本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種基于恒溫隔絕式熒光PCR平臺的牦牛輪狀病毒檢測試劑盒及應用。

背景技術：

1968年Mebus等人發(fā)現(xiàn)了牛輪狀病毒，而牦牛輪狀病毒(Yak RV)于1986年在張敏等對牦牛的腹瀉病研究中首次發(fā)現(xiàn)并分離得到，但是卻沒有進行進一步的研究(張敏，王清江，劉登薇，等.紅原牦牛輪狀病毒的研究[J].四川畜牧獸醫(yī),1986,3:2-4.)。1990年，李明瑞等在蘭州的犢牦牛腹瀉中發(fā)現(xiàn)牦牛輪狀病毒的存在，并證明牦牛輪狀病毒是引起牦牛腹瀉的重要病因(李明瑞，李春玲，李浩，等.1990.牦犢牛流行性腹瀉病原的調查[J].中國獸醫(yī)科學(2)，12-13.)。被牦牛輪狀病毒感染的犢牦牛臨床癥狀主要是腹瀉，常繼發(fā)細菌感染，引起死亡，病死率高。給牦牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失。

引起牦牛腹瀉的病原較多，包括輪狀病毒、冠狀病毒、病毒性腹瀉病毒、大腸桿菌、沙門氏菌、隱孢子蟲以及球蟲等，癥狀相似，較難區(qū)分，故早期的鑒別診斷尤為重要，病原檢測可以提供感染的直接證據，是最可靠的診斷手段，PCR、熒光定量PCR是最為常用的病原學檢測手段，尤其熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，已經成為動物疫病診斷的主流手段。但是普通的熒光定量PCR方法由于需要大型設備、操作復雜、反應時間長等因素制約了其在現(xiàn)場快速檢測方面的應用。

同時，由于青藏高原的特殊環(huán)境導致了牦牛輪狀病毒基因發(fā)生了很大的變異，特別是常作為靶標基因的VP6基因，2016周芳等研究表明牦牛輪狀病毒VP6基因的變異嚴重影響現(xiàn)有PCR方法的檢出率(周芳，岳華，張斌，等.2016.牦牛輪狀病毒VP6基因序列分析及RT-PCR檢測方法的建立與應用[J].畜牧獸醫(yī)學報，47(7)，1465-1473.)。因此針對牦牛輪狀病毒建立一種快速、敏感、特異、適用于現(xiàn)場的檢測方法迫在眉睫。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種基于恒溫隔絕式熒光PCR平臺的牦牛輪狀病毒檢測試劑盒及應用，本發(fā)明是基于恒溫隔絕式熒光PCR的一種簡單、快速、靈敏度高和特異強的檢測方法，可以現(xiàn)場對牦牛輪狀病毒的檢測提供科學依據，對保障牦牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明公開了一種基于恒溫隔絕式熒光PCR平臺的牦牛輪狀病毒檢測的引物和探針，所述引物和探針包括：牦牛輪狀病毒上游引物和牦牛輪狀病毒下游引物和牦牛輪狀病毒探針，其中，

所述牦牛輪狀病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牦牛輪狀病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牦牛輪狀病毒探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；牦牛輪狀病毒探針的核苷酸序列的5'端連接有FAM標記，3'端連接有非熒光淬滅基團和BHQ。

本發(fā)明還公開了一種上述引物和探針在制備牦牛輪狀病毒檢測試劑盒方面的應用。

本發(fā)明還公開了一種基于恒溫隔絕式熒光PCR平臺的牦牛輪狀病毒檢測試劑盒，包括反應緩沖液、熒光定量PCR反應液凍干管、陽性對照品凍干管和陰性對照品凍干管；

所述熒光定量PCR反應液凍干管包括Taq酶1μL、反轉錄酶1.25μL、牦牛輪狀病毒上游引物、牦牛輪狀病毒下游引物各3.5μL和牦牛輪狀病毒探針0.25μL、dNTPs 4μL；

牦牛輪狀病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牦牛輪狀病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牦牛輪狀病毒探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；牦牛輪狀病毒探針的核苷酸序列的5'端連接有FAM標記，3'端連接有非熒光淬滅基團和BHQ。

進一步地，Taq酶的終濃度為5U·μL^-1，反轉錄酶的終濃度為20U·μL^-1，牦牛輪狀病毒上游引物和牦牛輪狀病毒下游引物的終濃度均為10μmol·μL^-1，牦牛輪狀病毒探針的終濃度為10μmol·μL^-1，dNTPs的終濃度為2.5mM。

進一步地，所述熒光定量PCR反應液凍干管通過以下方法制備得到：將Taq酶、反轉錄酶、牦牛輪狀病毒上游引物、牦牛輪狀病毒下游引物和牦牛輪狀病毒探針、dNTPs混合加入0.5ml的PCR管中降至-50℃，然后在10pa氣壓下凍干24h，形成干粉狀后閉管，制得熒光定量PCR反應液凍干管，所述熒光定量PCR反應液凍干管設置有50管。

進一步地，反應緩沖液由以下組分構成：500mM KCl、pH 8.3、100mM Tris-HCl、15mM MgCl₂，余量為ddH₂O，以上體積總量為3ml。

進一步地，陽性對照品凍干管通過以下方法制備得到：將含有牦牛輪狀病毒RNA片段的RNA樣品100μL裝入PCR管內，降至-50℃，然后在10pa氣壓下凍干24h，形成干粉狀后閉管制備而成；

陰性對照品凍干管通過以下方法制備得到：將無牦牛輪狀病毒RNA片段的樣品100μL裝入PCR管內，降至-50℃，然后在10pa氣壓下凍干24h，形成干粉狀后閉管制備而成。

進一步地，該試劑盒保存于4℃下。

本發(fā)明還公開了一種基于恒溫隔絕式熒光PCR平臺的牦牛輪狀病毒檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

1)制備RNA模板：取糞便樣本上清液200μL，參考金瑞泓捷(廈門)生物科技有限公司的PetNAD試劑盒提取說明書提取被檢樣本上清總RNA，制備得到RNA模板；

2)熒光PCR反應體系的制備：熒光PCR反應體系的制備于冰上操作；取100μL反應緩沖液加入到陽性對照品凍干管中混合，制備得到陽性對照品，然后取50μL反應緩沖液和5μL陽性對照品加入熒光定量PCR反應液凍干管中，制備得到陽性對照反應體系；取100μL反應緩沖液加入陰性對照品凍干管中，制備得到陰性對照品，然后取50μL反應緩沖液和5μL陰性對照品加入熒光定量PCR反應液凍干管中，制備得到陰性對照反應體系；取50μL反應緩沖液和5μL檢測樣本RNA加入熒光定量PCR反應液凍干管中，制備得到檢測樣本RNA反應體系；然后分別從各個反應體系中取50μL混合物移入恒溫隔絕式熒光PCR反應管中；加樣時注意避光操作；將制備好的熒光定量PCR反應管瞬時高速離心5s，避免出現(xiàn)氣泡；

3)擴增檢測：把PCR反應管放置于恒溫隔絕式熒光PCR儀器內，按運行鍵，即開始反應；

4)檢測結果判定：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術效果：

1)本發(fā)明提供了一種牦牛輪狀病毒的熒光PCR檢測試劑盒，其優(yōu)點是特異性強、靈敏度高、檢測時間短、無污染、無需電泳，可在現(xiàn)場快速檢測。

2)本發(fā)明能快速、準確地檢測出被檢樣本中的牦牛輪狀病毒RNA，同時也可以檢出普通牛的輪狀病毒RNA，用于牛輪狀病毒的分子流行病學調查。

3)本發(fā)明的熒光定量PCR反應液中包括反轉錄酶和PCR擴增酶，使核酸的反轉錄和擴增在同一管中進行，簡化了操作，節(jié)省了試劑同時閉管操作降低了RNA的降解和污染的可能性。

4)熒光定量PCR反應液、陽性和陰性對照品均采用凍干方式制備，降低了試劑盒的保存條件，可4℃保存一年時間，便于運輸，方便儲存，同時提高了試劑的穩(wěn)定性。

當然，實施本發(fā)明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明POCKIT Micro儀器的結構圖；

圖2是本發(fā)明陽性樣本靈敏度檢測結果，其中，1：9.66×10⁴copies/μL；2：9.66×10³copies/μL；3：9.66×10²copies/μL；4：9.66×10¹copies/μL。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據以實施。

實施例1基于恒溫隔絕式熒光PCR平臺的牦牛輪狀病毒檢測試劑盒

一種基于恒溫隔絕式熒光PCR平臺的牦牛輪狀病毒檢測試劑盒，包括以下組分：

(1)反應緩沖液：3ml，由500mM KCl、100mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl₂和ddH₂O(余量)組成。

(2)熒光定量PCR反應液凍干管(50管)：

熒光定量PCR反應液包括Taq酶1μL/管(5U·μL^-1)、反轉錄酶1.25μL/管(20U·μL^-1)、檢測用上下游引物各3.5μL/管(10μmol·μL^-1)和探針0.25μL/管(10μmol·μL^-1)、dNTPs 4μL/管(2.5mM)；將以上混合物加入0.5ml的PCR管中降至-50℃，然后在10pa氣壓下凍干24h，形成干粉狀后閉管，制得熒光定量PCR反應液凍干管。其中，檢測牦牛輪狀病毒的上下游引物和探針共3條，擴增出牦牛輪狀病毒VP6基因的長度為92bp。上游引物序列:5’-GCTAACCACTTGGTATCCG-3’，SEQ ID NO:1；下游引物序列:5’-GCCATCTGAGTGATTACTCTG-3’，SEQ ID NO:2；探針序列：FAM-TACGTATTCGCTACACAGAGTAATCA-BHQ1，SEQ ID NO:3。

(3)陽性對照品凍干管(1管)：將含有牦牛輪狀病毒RNA片段的RNA樣品100μL裝入PCR管內，降至-50℃，然后在10pa氣壓下凍干24h，形成干粉狀后閉管制備而成；其中，牦牛輪狀病毒RNA的序列如SEQ ID NO:4所示。

(4)陰性對照品凍干管(1管)：將無牦牛輪狀病毒RNA片段的樣品100μL裝入PCR管內，降至-50℃，然后在10pa氣壓下凍干24h，形成干粉狀后閉管制備而成。

本試劑盒保存于4℃，運輸需加冰袋。

實施例2基于恒溫隔絕式熒光PCR平臺的牦牛輪狀病毒檢測試劑盒的使用方法

該方法包括以下步驟：

1)RNA模板：取糞便樣本上清液200μL，參考金瑞泓捷(廈門)生物科技有限公司的PetNAD試劑盒提取說明書提取被檢樣本上清總RNA，制備得到RNA模板；

2)熒光PCR反應體系的制備：熒光PCR反應體系的制備于冰上操作；

取100μL反應緩沖液加入到陽性對照品凍干管中混合，制備得到陽性對照品，然后取50μL反應緩沖液和5μL陽性對照品加入熒光定量PCR反應液凍干管中，制備得到陽性對照反應體系；取100μL反應緩沖液加入陰性對照品凍干管中，制備得到陰性對照品，然后取50μL反應緩沖液和5μL陰性對照品加入熒光定量PCR反應液凍干管中，制備得到陰性對照反應體系；取50μL反應緩沖液和5μL檢測樣本RNA加入熒光定量PCR反應液凍干管中，制備得到檢測樣本RNA反應體系；然后分別從各個反應體系中取50μL混合物移入恒溫隔絕式熒光PCR反應管中。加樣時注意避光操作。將制備好的熒光定量PCR反應管瞬時高速離心5s，避免出現(xiàn)氣泡。

3)擴增檢測：把PCR反應管放置于恒溫隔絕式熒光PCR儀器內(POCKIT Micro)(如圖1所示)，按運行鍵，即開始反應；

4)檢測結果判定：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

實施例3標準品制備和靈敏度的測定

取糞便樣本上清液200μL，參考金瑞泓捷(廈門)生物科技有限公司的PetNAD試劑盒提取說明書提取被檢樣本上清總RNA，然后參照寶生物工程(大連)有限公司的反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄成cDNA。

用牦牛輪狀病毒的引物分別對上述制備的cDNA進行PCR擴增，以相應病原cDNA為陽性對照，無模板為陰性對照。反應體系為：cDNA 2.0μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1.0μL，ddH2O 8.5μL,總體積共25μL。PCR擴增條件為:95℃5min，95℃30s，52℃30s，72℃30s，30次循環(huán)，72℃10min。PCR產物經3％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其克隆至pMD19-T載體(寶生物工程有限公司)，并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選出陽性克隆接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h，用質粒提取試劑盒提取重組質粒，送生工生物有限公司測序。測序正確的陽性質粒作為牦牛輪狀病毒陽性標準品，核酸蛋白檢測儀測定其濃度，按照下述公式計算核酸濃度：陽性標準品濃度(copies/μL)＝(6.02×10²³copies/mol)×(29.75ng/μl)×10^-3/(1.85*10⁶g/mol)＝9.66×10¹⁰copies/μL。將陽性標準品10倍梯度稀釋(10^-1～10^-10)，對10³、10²、10¹和10⁰四個稀釋度樣本進行檢測，各反應管放入POCKIT Micro反應孔，按“運行鍵”即可，42分鐘后反應結束，陽性結果為“+”，陰性結果為“-”，結果如圖2所示，其中10³、10²、10¹結果為“+”10⁰結果為“-”，說明本試劑盒的最低檢測限為96.6copies/μL。

實施例4特異性和穩(wěn)定性檢驗

用本發(fā)明研制的試劑盒對22份牦牛輪狀病毒陽性樣本、8份陰性樣本以及10種相關病原牦牛冠狀病毒、牦牛病毒性腹瀉病毒、牦牛星狀病毒、牦牛腸炎病毒、牦牛大腸桿菌、牦牛沙門氏菌、牦牛產氣莢膜桿菌、牦?？漳c彎曲桿菌、牦牛隱孢子蟲、牦牛球蟲進行檢測，并設立牦牛輪狀病毒陽性標準品作為對照，以評價試劑盒的特異性，結果顯示對22份牦牛輪狀病毒陽性核酸樣本的檢測為陽性，8份陰性樣本、和10種相關病原檢測結果為陰性，證明該方法特異性好。

用研制的試劑盒對牦牛輪狀病毒的8個稀釋度的陽性標準品分別檢測3次，以評價該試劑盒的穩(wěn)定性，結果顯示3次檢測結果一致，表明試劑盒的穩(wěn)定性良好。

實施例5試劑盒的臨床應用及與普通熒光定量PCR方法比較

用本發(fā)明試劑盒和Rashi等(Gautam,R.,Esona,M.D.,Mijatovicrustempasic,S.,Tam,K.I.,Gentsch,J.R.,&Bowen,M.D.(2014).Real-time rt-pcr assays to differentiate wild-type group a rotavirus strains fromandvaccine strains in stool samples.Human Vaccines&Immunotherapeutics,10(3),767.)報道的熒光定量PCR方法對提取的30份牦牛輪狀病毒陽性樣本和8份陰性樣本核酸進行檢測，比較兩種PCR方法的符合率。結果顯示22份牦牛輪狀病毒陽性樣本中，本發(fā)明試劑盒檢出的陽性樣本數(shù)為22個，符合率為100％；而Rashi等報道的熒光定量PCR方法對總RNA檢出的陽性樣本數(shù)為11個，符合率為50％。兩種方法對8份陰性樣本檢出結果均為陰性，符合率為100％。將熒光定量PCR未檢出的而試劑盒檢出為陽性的PCR產物測序，測序結果證實為牦牛輪狀病毒VP6基因的特異序列。證明該試劑盒對于牦牛輪狀病毒的檢出效果優(yōu)于現(xiàn)有的熒光定量PCR方法，同時又比現(xiàn)有PCR方法操作簡單、便攜，更適用于現(xiàn)場檢測診斷，為牦牛輪狀病毒的診斷和流行病學調查提供了一種有力便捷的工具。

由于高原上輪狀病毒的變異情況，導致現(xiàn)有熒光定量PCR方法檢出率降低，本試劑盒克服了該問題，可以檢出牦牛的輪狀病毒也可以檢出普通牛的輪狀病毒。

本試劑盒與POCKIT Micro儀器配合使用，操作簡單，便攜，適用于臨床檢出，目前還沒有市售的試劑盒。

本發(fā)明對反應試劑進行了凍干，降低了試劑盒保存條件，便于運輸和臨床應用。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應在發(fā)明所附權利要求的保護范圍內。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南民族大學

<120> 基于恒溫隔絕式熒光PCR平臺的牦牛輪狀病毒檢測試劑盒及應用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctaaccact tggtatccg 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccatctgag tgattactct g 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacgtattcg ctacacagag taatca 26

<210> 4

<211> 92

<212> DNA

<213> 牦牛輪狀病毒

<400> 4

gctaaccact tggtatccgt gtagcgaata cgtagacgca tccttactta cagagttcaa 60

acagcttggc gtagctacat acttaccaaa gt 92