本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬偽狂犬病焦磷酸測序檢測方法及專用引物。

背景技術(shù)：

豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多種家畜和野生動(dòng)物均可感染的急性傳染病，以發(fā)熱、流產(chǎn)、死產(chǎn)、奇癢(豬除外)和腦脊髓炎為主要癥狀，其中對豬的危害最大，且豬是唯一的自然宿主。該病1813年首次發(fā)生于美國，隨后波及歐美等國家地區(qū)，現(xiàn)該病已呈世界性流行。自2012年下半年以來，我國PR發(fā)病率明顯上升，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

豬偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒科，又稱豬皰疹病毒Ⅰ型。迄今為止，在豬偽狂犬病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了11種糖蛋白，其中，除gG是外分泌蛋歸之外，其它10種結(jié)構(gòu)蛋白均定位于囊膜上。其中g(shù)D是PRV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它不但誘導(dǎo)體液免疫，而且誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，同時(shí)是病毒粒子表面的病毒感染細(xì)胞的主要分子，在病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。

傳統(tǒng)的疫病病原診斷方法包括病毒分離與鑒定、分子生物學(xué)等方法在疫病的檢測方法發(fā)揮了巨大的作用，但同時(shí)也具備一些無法滿足快速準(zhǔn)確的檢測要求的缺陷，即無法獲得分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)——基因序列，從而可能造成假陽性的結(jié)果。如需要進(jìn)行陽性結(jié)果確認(rèn)，則必須將所擴(kuò)增目的片段連接于特定的測序載體上，轉(zhuǎn)化、挑取陽性克隆后才能得以完成測序確證，費(fèi)時(shí)耗力。

焦磷酸測序技術(shù)是近年來較為先進(jìn)的定量序列測定的短鏈測序技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量樣品直觀的序列分析。通過焦磷酸測序技術(shù)可以獲得分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)——基因序列，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)；尤其使得在不具備獸醫(yī)生物安全級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室，可以運(yùn)用該方法對病毒快速鑒定分型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測豬偽狂犬病毒的成套引物。

本發(fā)明提供的成套引物，包括如下引物對：

所述引物對由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成。

上述成套引物中，所述引物對中的一條引物末端生物素標(biāo)記。

上述成套引物中，所述成套引物還包括核苷酸序列為序列表中序列3的測序引物。

含有上述成套引物的成套PCR試劑或含有所述成套引物或所述成套PCR試劑的試劑盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或序列4第81-135位所示的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；。

上述的成套PCR試劑中，

所述成套PCR試劑由PCR試劑1和PCR試劑2組成；

所述PCR試劑1為含有上述成套引物中所述引物對的試劑；

或，所述引物對中每條引物在所述PCR試劑1中的濃度為20μM；

所述PCR試劑2為含有上述成套引物中所述測序引物的試劑；

或，所述測序引物在所述PCR試劑2中的濃度為0.3μM。

上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒或序列4第81-135位所示的DNA分子在檢測或輔助檢測豬偽狂犬病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或，上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒或序列4第81-135位所示的DNA分子在制備檢測或輔助檢測豬偽狂犬病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或，上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒或序列4第81-135位所示的DNA分子在檢測或輔助檢測待測樣本中是否含有豬偽狂犬病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或，上述成套引物或上述的成套PCR試劑或試劑盒或序列4第81-135位所示的DNA分子在制備檢測或輔助檢測待測樣本中是否含有豬偽狂犬病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣本中是否含有豬偽狂犬病毒的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)用序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對對待測樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

2)用核苷酸序列為序列表中序列3的測序引物對所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果；

若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與序列4第81-135位所示的DNA分子的同源性大于等于80％，則所述待測樣本中含有或候選含有豬偽狂犬病病毒，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與序列4第81-135位所示的DNA分子的同源性小于80％，則所述待測樣本中不含有或不候選含有豬偽狂犬病病毒。

本發(fā)明第3個(gè)目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣本中是否含有豬偽狂犬病毒的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

檢測待測樣本的核酸中是否含有序列4第81-135位所示的DNA分子或與其同源性大于等于80％的DNA分子，若含有，則所述待測樣本含有或候選含有豬偽狂犬病毒，若不含有，則所述待測樣本不含有或候選不含有豬偽狂犬病毒。

上述方法中，所述檢測待測樣本的核酸中是否含有序列4第81-135位所示的DNA分子或與其同源性大于等于80％的DNA分子的方法包括如下步驟：權(quán)利要求7的步驟1)和步驟2)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果，分析所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果是否含有序列4第81-135位所示的DNA分子。

上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為55℃，退火時(shí)間為30S；

或，所述PCR擴(kuò)增的模板為所述待測樣本的核酸。

本發(fā)明以PRV gD蛋白基因保守序列為研究對象，設(shè)計(jì)一對通用擴(kuò)增引物及一條帶有生物素標(biāo)記的測序引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得純度較高的PCR產(chǎn)物后進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)，獲得一段特異性強(qiáng)的短序列，這段序列可以作為PRV鑒定的靶序列，直接從這段基因序列上就可以判定PRV。該方法可作為豬偽狂犬病的常規(guī)篩查診斷，提高了檢測效率，避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，直觀的從基因序列上對PRV進(jìn)行鑒定，較快的對PRV的感染豬進(jìn)行篩查鑒定。

附圖說明

圖1為PRV gD基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

圖2為PRV gD蛋白基因焦磷酸測序結(jié)果。

圖3為PRV gD基因的PCR/RT-PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果。

圖4為焦磷酸測序的靈敏度結(jié)果。

圖5為焦磷酸測序重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果。

圖6為常規(guī)檢測方法試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等病毒樣本及核酸樣本由山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所、山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心和山東臨沂金鑼新程牧業(yè)有限公司提供。PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit、TaKaRa ExHot Start Version、100bp DNA Ladder Marker及相應(yīng)試劑等購自大連TaKaRa公司；焦磷酸測序儀PyroMarkTM ID System和Vacuum Prep Tool均購自瑞典Biotage公司；Streptavidin Sepharose beads(鏈霉親和素包被磁珠，產(chǎn)品貨號(hào)65305)購自Invitrogen公司、PyroGold SQA Reagents 1×96DNA序列分析試劑盒(包括Enzyme mixture、Substrate mixture、dATPαS、dGTP、dCTP、dTTP)、Annealing Buffer(退火緩沖液，產(chǎn)品貨號(hào)979009)、Binding buffer(結(jié)合緩沖液，產(chǎn)品貨號(hào)979006)、Denatureation buffer(變性緩沖液，產(chǎn)品貨號(hào)979007)、Washing buffer(洗滌緩沖液，產(chǎn)品貨號(hào)979008)等均為QIAGEN公司產(chǎn)品。磁珠法RNA提取試劑盒及核酸提取儀由西安天隆科技有限公司提供。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。

實(shí)施例1、鑒定PRV的焦磷酸測序檢測專用引物的設(shè)計(jì)及方法的建立

一、鑒定PRV的焦磷酸測序檢測專用引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中公布的PRV gD蛋白基因的保守序列的部分片段(序列4)，設(shè)計(jì)一對通用擴(kuò)增引物F和R(F位于序列4的第58-75位；R位于序列4的第128-145位)及測序引物S(序列4的第66-80位)(如表1所示)，其中引物R在其5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記，預(yù)期擴(kuò)增片段(序列4第81-135位)大小為88bp。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1為PRV的擴(kuò)增引物及測序引物

二、鑒定PRV的焦磷酸測序檢測方法的建立

1、病毒核酸DNA的提取

將收集的PRV病毒(陳超，劉存、李海娥等的《山東省免疫豬場豬偽狂犬病病毒分離鑒定及gE毒力基因的序列分析》，中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016,36(6)：902-907)樣本利用磁珠核酸提取法提取核酸，提取的DNA立即用于PCR擴(kuò)增或置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、PCR反應(yīng)

以病毒DNA為模板，用上述一設(shè)計(jì)的上游引物F和下游引物R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到88bp大小的PCR產(chǎn)物。

上述PCR反應(yīng)體系(50μL)為：TaKaRa Ex Taq HS(5units/μL)0.25μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(2.5mM each)4μL，引物F(20μM，反應(yīng)體系中的終濃度為0.4μM)1μL，引物R(20μM，反應(yīng)體系中的終濃度為0.4μM)1μL，模板DNA 4μL，ddH2O 34.75μL。

上述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：98℃10s，55℃30s，72℃1min，45個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

結(jié)果如圖1所示，M為100bp DNA Ladder Marker；1為PCR擴(kuò)增片段；可以看出，擴(kuò)增片段大小為88bp，與預(yù)期目的片段大小一致，且測序結(jié)果分析表明該目的條帶與PRV gD蛋白基因片段同源性達(dá)100％。

3、測序單鏈模板的制備

按照Gene Company Limited公司的焦磷酸測序反應(yīng)操作說明制備測序單鏈模板，在50μL上述1得到的PCR產(chǎn)物中加入含有200μg鏈霉親和素包被磁珠的結(jié)合緩沖液(Binding buffer)，常溫震蕩混勻10min，將vacuum prep tool(真空泵)在超純水中清洗30s后抓取與PCR產(chǎn)物結(jié)合的磁珠，然后用70％乙醇清洗5s；Denatureation buffer(變性緩沖液)洗5s；最后移到Washing buffer(洗滌緩沖液)中清洗10s，將vacuum prep tool(真空泵)放入預(yù)先含有0.3μM測序引物的退火緩沖液的PSQ 96孔板中，搖動(dòng)，釋放磁珠。將此PSQ 96孔板置于熱循環(huán)儀上80℃2min，取出自然冷卻至室溫，得到測序單鏈模板。

4、焦磷酸測序反應(yīng)

依據(jù)焦磷酸測序儀的說明來設(shè)定程序及程序給定的劑量，在試劑艙中相應(yīng)的孔中加入PyroGold SQA Reagents 1×96DNA序列分析試劑盒提供的酶混合物(DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)、底物APS以及四種dNTP(dATPαS、dCTP、dGTP、dTTP)，將試劑艙和上述3獲得的放有測序單鏈模板的96孔板放入焦磷酸測序儀中進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)，得到PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果(序列4第81-135位)：ACGGCGTGAACGTCCTCACC GACTTCATGGTGGCGCTCCCCGAGGGGCAAGAGTG。

經(jīng)在線BLAST序列同源性分析，該序列結(jié)果證實(shí)屬于PRV gD蛋白基因，與預(yù)期測序結(jié)果(序列4第81-135位)一致，符合率高達(dá)100％。

若待測樣本PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與序列4第81-135位所示的DNA分子序列的相似性大于等于80％，表明兩者屬于同源基因，說明待測樣本中含有或候選含有豬偽狂犬病病毒，若待測樣本PCR測序結(jié)果與序列4第81-135位所示的DNA分子序列的相似性小于80％，則表明兩者不屬于同源基因，說明待測樣本中不含有或不候選含有豬偽狂犬病病毒。

該序列能夠作為PRV快速鑒定的靶序列，其焦磷酸測序結(jié)果與普通Sanger測序結(jié)果完全一致，符合率為100％，試驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確性和特異性(如圖2所示)。

實(shí)施例2、焦磷酸測序的特異性試驗(yàn)

分別以PRV、PEDV、TGEV、PRRSV的核酸樣品為模板，按照實(shí)施例1的二的方法進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)，得到焦磷酸測序產(chǎn)物。

焦磷酸測序產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3所示，M:100bp DNA Ladder Marker；1:PRRSV；2:PEDV；3:PPV；4:PRV，可以看出，只有PRV獲得了目的序列的結(jié)果。

焦磷酸測序產(chǎn)物送去測序，結(jié)果只有PRV的焦磷酸測序產(chǎn)物測序結(jié)果與目的序列片段(序列4第81-135位)符合率為100％；其他病毒的核酸樣品未獲得任何序列結(jié)果，特異性表明實(shí)施例1的成套引物具有較好的特異性。

實(shí)施例3、焦磷酸測序的靈敏度試驗(yàn)

將PRV核酸樣本(200ng/μL)分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，以此為模板，按照實(shí)施例1的二的方法進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)，得到焦磷酸測序產(chǎn)物。

焦磷酸測序產(chǎn)物電泳，結(jié)果如圖4所示，M:100bp DNA Ladder Marker；1-7:分別是模板稀釋度為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7；PCR的最低核酸檢測限為0.2pg/μL(稀釋度為10^-6時(shí))，此時(shí)所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可以用于焦磷酸測序，得到較好的序列結(jié)果。

由于進(jìn)行焦磷酸測序需要先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，故焦磷酸測序的靈敏度也即是PCR擴(kuò)增的靈敏度，依此來判定焦磷酸測序的靈敏度。

實(shí)施例3、重復(fù)性試驗(yàn)

將實(shí)施例1的二的2擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物(焦磷酸反應(yīng)前的擴(kuò)增產(chǎn)物)分別進(jìn)行3次焦磷酸測序，比較序列結(jié)果，確定該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行3次重復(fù)性上機(jī)檢測，檢測結(jié)果如圖5所示，a、b、c分別為3次重復(fù)性上機(jī)檢測結(jié)果，可以看出，3次測序結(jié)果均一致，證明該方法具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

實(shí)施例4、焦磷酸測序檢測方法在臨床樣品中的比對應(yīng)用

1、本發(fā)明的焦磷酸測序檢測方法

對臨床采集疑似PEDV的20個(gè)樣本(病料、體液、組織液、血液等樣本)提取DNA，并以此為模板按照實(shí)施例2的一的方法進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)，得到焦磷酸測序反應(yīng)產(chǎn)物。

將焦磷酸測序反應(yīng)產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，與目標(biāo)序列序列4相比，20個(gè)樣本中16個(gè)同源性為100％，其余4個(gè)樣本同源性不為100％，因此，確診16個(gè)PRV陽性，4個(gè)PRV陰性。

2、常規(guī)檢測方法

對臨床采集疑似PEDV的20個(gè)樣本(病料、體液、組織液、血液等樣本)提取DNA，并以此為模板，用國標(biāo)GB/T 18641-2002中的提到的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物對(覆蓋了序列4整個(gè)DNA序列)擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

引物對F1：CAGGAGGACGAGCTGGGGCT；

R1：GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳如圖6所示，M:DNA Marker 2,000,條帶從上往下依次為2000，1000,750,500,250,100bp；-和+分別為陰性和陽性對照；1-20分別為樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，可以看出，6,14,20為陰性，其余為陽性結(jié)果，共有17個(gè)陽性條帶，3個(gè)陰性條帶，再將陽性產(chǎn)物送到專業(yè)測序公司進(jìn)行測序鑒定，經(jīng)測序驗(yàn)證后證明19為假陽性，為陰性結(jié)果(可能存在樣本污染或出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增而致)，沒有測出目的序列，最終確定有16個(gè)陽性，4個(gè)陰性。

通過兩種方法比較，兩者結(jié)果最終一致，但是本發(fā)明的焦磷酸測序方法獲得的結(jié)果快速準(zhǔn)確，節(jié)約檢測時(shí)間，結(jié)果一目了然，從上機(jī)后的結(jié)果中直觀的看到序列結(jié)果，無需進(jìn)一步驗(yàn)證即可進(jìn)行判定，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

序列表

<110>中華人民共和國濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局

<120>豬偽狂犬病焦磷酸測序檢測方法及專用引物

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gtaccggcgc ctggtgtc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ggcgaacggg cactcttg 18

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gcctggtgtc cgtcg 15

<210> 4

<211> 217

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

cacggaggac gagctggggc tgctcatggt ggccccgggg cggttcaacg agggccagta 60

ccggcgcctg gtgtccgtcg acggcgtgaa cgtcctcacc gacttcatgg tggcgctccc 120

cgaggggcaa gagtgcccgt tcgcccgcgt ggaccaacac cgcacgtaca agttcggcgc 180

gtgctggagc gacgacagct tcaagcgggg cgtggac 217