的微生物類群，廣泛存在于自然界的水田、湖泊、江河、海洋、活性污泥及土壤中，生命力極強、營養(yǎng)要求低、生長繁殖快、無毒害性等特點
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株莢膜紅細菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus) AYGHJ-16，簡稱莢膜紅細菌AYGHJ-16，已于2011年11月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC ;地址中國武漢，武漢大學(xué)；郵編430072)，保藏編號為CCTCC NO M 2011377。所述莢膜紅細菌AYGHJ-16可用于制備發(fā)酵液(富硒菌劑)。本發(fā)明還保護一種制備發(fā)酵液(富硒菌劑)的方法，是發(fā)酵所述莢膜紅細菌AYGHJ-16，得到發(fā)酵液。所述發(fā)酵的條件具體可為30°C，二氧化碳通氣流速為4L/min，光照強度為1000_3000Lux。所述發(fā)酵采用的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法具體如下取120mg亞硒酸鈉、40g葡萄糖、7. 5g 蛋白胨、9g 尿素、5g 酵母浸汁、O. 4g NaHC03、lg NH4CUO. 2g K2HPO4,2. OCH3COONa,
O.2g MgSO4 ·7Η20、2. Og NaCl和IOmL微量元素溶液，用水溶解并定容至IOOOmL ;所述微量元素溶液的制備方法如下取 O. 5g H3BO3>400mg MnSO4、60mgZnS04 · 7H20、180mg NaMoO4 · 2H20和IOmg Ca(NO3)2 · 2H20，用水溶解并定容至250mL。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH具體可為6. 7-7. 2。以上任意所述方法制備得到的發(fā)酵液(富硒菌劑)也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述發(fā)酵液的使用方法，是將所述發(fā)酵液進行30-50倍稀釋后噴灑于茶樹葉面。所述發(fā)酵液可用于生產(chǎn)茶葉。所述發(fā)酵液可用于培養(yǎng)茶樹。本發(fā)明還保護一種生產(chǎn)茶葉的方法，包括將所述發(fā)酵液進行30-50倍稀釋后噴灑于茶樹葉面的步驟。所述茶樹具體可為金觀音茶樹。本發(fā)明還保護一種培養(yǎng)茶樹的方法，包括將所述發(fā)酵液進行30-50倍稀釋后噴灑于茶樹葉面的步驟。采用本發(fā)明的方法培養(yǎng)茶樹，可以使茶葉的硒含量顯著增加。所述茶樹具體可為金觀音茶樹。本發(fā)明提供的莢膜紅細菌AYGHJ-16，屬于光合細菌，能利用光能，將一些有機小分子(如有機酸、氨基酸等)轉(zhuǎn)化為生長刺激物和抗病毒物質(zhì)，刺激植物生長，提高植物的抗病免疫力。并且，光合細菌可以利用土壤中異氧微生物代謝所產(chǎn)生的有機酸，解除異氧微生物的產(chǎn)物反饋抑制，使其大量繁殖，促進了土壤中一些無機物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和吸收，再加上光合細菌本身能進行強烈的固氮和固碳作用，可以為植物提供更多的無機物。本發(fā)明提供的富硒菌劑可以改善土壤微生態(tài)環(huán)境，從而提高植物的抗病能力以及對于各種礦物元素和稀有元素(比如硒)的內(nèi)吸化，達到提高植物體富硒的要求。本發(fā)明提供的富砸菌劑可以進一步提聞茶樹的砸利用率，提聞茶葉的富砸效率，大規(guī)模生產(chǎn)生態(tài)富硒茶，滿足人們的依量飲茶補硒保健服務(wù)的目的。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。金觀音茶樹福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院茶葉研究所。實施例I、菌株AYGHJ-16的獲得和保藏一、菌株 AYGHJ-16S 的獲得利用富集和選擇鑒別培養(yǎng)技術(shù)，從福州西湖底泥土壤中分離能耐受高濃度亞硒酸鈉、并能轉(zhuǎn)化無機硒為有機硒的光合細菌。得到一株菌株，命名為菌株AYGHJ-16S。菌株AYGHJ-16S 的富硒量為 150ug/ml。二、菌株 AYGHJ-16S 的鑒定I、形態(tài)特征革蘭氏陰性菌；菌體呈短桿或卵型，大小約為(O. 6-1. 2) μ m-(2. 0-2. 2) μ m ；菌落在光照條件下呈光滑、圓潤、突起；菌落在光照條件下為紅色，在黑暗條件下為無色。2、分子特征16S rDNA的測序結(jié)果如序列表的序列I所示，與GENBANK ACCESSION NO. NR043407的莢膜紅細菌的序列相似性為98%。綜合形態(tài)特征和分子特征，參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》(第9版)和東秀珠等編著的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(第I版)，菌株AYGHJ-16S屬于莢膜紅細菌屬(Rhodobactercapsulatus)。三、菌株AYGHJ-16的獲得以菌株AYGHJ-16S為出發(fā)菌，通過常規(guī)的原生質(zhì)體育種和DNA shuffling技術(shù)進一步選育富硒的高產(chǎn)菌種，得到菌株AYGHJ-16。菌株AYGHJ-16的富硒量為300ug/ml。四、菌株AYGHJ-16的鑒定保藏莢膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus) AYGHJ-16,簡稱莢膜紅細菌 AYGHJ-16,已于2011年11月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC ;地址中國武漢，武漢大學(xué)；郵編:430072)，保藏編號為CCTCC NO M 2011377。實施例2、莢膜紅細菌AYGHJ-16的發(fā)酵成分及工藝條件的優(yōu)化通過單因素及正交試驗，確定如下培養(yǎng)基組成參數(shù)葡萄糖為培養(yǎng)基中的最佳碳源，添加4-5%時可得到最高生物量與硒含量；蛋白胨和尿素為培養(yǎng)基中的復(fù)合氮源，添加量分別為蛋白胨0.5%，尿素0.9% ；酵母膏為培養(yǎng)基中的輔助氮源，添加量為0. 4% ；亞硒酸鈉為培養(yǎng)基中的無機硒源選擇，添加量為120ug/mL。通過均勻設(shè)計的搖瓶發(fā)酵實驗，確定如下培養(yǎng)條件參數(shù)
采用250mL搖瓶，裝液量120mL，培養(yǎng)溫度28°C，pH5_6，培養(yǎng)時間5d。采用上述優(yōu)選參數(shù)，莢膜紅細菌AYGHJ-16的生物量達到37. 4g/L，菌體富集總硒含量達到36. 4mg/L。實施例3、富硒菌劑的的制備
一、富硒菌劑的的制備發(fā)酵培養(yǎng)基(ρΗ7· O)的制備方法取120mg亞硒酸鈉、40g葡萄糖、7. 5g蛋白胨、9g尿素、5g酵母浸汁、O. 4g NaHCO3Ug NH4CUO. 2g K2HPO4,2. OCH3COONa^O. 2gMgS04 ·7Η20、2· OgNaCl和IOmL微量元素溶液，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。發(fā)酵培養(yǎng)基的無機硒濃度為120mg/L。實際應(yīng)用中，發(fā)酵培養(yǎng)基采用6. 7-7. 2的pH均可。將發(fā)酵培養(yǎng)基在115 °C下滅菌20min。
微量元素溶液的制備方法取O. 5g H3BO3>400mg MnS04、60mg ZnSO4 · 7H20、180mgNaMo04 · 2H20 和 IOmg Ca (NO3) 2 · 2H20，用蒸餾水溶解并定容至 250mL。采用200L發(fā)酵罐，并對發(fā)酵罐進行如下改造(I)在發(fā)酵罐底部安裝發(fā)紅光的水下燈(燈光主要提供光合細菌的生長必須的光源作為能源)；(2)在發(fā)酵罐下部安裝電熱恒溫控制棒；(3)在發(fā)酵罐底部設(shè)置兩個外接開口，一個作為供給發(fā)酵罐二氧化碳的通氣口，另一個作為加入發(fā)酵培養(yǎng)基和菌種的開口。在發(fā)酵罐中加入160L發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接種莢膜紅細菌AYGHJ-16 ;發(fā)酵條件溫度控制在30°C，二氧化碳通氣流速為4L/min，光照強度為1500Lux (1000-3000Lux均可)；當發(fā)酵罐中的菌濃度達到5. 35X 108cfu/mL時，升溫至55°C處理45min (促使細胞破碎)，室溫離心(5000g、15min)，收集上清液，即為富硒菌劑，4°C保藏。二、富硒能力的測定將4°C保藏3d后的富硒菌劑稀釋10倍，吸取3mL并用水定容至10mL，作為待測溶液。采用亞甲藍還原法檢測待測溶液的褪色時間。亞甲藍還原法檢測原理在酸性條件下，亞硒酸根可與DAB作用，生成黃色絡(luò)合物(Se-DAB)，在一定pH時，使用有機溶劑萃取，根據(jù)有機層顯色的程度，可進行分光光度法測定，根據(jù)無機硒含量標準曲線計算出無機硒的含量；有機硒不能與DAB絡(luò)合，不能生成Se-DAB。亞硒酸鈉購自上海時代生物科技有限公司。具體方法如下(依次進行以下操作)(I)取5支125ml的分液漏斗，分別加入2. 0,4. 0,6. 0,8. 0,10. Oml的亞硒酸鈉水溶液(lmg/L)，然后均加蒸餾水至40ml ；(2)每支漏斗加入2ml O. 2mol/L的EDTA_2Na水溶液以掩蓋干擾離子，用甲酸調(diào)節(jié)pH 至 2-3 ；(3)每支漏斗加入4ml 5g/L的DAB水溶液，搖勻，黑暗條件下60°C反應(yīng)20min ；(4)用濃NaOH調(diào)節(jié)pH至7. O,然后每支漏斗加入4ml甲苯,充分搖勻,靜置3_4min分層；(5)將有機層通過脫脂棉濾到Icm的比色皿中，于420nm處測定溶液的吸光度(甲苯作為空白對照)。以吸光值A(chǔ)為橫坐標，以硒濃度Y(單位為mg/L)為縱坐標繪制標準曲線。標準曲線函數(shù)如下Y = I. 8674Χ+0. 0009 (R2 = O. 9995)。用步驟一制備的富硒菌劑代替亞硒酸鈉水溶液進行以上步驟(I)至(5)的實驗，將吸光值代入標準曲線，得到的結(jié)果即為富硒菌劑中的無機硒濃度。富硒菌劑中的有機硒濃度=發(fā)酵培養(yǎng)基的無機硒濃度-富硒菌劑中的無機硒濃度。
富硒能力(有機硒轉(zhuǎn)化率)=(富硒菌劑中的有機硒濃度/發(fā)酵培養(yǎng)基的無機硒濃度)X 100%。富硒菌劑中的有機硒濃度為116. 4mg/L,富硒能力為98. 9%。三、富硒菌劑使用液的制備將富硒菌劑用水稀釋至50倍體積，即為富硒菌劑使用液。實施例4、小區(qū)茶園的 茶葉的富硒試驗實驗時間為夏季。采用田間隨機區(qū)組排列設(shè)計實驗，共設(shè)置三組實驗，每組采用3塊實驗小區(qū)，每塊實驗小區(qū)的面積為8mX2. 5m，每塊實驗小區(qū)均勻種植有100株金觀音茶樹。實驗設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。實驗第I天，各組分別進行如下處理第一組在茶樹葉面均勻噴灑富硒菌劑使用液，每塊實驗小區(qū)噴灑20L ；第二組在茶樹葉面均勻噴灑清水，每塊實驗小區(qū)噴灑20L ；第三組不作任何處理。實驗第18天采集茶葉并進行硒含量檢測(按照GB5009. 93-2010的檢測方法)。第一組茶葉中的硒含量為350 μ g/kg，第二組茶葉中的硒含量為75 μ g/kg (請指明)，第三組茶葉中的硒含量為50 μ g/kg (請指明)。夏茶施用富硒菌劑使用液后，效果明顯，主要表現(xiàn)為①提高夏梢的發(fā)芽密度與整齊度，增加夏茶產(chǎn)量促進夏梢生長，提早開采期③改善夏茶品質(zhì)、優(yōu)化綠茶品質(zhì)生化成分；④降低茶葉中的農(nóng)藥殘留量增加了茶葉中的茶葉中的硒含量。
權(quán)利要求
1.莢膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus) AYGHJ-16，它的保藏編號為 CCTCC NO M2011377。
2.權(quán)利要求I所述莢膜紅細菌AYGHJ-16在生產(chǎn)富硒菌劑中的應(yīng)用。
3.制備權(quán)利要求I所述莢膜紅細菌AYGHJ-16的發(fā)酵液的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求I所述莢膜紅細菌AYGHJ-16，得到發(fā)酵液。
4.權(quán)利要求3所述方法制備得到的發(fā)酵液。
5.權(quán)利要求4所述發(fā)酵液的使用方法，是將所述發(fā)酵液進行30-50倍稀釋后噴灑于茶樹葉面。
6.權(quán)利要求4所述發(fā)酵液在生產(chǎn)茶葉中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求4所述發(fā)酵液在培養(yǎng)茶樹中的應(yīng)用。
8.—種生產(chǎn)茶葉的方法，包括將權(quán)利要求4所述發(fā)酵液進行30-50倍稀釋后噴灑于茶樹葉面的步驟。
9.一種培養(yǎng)茶樹的方法，包括將權(quán)利要求4所述發(fā)酵液進行30-50倍稀釋后噴灑于茶樹葉面的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株莢膜紅細菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了莢膜紅細菌AYGHJ-16，它的保藏編號為CCTCC NOM 2011377，屬于光合細菌，能利用光能，將一些有機小分子(如有機酸、氨基酸等)轉(zhuǎn)化為生長刺激物和抗病毒物質(zhì)，刺激植物生長，提高植物的抗病免疫力。并且，光合細菌可以利用土壤中異氧微生物代謝所產(chǎn)生的有機酸，解除異氧微生物的產(chǎn)物反饋抑制，使其大量繁殖，促進了土壤中一些無機物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和吸收，再加上光合細菌本身能進行強烈的固氮和固碳作用，可以為植物提供更多的無機物。本發(fā)明提供的富硒菌劑可以改善土壤微生態(tài)環(huán)境，從而提高植物的抗病能力以及對于各種礦物元素和稀有元素(比如硒)的內(nèi)吸化，達到提高植物體富硒的要求。
文檔編號C12R1/01GK102618469SQ20121009203
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者劉建明, 吳偉斌, 吳松剛, 施巧琴, 施碧紅, 毛寧, 翁雪清, 黃元君, 黃祥峰, 黃欽耿 申請人:福建安野高新農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司