本發(fā)明屬于紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯分離純化的
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的分離純化方法。
背景技術(shù)：
：紅球菌屬是一類廣泛分布于自然界的革蘭氏陽(yáng)性菌，在土壤、海底沉積物和食草動(dòng)物糞便中含量豐富，且多數(shù)為營(yíng)腐生生活。紅球菌屬(rhodococcussp.)是在1891年由zoof建立的，從建立至今，分類地位一直不確定。目前，紅球菌歸屬于放線菌門(actinobacteria)，放線菌綱(actinobacteria)，放線菌亞綱(actinobacteridae)，放線菌目(actinomycetales)，棒桿菌亞目(croynebacterineae)，諾卡氏菌科(nocardiaceae)，紅球菌屬(rhodococcus)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅平紅球菌的研究較多，主要集中在其生物降解能力研究和分子學(xué)研究，而對(duì)紅球菌產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)研究較少，尤其對(duì)極地海洋來(lái)源的紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)的鑒定與研究尚十分匱乏，紅球菌b7740是我國(guó)北極科考隊(duì)于第三次北極科考時(shí)從b77站點(diǎn)20米的表層海水中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于該菌所產(chǎn)物質(zhì)的純化尚未有任何文獻(xiàn)報(bào)道。紅球菌b7740產(chǎn)類胡蘿卜素因該微生物獨(dú)特的代謝通路，與常見(jiàn)高等植物來(lái)源類胡蘿卜素相比，結(jié)構(gòu)相差較大，結(jié)構(gòu)種類不單一，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)不僅賦予了它獨(dú)特的活性，也增大了其純化的難度。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的分離純化方法，該分離方法操作方便快捷，能對(duì)紅球菌b7740所產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)進(jìn)行有效的分離純化。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的分離純化方法，利用高速逆流色譜分離純化北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯。北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的分離純化方法，包括如下步驟：1、按正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比為10:6-8:2-4配制溶劑體系，充分搖勻，待溶劑體系開(kāi)始分層，靜置分層并分離，得上層液和下層液，上層液作為固定相，下層液作為流動(dòng)相；2、將類異戊二烯提取液用部分下層液溶解，配制成100-1000ug/ml樣品溶液；3、打開(kāi)恒溫水浴，將溫度設(shè)置為18-22℃；4、用無(wú)水乙醇清洗泵中的螺旋柱管；5、泵入固定相；6、平衡兩相溶劑體系：打開(kāi)紫外檢測(cè)器，待預(yù)熱完成后，將波長(zhǎng)設(shè)置為450nm；正轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動(dòng)主機(jī)，同時(shí)以10ml/min流速泵入流動(dòng)相，待檢測(cè)器出口端流出流動(dòng)相且紫外信號(hào)穩(wěn)定不變時(shí)，則溶劑體系已基本平衡；7、進(jìn)樣；8、接收流分。進(jìn)一步，正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比為10:8:2、10:6.5:3.5、10:7:3或10:6.75:3.25。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：本發(fā)明利用tbe-300c高速逆流色譜儀對(duì)紅球菌b7740所產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)進(jìn)行有效的分離純化，得到三種稀有海洋來(lái)源類胡蘿卜素。此三種北極海洋來(lái)源的稀有類胡蘿卜素，具有與常見(jiàn)高等植物來(lái)源類胡蘿卜素完全不同的端基，該三種類胡蘿卜素經(jīng)鑒定為芳香類胡蘿卜素，獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予其獨(dú)特的活性，具有應(yīng)用于食品、藥品、化妝品的價(jià)值，并因?yàn)槠洫?dú)特的天然來(lái)源，比人工合成的類胡蘿卜素更易受市場(chǎng)青睞。說(shuō)明書(shū)附圖圖1為實(shí)施例1中紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)(溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:8:2時(shí))的hsccc色譜圖。圖2為實(shí)施例1中紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)(溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.5:3.5時(shí))的hsccc色譜圖。圖3為實(shí)施例1中紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)(溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:7:3時(shí))的hsccc色譜圖。圖4為實(shí)施例1中紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯物質(zhì)(溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.75:3.25時(shí))的hsccc色譜圖。圖5為實(shí)施例1中分離產(chǎn)物一的高精度質(zhì)譜圖。圖6為實(shí)施例1中分離產(chǎn)物二的高精度質(zhì)譜圖。圖7為實(shí)施例1中分離產(chǎn)物三的高精度質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。北極海洋紅球菌b7740，是發(fā)明人于2008年7-9月中國(guó)第三次北極科學(xué)考察期間，用seabird911plusctd系統(tǒng)從北冰洋b77站點(diǎn)(146°49.28′w，76°58.08′n)25m深的表層海水樣品中分離得到，寧波市微生物與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)16srdna序列blast在線比對(duì)，判定該菌為紅球菌屬。實(shí)施例1北極海洋紅球菌b7740產(chǎn)類異戊二烯的分離純化實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料1.1、實(shí)驗(yàn)試劑溶菌酶(20000u/mg)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，醋酸鋅、氯化鈉、甲醇和二氯甲烷購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，正己烷、二氯甲烷購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；色譜級(jí)甲基叔丁基醚購(gòu)自上海阿拉丁生化科技技股有限公司。1.2、實(shí)驗(yàn)儀器tbe-300c高速逆流色譜儀購(gòu)自上海同田生物科技有限公司；2695高效液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)waters公司；ltq-orbitrapelite質(zhì)譜儀購(gòu)自賽默飛世爾科技(美國(guó))有限公司。1.3、實(shí)驗(yàn)原料按照中國(guó)專利(一種紅球菌b7740類胡蘿卜素的微膠囊制備方法、201510016005.8)公開(kāi)的方法制備類異戊二烯提取液：稱取0.8g北極海洋紅球菌b7740凍干菌粉(浙江萬(wàn)里學(xué)院提供)置于離心管中，加入16ml溶菌酶溶液(1mg/ml)，置于37℃水浴中，避光放置1h，然后加入24ml飽和醋酸鋅溶液使已破壁的紅球菌沉降，將該離心管于7000rpm、4℃下離心10min，丟棄上清液，再將64ml混合有機(jī)溶劑(甲醇：二氯甲烷＝4:1，體積比)加入到紅球菌沉淀中，用玻璃棒攪拌均勻，離心，分離出上清液，繼續(xù)向離心管中加入混合有機(jī)溶劑(甲醇：二氯甲烷＝4:1，體積比)，如此反復(fù)提取2-3次，合并上清液，得到類異戊二烯提取液。2、實(shí)驗(yàn)方法：2.1、用1000ml分離漏斗按正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比為10:8:2配制2l溶劑體系，充分振蕩搖勻，待溶劑體系開(kāi)始分層，在室溫(25℃)下靜置15min進(jìn)行分層，分離，得上層液(固定相)和下層液(流動(dòng)相)，將上層液和下層液分別放入藍(lán)蓋瓶中，超聲排氣20min，備用；2.2、將類異戊二烯提取液用20ml下層液溶解，配制成300ug/ml樣品溶液；2.3、打開(kāi)恒溫水浴，將溫度設(shè)置為20℃；2.4、用無(wú)水乙醇清洗泵中的螺旋柱管：以50ml/min流速泵入無(wú)水乙醇，泵入1min后停止，再打開(kāi)氣泵，排氣5min，將螺旋柱管中的殘留液體吹干；重復(fù)此過(guò)程3次(最后一次排氣1h)；2.5、泵入固定相：以50ml/min流速泵入固定相，待檢測(cè)器出口端流出約30-50ml固定相時(shí)，停泵；2.6、平衡兩相溶劑體系：打開(kāi)紫外檢測(cè)器，待預(yù)熱完成后，將波長(zhǎng)設(shè)置為450nm；正轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動(dòng)主機(jī)(rev為反轉(zhuǎn)，fwd為正轉(zhuǎn))，轉(zhuǎn)速為800r/min，同時(shí)以10ml/min流速泵入流動(dòng)相，待檢測(cè)器出口端流出流動(dòng)相且紫外信號(hào)穩(wěn)定不變時(shí)，則溶劑體系已基本平衡；2.7、進(jìn)樣；將進(jìn)樣六通閥切至到load，在裝樣柱的注射器中倒入樣品溶液20ml，推排氣泡后，將樣液吸入到進(jìn)樣圈中，直至樣液剩余1ml為止，再將load切換至inject，并將檢測(cè)器、工作站調(diào)零，重新記錄；2.8、接收流分：待工作站開(kāi)始記錄，按色譜出峰的信號(hào)的順序收集流分；2.9、清洗hsccc儀器：斷開(kāi)主機(jī)與泵的連接，關(guān)閉主機(jī)，以50ml/min流速將無(wú)水乙醇泵入，沖洗螺旋柱管，泵入1min后停止，再將主機(jī)的進(jìn)口與氣泵的氣管連接，打開(kāi)氣泵，排氣5min，將螺旋柱管中的殘留液體吹干；重復(fù)此過(guò)程3次(最后一次排氣30min)；2.10、將收集的各分流用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，再用甲基叔丁基醚復(fù)溶，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，得到各待測(cè)流分樣品，放置于冰箱負(fù)一層進(jìn)行低溫、避光貯藏；2.11、重復(fù)步驟2.1-2.10三次，每次重復(fù)只改變正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比，正己烷、乙腈和二氯甲烷的體積比分別變?yōu)?0:6.5:3.5、10:7:3或10:6.75:3.25，其他操作不變。3、一級(jí)檢測(cè)：將每次操作所得的各待測(cè)樣品用高效液相色譜和紫外吸收進(jìn)行檢測(cè)：高效液相色譜檢測(cè)條件如下：色譜柱ymcc30(5um×4.6mm×150mm)，柱溫25℃，紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，進(jìn)樣量10ul；流動(dòng)相：流動(dòng)相a為甲醇，b為甲基叔丁基醚，流速：1ml/min.洗脫程序：第一階段：采用流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的混合液洗脫30分鐘，其中流動(dòng)相a的體積百分含量由95變?yōu)?0％，流動(dòng)相b的體積百分含量由5變?yōu)?0％；第二階段：采用流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的混合液洗脫20分鐘，其中流動(dòng)相a的體積百分含量由70變?yōu)?0％，流動(dòng)相b的體積百分含量由30變?yōu)?0％；第三階段：采用流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的混合液洗脫10分鐘，其中流動(dòng)相a的體積百分含量由50變?yōu)?5％，流動(dòng)相b的體積百分含量由50變?yōu)?％。4、一級(jí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：4.1、溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:8:2時(shí)的分離效果溶劑體系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的體積比為10:8:2的條件下，類異戊二烯提取液的hsccc色譜圖如圖1所示，由圖1可知，出現(xiàn)了三個(gè)峰，三個(gè)峰按出峰順序分別為峰一、峰二和峰三。峰一、峰二和峰三所對(duì)應(yīng)的待測(cè)流分樣品的hplc和紫外吸收檢測(cè)結(jié)果如表1所示：表1類異戊二烯提取液在溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:8:2時(shí)分離產(chǎn)物的hplc和紫外吸收檢測(cè)結(jié)果從表1可以看出，峰一的分離效果不好，含有三種主要成分，峰二的分離效果雖然好一些，純度達(dá)到了80.33％，但雜峰太多，峰三的分離效果最好，純度高達(dá)95.21％，其最大紫外吸收波長(zhǎng)為452nm。4.2、溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.5:3.5時(shí)的分離效果溶劑體系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的體積比為10:6.5:3.5的條件下，類異戊二烯提取液的hsccc色譜圖如圖2所示，由圖2可知，出現(xiàn)了八個(gè)峰，八個(gè)峰按出峰順序分別為峰一、峰二、峰三、峰四、峰五、峰六、峰七和峰八。峰一-峰八所對(duì)應(yīng)的待測(cè)流分樣品的hplc和紫外吸收檢測(cè)結(jié)果如表2所示：表2類異戊二烯提取液在溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.5:3.5時(shí)分離產(chǎn)物的hplc和紫外吸收檢測(cè)結(jié)果hsccc分離產(chǎn)物hplc出峰時(shí)間hplc出峰面積hplc出峰面積％紫外吸收λmax峰一亂，峰雜＿＿峰二亂，峰雜＿＿峰三22.036130781.62274,452,468峰四26.8179165856.79434,458,484峰五32.2456200393.41282,452,476峰六29.583177893.92284,434,460,486峰七亂，峰雜＿＿峰八24.1253727380.36250,274由表2可知，峰一、峰二和峰七的分離效果很差，全是雜峰，峰三的純度達(dá)到了81.62％，但還有一些雜峰，分離效果一般般，峰四的分離效果也不好，純度只有56.79％，雜峰太多，峰五的分離效果非常好，純度達(dá)到了93.41％，其最大紫外吸收波長(zhǎng)為452nm，峰六的純度雖然達(dá)到了93.41％，但存在拖尾現(xiàn)象，峰八雖然純度達(dá)到了80.36％，但沒(méi)有出現(xiàn)單峰，兩個(gè)峰連在了一起，分離效果也一般。4.3、溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:7:3時(shí)的分離效果溶劑體系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的體積比為10:7:3的條件下，類異戊二烯提取液的hsccc色譜圖如圖3所示，由圖3可知，出現(xiàn)了四個(gè)峰，四個(gè)峰按出峰順序分別為峰一、峰二、峰三和峰四，同時(shí)標(biāo)出間一(峰一之前的曲線部分)、間二(峰三和峰四之間的曲線部分)和間三(峰四之后的曲線部分)。峰一-峰四以及間一-三所對(duì)應(yīng)的待測(cè)流分樣品的hplc和紫外吸收檢測(cè)結(jié)果如表3所示：表3類異戊二烯提取液在溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:7:3時(shí)分離產(chǎn)物的hplc和紫外吸收檢測(cè)結(jié)果hsccc分離產(chǎn)物hplc出峰時(shí)間hplc出峰面積hplc出峰面積％紫外吸收λmax間接液一＿＿＿峰一22.01892634992.82274,452,468峰二＿＿＿峰三26.8283486385.1434,458,484間接液二32.2123519683.79282,452,476峰四32.2329124178.96282,452,476間接液三29.5199616991.79284,434,460,486從表3可知，間接液一、峰二的分離效果很差，峰一和間接液三的分離效果比較好，純度分別達(dá)到了92.82％、91.79％，其最大紫外吸收波長(zhǎng)分別為452nm、460nm，峰四的純度雖然純度達(dá)到了78.96％，但沒(méi)有單峰出現(xiàn)，兩峰連在了一起，分離效果一般，峰三的純度雖然達(dá)到了85.1％，但沒(méi)有單峰出現(xiàn)，兩峰連在了一起，分離效果不好，間接液二雖然達(dá)到了83.79％，但存在拖尾現(xiàn)象，而且有較多小雜峰。4.4、溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.75:3.25時(shí)的分離效果溶劑體系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的體積比為10:6.75:3.25的條件下，類異戊二烯提取液的hsccc色譜圖如圖4所示，由圖4可知，出現(xiàn)了六個(gè)峰，六個(gè)峰按出峰順序分別為峰一、峰二、峰三、峰四、峰五、峰六。峰一-峰六所對(duì)應(yīng)的待測(cè)流分樣品的hplc和紫外吸收檢測(cè)結(jié)果如表4所示：表4類異戊二烯提取液在溶劑體系中正己烷、乙腈和二氯甲烷體積比為10:6.75:3.25時(shí)分離產(chǎn)物的hplc和紫外吸收檢測(cè)結(jié)果hsccc分離產(chǎn)物hplc出峰時(shí)間hplc出峰面積hplc出峰面積％紫外吸收λmax峰一22.0326250272.56274,452,468峰二24.1144199762.6250,274峰三32.3949091792.87282,452,476峰四29.5435915196.39284,434,460,486峰五亂，峰雜＿＿峰六26.8756466489.7434,458,484從表4可知，峰一、峰二的分離效果一般，純度分別只有72.56％和62.6％，峰三和峰四的分離效果較好，純度分別達(dá)到了92.87％和96.39％，其最大紫外吸收波長(zhǎng)分別為452nm、460nm，峰五的分離效果很差，峰六的分離效果較好，純度為89.7％，其最大紫外吸收波長(zhǎng)為458nm，經(jīng)分析，峰六為β-胡蘿卜素。5、二級(jí)檢測(cè)取分離產(chǎn)物一(4.3中峰一對(duì)應(yīng)的流分)、分離產(chǎn)物二(4.4中峰四對(duì)應(yīng)的流分)、分離產(chǎn)物三(4.1中峰三對(duì)應(yīng)的流分)進(jìn)行高精度質(zhì)譜分析：質(zhì)譜條件：esi離子源，掃描范圍m/z400-700，分辨率60000，離子阱dda模式，運(yùn)用碰撞誘導(dǎo)解離(cid)和35％的碰撞能量，掃描時(shí)選取3個(gè)信號(hào)最強(qiáng)的離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，加熱溫度250℃，毛細(xì)管溫度350℃，鞘氣流速：35，輔助氣體流速：15，噴霧電壓：3.5kv，s-lens射頻水平60％，樣品溶解于色譜甲醇中，進(jìn)樣量2ul，流速0.2ml/min。6、二級(jí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖5所示，分離產(chǎn)物一在高精度質(zhì)譜中其分子離子峰為m/z＝589.3283，即為其實(shí)際測(cè)量高精度加氫分子量值，其與理論值的偏差見(jiàn)表5，其誤差為4.9ppm以內(nèi)，鑒定分離產(chǎn)物一為synechoxanthin。如圖6所示，分離產(chǎn)物二在高精度質(zhì)譜中其分子離子峰為m/z＝533.4095，即為其實(shí)際測(cè)量高精度加氫分子量值，其與理論值的偏差見(jiàn)表5，其誤差為8.8ppm，鑒定分離產(chǎn)物二為chlorobactene。如圖7所示，分離產(chǎn)物三在高精度質(zhì)譜中其分子離子峰為m/z＝529.3835，即為其實(shí)際測(cè)量高精度加氫分子量值，其與理論值的偏差見(jiàn)表5，其誤差為1.1ppm，鑒定21號(hào)峰為isorenieratene。分離產(chǎn)物一-三的高精度質(zhì)譜數(shù)據(jù)如圖5所示：productformulacalculatedmasserror(ppm)experimentalmass分離產(chǎn)物一c40h4404+h+589.33124.9589.3283分離產(chǎn)物二c40h52+h+533.41428.8533.4095分離產(chǎn)物三c40h48+h+529.38291.1529.3835當(dāng)前第1頁(yè)12