本發(fā)明涉及一種流感病毒系列檢測的方法及試劑盒，特別涉及一種運(yùn)用連接酶檢測甲型流感病毒系列的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：流行性感冒病毒（influenzavirus），是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表種，簡稱流感病毒，包括人流感病毒和動物流感病毒，人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原體。流感病毒會造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常會有周期性流行。其中，甲型流感病毒較容易發(fā)生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)而引起的。通過病毒表面的HA和NA蛋白的亞型可鑒定甲型流感病毒，甲型流感病毒有17種HA亞型和10種NA亞型，所有這些亞型均以多種不同組合存在于病毒表面。甲型流感對人類致病性高，曾多次引起世界性大流行。一般在人類中發(fā)現(xiàn)的甲型流感病毒亞型為H1、H2和H3亞型（其中，H2亞型無傳染性），目前已知可感染人的亞型還包括H5、H7和H9亞型，其中H1、H5、H7亞型為高致病性。在動物和人類中傳播的流感病毒亞型包括H7N7和H3N8病毒，它們可在馬中導(dǎo)致疾病，還有H1N1、H1N2和H3N2病毒則通常在人類中傳播。實(shí)現(xiàn)對流感病毒的快速分型檢測有利于疫情監(jiān)測以及制定有效的預(yù)防控制措施。在流行期結(jié)合臨床癥狀診斷流感并不困難，但要確診或流行監(jiān)測流感病毒，則必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查，主要包括病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷、快速診斷方法和PCR方法。其中，病毒分離培養(yǎng)為臨床的金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，但需要較為嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件，且檢測耗時長，無法及時給臨床診斷提供參考；血清學(xué)診斷和快速診斷方法的診斷較為快速且特異度高，但檢測靈敏度低，無法進(jìn)行早期診斷。而PCR檢測技術(shù)克服了免疫檢測技術(shù)反應(yīng)原性低時或窗口期檢測的弱點(diǎn)，能夠更快更早期檢測某些病毒的感染，而現(xiàn)有的運(yùn)用多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測原理在于在同一PCR反應(yīng)體系加上針對多個特異的靶序列的多對引物和探針進(jìn)行PCR反應(yīng)，在PCR擴(kuò)增DNA反應(yīng)期間用熒光信號實(shí)時檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。其技術(shù)缺點(diǎn)主要在于：①前期一般都需要經(jīng)過步驟繁瑣的核酸提取及逆轉(zhuǎn)錄過程；②核酸提取完成后運(yùn)用普通Taqman探針的方法進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，意味著一個反應(yīng)管含有多條引物，引物間的相互干擾導(dǎo)致擴(kuò)增靈敏度低且耗時長（一次PCR反應(yīng)耗時約2小時）；③一般都是FAM和HEX兩個熒光通道檢測，通量低，無法實(shí)現(xiàn)一次擴(kuò)增即能達(dá)到對流感病毒基因快速分型檢測的目的，難以滿足實(shí)際使用的需要。開發(fā)出可以快速、高效檢測甲型流感病毒基因分型的方法及試劑盒，具有非常實(shí)際的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種運(yùn)用連接酶檢測甲型流感病毒系列的方法及試劑盒，本試劑盒可以快速檢測感染人且危害較大的4種常見甲型流感病毒亞型：H1、H3、H5和H7亞型，無需步驟繁瑣的核酸提取及逆轉(zhuǎn)錄過程，一管一次擴(kuò)增即可以實(shí)現(xiàn)4種常見甲型流感病毒的H1、H3、H5和H7亞型分型，解決了普通多重?zé)晒釶CR法檢測靈敏度低、耗時長且低通量的問題。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：運(yùn)用連接酶檢測甲型流感病毒系列的技術(shù)包括如下步驟：1）針對需要檢測的每個甲型流感病毒亞型序列的保守區(qū)，設(shè)計(jì)其相應(yīng)的上下游連接引物、特異性熒光探針及一對熒光PCR通用引物，上游連接引物為普通引物，下游連接引物為5’磷酸化標(biāo)記引物；2）上下游連接引物與樣本提取后的RNA靶片段互補(bǔ)配對，在連接酶的作用下，上下游連接引物連接成與靶片段完全互補(bǔ)配對的cDNA序列；3）將連接后的cDNA序列作為熒光PCR反應(yīng)的模板，僅一對通用引物即可擴(kuò)增所有亞型序列連接后的cDNA序列，檢測反應(yīng)體系的熒光變化，達(dá)到對樣本甲型流感病毒H1、H3、H5和H7亞型檢測的目的。運(yùn)用連接酶檢測甲型流感病毒系列的試劑盒，包括連接反應(yīng)管、熒光PCR反應(yīng)管、陰性對照和陽性對照，其中，連接反應(yīng)管含連接體系（含連接酶系統(tǒng)和上下游連接引物），熒光PCR反應(yīng)管含熒光PCR體系（含熱啟動Taq酶系統(tǒng)、通用引物及各亞型對應(yīng)的熒光探針），熒光PCR體系中的熒光探針為甲型流感病毒H1、H3、H5和H7亞型的特異性MGB探針。連接引物的序列如下：通用引物的序列如下：優(yōu)選的，通用引物序列的特征表現(xiàn)為：一條與上游連接引物的5’端部分序列完全一致，另一條與下游連接引物的3’端部分序列互補(bǔ)配對，通用引物的長度在20～30bp。甲型流感病毒H1、H3、H5和H7亞型的特異性MGB探針序列如下：上述探針的3’端連接有MGB，5’端連接有熒光基團(tuán)，其中，探針1～4分別用于檢測甲型流感病毒中的H1、H3、H5、H7亞型。優(yōu)選的，上述連接酶檢測甲型流感病毒系列的試劑盒中所使用的探針1～4連接的熒光基團(tuán)均不相同。優(yōu)選的，上述連接酶系統(tǒng)中的連接酶僅能以RNA為模板進(jìn)行連接反應(yīng)，且每人份連接體系中連接酶用量為0.5U～3U。優(yōu)選的，上述連接酶檢測甲型流感病毒系列的試劑盒中所使用的熱啟動Taq酶系統(tǒng)中添加有UDG酶，能有效防污染，使得本發(fā)明試劑盒的特異性及靈敏度更高。優(yōu)選的，上述連接酶檢測甲型流感病毒系列的試劑盒中所使用的熱啟動Taq酶系統(tǒng)含有經(jīng)過化學(xué)修飾的熱啟動Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份體系中熱啟動Taq酶為4U～7U，dNTPs為0.1mmol/L～0.3mmol/L，UDG酶為0.1U～0.5U。優(yōu)選的，上述連接酶檢測甲型流感病毒系列的試劑盒還設(shè)有RNA提取液，RNA提取液的組成成分為EDTA的濃度為0.001mol/L、Tris的濃度為0.01mol/L。本發(fā)明的有益效果是：1）本發(fā)明的試劑盒適用于定性分型檢測咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道樣本中甲型流感病毒H1、H3、H5、H7亞型。2）應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒中的RNA提取液即可快速對樣本進(jìn)行處理，無需其他常見的樣本提取方法的繁瑣步驟。3）本發(fā)明應(yīng)用單重?zé)晒釶CR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在同一管擴(kuò)增體系中分型檢測4種甲型流感病毒亞型。4）本發(fā)明中的熒光檢測系統(tǒng)只有一對通用引物，即可擴(kuò)增在連接酶系統(tǒng)中成功連接的4種甲型流感病毒亞型的靶片段，有效解決了引物過多導(dǎo)致的擴(kuò)增效率低下問題。5）本發(fā)明的檢測試劑盒檢測快速，檢測通量高，能及時指導(dǎo)臨床診斷，大大提高診斷效率。附圖說明圖1～3為本發(fā)明技術(shù)的反應(yīng)原理圖，圖4～6為本試劑盒檢測范圍內(nèi)的甲型流感病毒亞型檢測結(jié)果示意圖：圖1為連接引物與通用引物示意圖，如圖所示：上游通用引物序列與上游連接引物的5’端部分序列完全一致，而下游通用引物序列則與下游連接引物的3’端部分序列完全反向互補(bǔ)配對；圖2為連接反應(yīng)示意圖，如圖所示：上游連接引物的部分序列（非與上游通用引物序列一致的部分）與靶片段mRNA（targetmRNA）互補(bǔ)配對，下游連接引物的部分序列（非與下游通用引物序列反向互補(bǔ)配對的部分）與靶片段mRNA互補(bǔ)配對，上下游連接引物在連接酶作用下連接成與靶片段mRNA完全互補(bǔ)配對的cDNA序列，即連接產(chǎn)物（ligatedproduct）；圖3為通用引物PCR反應(yīng)示意圖，如圖所示：首先，下游通用引物與連接產(chǎn)物3’端反向互補(bǔ)配對結(jié)合，在Taq酶作用下，下游通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA片段；之后，雙鏈DNA片段變性為兩條單鏈DNA，上下游通用引物分別與兩條單鏈DNA片段反向互補(bǔ)配對結(jié)合，即開始常規(guī)的單重對稱PCR過程，產(chǎn)生大量雙鏈DNA片段；圖4為甲型流感病毒H1亞型型別感染樣本檢測結(jié)果圖；圖5為甲型流感病毒H3亞型型別感染樣本檢測結(jié)果圖；圖6為甲型流感病毒H5亞型型別感染樣本檢測結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。以下實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。實(shí)施例1：本發(fā)明試劑盒的組成及主要原材料的廠商和規(guī)格1.運(yùn)用連接酶檢測甲型流感病毒系列的試劑盒組成如下：組成成分規(guī)格數(shù)量主要成分RNA提取液1300ul/管1管Tris、EDTA連接反應(yīng)管10ul/管24管甲型流感病毒H1、H3、H5、H7亞型各型別的上下游連接引物、連接酶熒光PCR反應(yīng)管30ul/管24管熱啟動Taq酶、UDG酶、通用引物、甲型流感病毒(H1、H3、H5、H7)亞型各型別的特異性熒光探針陰性質(zhì)控品100ul/管1管滅菌純化水陽性質(zhì)控品100ul/管1管滅活的甲型流感病毒H1亞型樣本其中，連接引物包括上述SEQIDNO：1～8序列，通用引物包括上述SEQIDNO：9～10序列，熒光探針包括上述SEQIDNO：11～14序列。上述探針1～4的3’端連接有MGB，5’端連接有熒光基團(tuán)，其中，探針1連接的熒光基團(tuán)為FAM，探針2連接的熒光基團(tuán)為HEX，探針3連接的熒光基團(tuán)為TEXASRED，探針4連接的熒光基團(tuán)為CY5。上述運(yùn)用連接酶檢測甲型流感病毒系列試劑盒中所使用的連接酶系統(tǒng)中，每人份體系含連接酶1U。上述運(yùn)用連接酶檢測甲型流感病毒系列試劑盒中所使用的熱啟動Taq酶系統(tǒng)含有經(jīng)過化學(xué)修飾的熱啟動Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份體系中熱啟動Taq酶為6U，dNTPs為20mmol/L，UDG酶為0.1U。上述運(yùn)用連接酶檢測甲型流感病毒系列試劑盒還設(shè)有RNA提取液，RNA提取液的組成成分為EDTA的濃度為0.001mol/L，Tris的濃度為0.01mol/L。2.本發(fā)明試劑盒主要原材料的廠商和規(guī)格實(shí)施例2：本發(fā)明試劑盒的使用方法1.樣本處理與RNA提取1）震蕩咽拭子保存管10-30秒（使細(xì)胞充分落入液體），取脫落細(xì)胞樣本0.5ml-1.0ml（如果細(xì)胞數(shù)量少可以加大體積到2.0ml）2）編好號的樣品10,000rpm離心3分鐘，棄上清；3）樣品沉淀中加入1ml滅菌生理鹽水，洗滌沉淀，10,000rpm離心3分鐘，棄上清；4）樣品沉淀中加入50μlRNA提取液，震蕩60秒，充分懸浮細(xì)胞沉淀，備用；RNA的提取也可以使用其他公知的方法進(jìn)行。5）質(zhì)控品處理取裝有陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的離心管，10,000rpm離心30秒，然后按（2）～（4）的提取步驟操作。2.連接試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)，冰上操作）1）從試劑盒中取出連接反應(yīng)管，瞬時離心備用；2）往上述反應(yīng)管中分別加入提取后的待測樣本核酸10μl（如樣本不足10μl，請用滅菌純化水補(bǔ)足10μl后加樣）、提取后的陰性質(zhì)控品10μl及提取后的陽性質(zhì)控品10μl。蓋緊管蓋，5000rpm離心30秒后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測區(qū)。3.連接條件（PCR儀上操作）PCR儀設(shè)置參數(shù)為：37℃，5min；65℃，20min。反應(yīng)條件結(jié)束后，取出連接酶反應(yīng)管（連接產(chǎn)物）置于2-8℃保存（連接產(chǎn)物如需長期保存，可置于-20±5℃）。4.核酸擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)，冰上操作）1）從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)管，瞬時離心備用；2）往上述反應(yīng)管中加入連接產(chǎn)物10μl（包括連接后的陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品）。蓋緊管蓋，5000rpm離心30秒后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測區(qū)。5.PCR擴(kuò)增PCR儀設(shè)置參數(shù)為：50℃，3min；95℃，5min；95℃，5s，56℃，31s，循環(huán)45次。在56℃時測定熒光值。根據(jù)熒光值變化曲線，確定檢測結(jié)果。質(zhì)量控制樣品名稱FAM通道HEX通道TEXASRED通道CY5通道結(jié)果陰性質(zhì)控品無明顯對數(shù)擴(kuò)增曲線無明顯對數(shù)擴(kuò)增曲線無明顯對數(shù)擴(kuò)增曲線無明顯對數(shù)擴(kuò)增曲線陰性陽性質(zhì)控品有明顯對數(shù)擴(kuò)增曲線，Ct≤37無明顯對數(shù)擴(kuò)增曲線無明顯對數(shù)擴(kuò)增曲線無明顯對數(shù)擴(kuò)增曲線甲型流感病毒H1亞型陽性實(shí)施例3：本發(fā)明試劑盒的參考值設(shè)定依據(jù)及臨床樣本檢測情況使用本試劑盒和對照試劑盒對臨床樣本進(jìn)行檢測，兩者不符的使用復(fù)核試劑盒進(jìn)行檢測，并根據(jù)對照與復(fù)核檢測結(jié)果將樣本分為陽性組和陰性組，對比本試劑盒檢測的Ct值，從而確定本試劑盒參考值，當(dāng)本試劑盒Ct值大于37時，均屬于陰性組，當(dāng)本試劑盒Ct值小于等于37時，均屬于陽性組。因此，將Ct值大于37作為本試劑盒的參考值（CUTOFF值）。使用本發(fā)明檢測試劑盒的檢測結(jié)果示意圖如圖4～6所示。從圖中可以清楚地看出，本發(fā)明的檢測試劑盒可以有效地檢測出甲型流感病毒中的H1、H3、H5、H7亞型，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效技術(shù)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司<120>一種運(yùn)用連接酶檢測甲型流感病毒系列的試劑盒<130>2016<160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>1cgcaaggtttccacatcatcgtgtggttgggccatgagct40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>2ttctttggggaatatttcgacctgtgtggcattgttatcg40<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcaaggtttccacatcatcgtcattgggaatgcttccat40<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>4ttggagtgatgcattcagaacctgtgtggcattgttatcg40<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>5cgcaaggtttccacatcatccaatgatcgagttgacctta40<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>6ttggtgactccatctactgccctgtgtggcattgttatcg40<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>7cgcaaggtttccacatcatccatgatgccccgaagctaa39<210>8<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>8accaaagtatcacatctttgtcctgtgtggcattgttatcg41<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9cgcaaggtttccacatcatc20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10cgataacaatgccacacagg20當(dāng)前第1頁1 2 3