本發(fā)明涉及一種用于鑒定牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物組及其應用。

背景技術：

牛支原體(Mycoplasma bovis，MB)主要引起牛呼吸困難、氣喘、咳嗽，同時還可引起關節(jié)炎、乳房炎、生殖道炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎等。謝建華等人在2008-2013年間對重慶地區(qū)1606份牛血清樣品進行檢測，結(jié)果顯示MB陽性率為49.00％。郭澍強等人對寧夏16個規(guī)?；B(yǎng)殖場的460份牛血清進行了牛支原體抗體的檢測,結(jié)果顯示MB陽性率為32.17％。

牛傳染性鼻氣管炎病毒(bovine herpesvirusⅠ，IBRV)又稱為傳染性牛鼻氣管炎病毒，主要引起牛高熱、鼻炎、呼吸困難和母畜流產(chǎn)等疾病。該病影響牛群的繁殖和產(chǎn)奶，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，我國將其列為二類動物疫病。韓照清等人在2011年間采自西藏(988份)、青海(475份)和四川(377份)共1840份牦牛血清樣品進行牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體檢測，結(jié)果IBRV陽性率分別為38.6％、44.6％、27.9％。孫慶宇等人(2014年)在內(nèi)蒙古地區(qū)16個奶牛養(yǎng)殖場的2321頭奶牛進行牛傳染性鼻氣炎血清流行病學調(diào)查，結(jié)果顯示IBRV平均陽性率為75.7％。張弦等人(2015年)對上海地區(qū)19個規(guī)?；翀龉?20份血清樣品進行IBRV血清抗體檢測,結(jié)果表明IBRV抗體陽性率為46.74％。李永琴等(2016年)對寧夏地區(qū)18個規(guī)模化奶牛場470份血清進行牛傳染性鼻氣管炎的血清學調(diào)查，結(jié)果顯示平均陽性率達到71.9％。

牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒均能引起牛呼吸道疾病，臨床癥狀態(tài)相似難以區(qū)分，因此急需建立牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒的快速檢測技術，為牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒的防控提供技術支持。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物組及其應用。

本發(fā)明首先保護一種引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物對甲和引物對乙組成；

(a2)所述引物對甲；

(a3)所述引物對乙；

所述引物對甲由引物F1和引物R1組成；

所述引物F1為如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(b2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R1為如下(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(b4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物對乙由引物F2和引物R2組成；

所述引物F2為如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(c2)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物R2為如下(c3)或(c4)：

(c3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

(c4)將序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子。

所述引物組合的用途為如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鑒別牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒；

(d2)鑒定待測病原微生物是否為牛支原體或牛傳染性鼻氣管炎病毒；

(d3)鑒定待測樣本是否感染了牛支原體和/或牛傳染性鼻氣管炎病毒。

本發(fā)明還保護所述引物組合在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒的用途為如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鑒別牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒；

(d2)鑒定待測病原微生物是否為牛支原體或牛傳染性鼻氣管炎病毒；

(d3)鑒定待測樣本是否感染了牛支原體和/或牛傳染性鼻氣管炎病毒。

本發(fā)明還保護含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鑒別牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒；

(d2)鑒定待測病原微生物是否為牛支原體或牛傳染性鼻氣管炎病毒；

(d3)鑒定待測樣本是否感染了牛支原體和/或牛傳染性鼻氣管炎病毒。

本發(fā)明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。

本發(fā)明還保護一種鑒別待測病原微生物為牛支原體還是牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測病原微生物的核酸；

(2)以步驟(1)得到的核酸為模板，采用所述引物對甲和所述引物對乙進行二重二溫式PCR，然后進行如下判斷：如果得到大小為412bp的擴增產(chǎn)物，待測病原微生物為牛支原體；如果得到大小為727bp的擴增產(chǎn)物，待測病原微生物為牛傳染性鼻氣管炎病毒。

所述待測病原微生物為牛支原體或牛傳染性鼻氣管炎病毒。

本發(fā)明還保護一種鑒定待測病原微生物是否為牛支原體或牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測病原微生物的核酸；

(2)以步驟(1)得到的核酸為模板，采用所述引物對甲和所述引物對乙進行二重二溫式PCR，然后進行如下判斷：如果得到大小為412bp的擴增產(chǎn)物，待測病原微生物為或候選為牛支原體；如果得到大小為727bp的擴增產(chǎn)物，待測病原微生物為或候選為牛傳染性鼻氣管炎病毒。

本發(fā)明還保護一種鑒定待測樣本是否感染牛支原體和/或牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測樣本的核酸；

(2)以步驟(1)得到的核酸為模板，采用所述引物對甲和所述引物對乙進行二重二溫式PCR，然后進行如下判斷：如果得到大小為412bp的擴增產(chǎn)物，待測樣本感染或疑似感染牛支原體；如果得到大小為727bp的擴增產(chǎn)物，待測樣本感染或疑似感染牛傳染性鼻氣管炎病毒。

本發(fā)明還保護一種鑒別待測病原微生物為牛支原體還是牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：檢測待測病原微生物的核酸中是否具有序列表的序列5所示的特異DNA分子或是否具有序列表的序列6所示的特異DNA分子，如果待測病原微生物的核酸中具有序列表的序列5所示的特異DNA分子、待測病原微生物為牛支原體，如果待測病原微生物的核酸中具有序列表的序列6所示的特異DNA分子、待測病原微生物為牛傳染性鼻氣管炎病毒。所述待測病原微生物為牛支原體或牛傳染性鼻氣管炎病毒。

本發(fā)明還保護一種鑒定待測病原微生物是否為牛支原體或牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：檢測待測病原微生物的核酸中是否具有序列表的序列5所示的特異DNA分子或是否具有序列表的序列6所示的特異DNA分子，如果待測病原微生物的核酸中具有序列表的序列5所示的特異DNA分子、待測病原微生物為或候選為牛支原體，如果待測病原微生物的核酸中具有序列表的序列6所示的特異DNA分子、待測病原微生物為或候選為牛傳染性鼻氣管炎病毒。

本發(fā)明還保護一種鑒定待測樣本是否感染牛支原體和/或牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，包括如下步驟：檢測待測樣本的核酸中是否具有序列表的序列5所示的特異DNA分子和/或是否具有序列表的序列6所示的特異DNA分子，如果待測樣本的核酸中具有序列表的序列5所示的特異DNA分子、待測樣本感染或疑似感染牛支原體，如果待測樣本的核酸中具有序列表的序列6所示的特異DNA分子、待測樣本感染或疑似感染牛傳染性鼻氣管炎病毒。

以上任一所述待測病原微生物為牛支原體、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、藍舌病病毒、牛輪狀病毒或小反芻獸疫病毒。所述牛病毒性腹瀉病毒為牛病毒性腹瀉病毒Oregon株、牛病毒性腹瀉病毒NADL株或牛病毒性腹瀉病毒牦牛株。所述口蹄疫病毒為口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒O型或口蹄疫病毒AsiaⅠ型。所述水泡性口炎病毒為水泡性口炎病毒NJ型或水泡性口炎病毒IND型。所述藍舌病病毒為藍舌病病毒血清4型、藍舌病病毒血清8型、藍舌病病毒血清9型、藍舌病病毒血清15型、藍舌病病毒血清17型或藍舌病病毒血清18型。所述牛輪狀病毒為牛輪狀病毒NCDV株或牛輪狀病毒014株。所述小反芻獸疫病毒為小反芻獸疫病毒Nigeria75/1株。

以上任一所述牛支原體為牛支原體GL-1株或牛支原體BS-1株。以上任一所述牛傳染性鼻氣管炎病毒為傳染性牛鼻氣管炎病毒Nu/67株。

以上任一所述待測樣本為離體的動物組織，例如牛肉、牛肉加工制成的食品、牛內(nèi)臟，牛內(nèi)臟加工制成的食品等等。

以上任一所述核酸為DNA和RNA的混合物。

以上任一所述提取待測樣本的核酸為使用RNA/DNA共提試劑盒提取得到的核酸。

以上任一所述核酸為基因組DNA。

以上任一所述提取待測樣本的核酸為進行基因組DNA提取得到的核酸。

以上任一所述二重二溫式PCR的退火延伸溫度為55℃～68℃，優(yōu)選為67℃。以上任一所述二重二溫式PCR的最優(yōu)反應程序為：42℃30min；94℃5min；94℃30s、67℃30s，35個循環(huán)；72℃10min。。

以上任一所述二重二溫式PCR的初始反應體系為(25μL)：MgCl₂ 1～10mmol/L、Taq DNA Polymerase 1～5U、dNTP 0.1～0.8mmol/L、每條引物1～10pmol/μL。以上任一所述二重二溫式PCR的最優(yōu)初始反應體系為(25μL)：MgCl₂ 1.5mmol/L、Taq DNA Polymerase 2.5U、dNTP 0.2mmol/L、引物F1 1pmol/μL、引物R1 1pmol/μL、引物F2 1pmol/μL、引物R2 1pmol/μL、10×buffer 2.5μL、模板1μL，余量為水。

多重PCR是一種高效的PCR，可在同一個PCR反應管內(nèi)，同時鑒別檢測多種病原體，在多種病原混合感染的鑒別診斷上具有很高的優(yōu)勢和臨床實用價值。二溫式PCR是在常規(guī)PCR基礎上發(fā)展而成的更簡便的PCR檢測技術，二溫式PCR將退火和延伸在同一溫度下完成，退化溫度比常規(guī)三溫式PCR的高，因此不僅提高了PCR的特異性，且二溫式PCR省略了反復升溫降溫的時間消耗，節(jié)省時間，提高疾病的診斷效率。本發(fā)明提供的方法，全程只需一次抽提、一次PCR、一次電泳即可檢測兩種病原，非常適合混合感染的樣品，省時省力。

近幾年養(yǎng)牛飼業(yè)規(guī)模的不斷擴大，疫病防治工作正面臨著前所未有的壓力，需要簡便、快速、高通量檢測技術以保證養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。本發(fā)明提供了用于鑒定牛支原體(MB)的引物對甲和用于鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)的引物對乙，并基于兩個引物對開發(fā)了二重二溫式PCR方法。采用引物對甲和引物對乙，通過二重二溫式PCR檢測牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒，具有特異性好、靈敏度高、普適性好、方便快速等優(yōu)點，可用于臨床鑒別診斷和流行病學調(diào)查。本發(fā)明為牛病的防控提供了新的技術方法，具有很高的臨床應用價值。

附圖說明

圖1為實施例4的結(jié)果。

圖2為實施例5的結(jié)果。

圖3為實施例6的結(jié)果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。RNA/DNA共提試劑盒：大連寶生物公司。pEASY-T1載體：大連寶生物公司。實施例中用到的各個毒株見表1。

表1

實施例1、引物的設計

對牛支原體的基因組DNA以及牛傳染性鼻氣管炎病毒的基因組DNA進行序列分析，在序列分析的基礎上選擇靶點并設計引物，得到由數(shù)千個引物對組成的引物對庫。對引物對庫中的各個引物對一一進行預實驗，檢測引物對的靈敏度、特異性和普適性，最終得到用于鑒定牛支原體的的引物對甲和用于鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物對乙。

引物對甲由如下引物F1和引物R1組成(5’→3’)：

F1(序列表的序列1)：GCAACATGAAACCTTATACGA；

R1(序列表的序列2)：ATCCTCATAGAATTGTTCAAAGA。

引物對乙由如下引物F2和引物R2組成(5’→3’)：

F2(序列表的序列3)：CGGCGTCATTTACAAGGAGAA；

R2(序列表的序列4)：GGCCGTGAAGCGGAAGTT。

引物對甲的靶序列為412bp。引物對乙的靶序列為727bp。

實施例2、參數(shù)優(yōu)化

引物對甲和引物對乙進行二重二溫式PCR的參數(shù)優(yōu)化。被優(yōu)化的參數(shù)包括反應體系的參數(shù)和反應程序的參數(shù)。反應體系的參數(shù)包括(25μL)：初始反應體系中，MgCl₂的濃度、Taq DNA Polymerase的含量、dNTP的濃度、各條引物的濃度。反應程序的參數(shù)包括：退火延伸溫度。

建議初始反應體系為(25μL)：MgCl₂ 1～10mmol/L、Taq DNA Polymerase 1～5U、dNTP 0.1～0.8mmol/L、每條引物1～10pmol/μL。最優(yōu)初始反應體系為(25μL)：MgCl₂1.5mmol/L、Taq DNA Polymerase 2.5U、dNTP 0.2mmol/L、引物F1 1pmol/μL、引物R1 1pmol/μL、引物F2 1pmol/μL、引物R2 1pmol/μL、10×buffer 2.5μL、模板1μL，余量為水。

建議退火延伸溫度為55℃～68℃。最優(yōu)退火延伸溫度為67℃。最優(yōu)反應程序為：42℃30min；94℃5min；94℃30s、67℃30s，35個循環(huán)；72℃10min。

實施例3、方法的建立

1、采用RNA/DNA共提試劑盒提取待測樣本的核酸。

2、取步驟1得到的核酸，作為模板，進行二重二溫式PCR。

初始反應體系為(25μL)：MgCl₂ 1.5mmol/L、Taq DNA Polymerase 2.5U、dNTP 0.2mmol/L、引物F1 1pmol/μL、引物R1 1pmol/μL、引物F2 1pmol/μL、引物R2 1pmol/μL、10×buffer 2.5μL、模板1μL，余量為水。

反應程序為：42℃30min；94℃5min；94℃30s、67℃30s，35個循環(huán)；72℃10min。

3、取步驟2的產(chǎn)物，進行1％瓊脂糖凝膠電泳。

實施例4、特異性實驗

待測樣本為：表1中的所有DNA病毒、表1中的所有RNA病毒的cDNA(將每個RNA病毒提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA)，以及牛支原體BS-1株和傳染性牛鼻氣管炎病毒Nu/67株的混合物。

按照實施例3建立的方法進行檢測。

設置用牛肉作為待測樣本的陰性對照。

部分結(jié)果見圖1。圖1中，M對應DNA marker(100bp ladder)，1對應傳染性牛鼻氣管炎病毒Nu/67株，2對應牛支原體BS-1株，3對應混合物，4對應口蹄疫病毒A型，5對應水泡性口炎病毒NJ型，6對應藍舌病病毒血清4型，7對應牛病毒性腹瀉病毒Oregon株，8對應牛輪狀病毒NCDV株，9對應小反芻獸疫病毒Nigeria75/1株，10對應陰性對照。

牛支原體GL-1株、牛支原體BS-1株均在300bp-500bp之間顯示特異性條帶，經(jīng)測序均為412bp。傳染性牛鼻氣管炎病毒Nu/67株在700bp-800bp之間顯示特異性條帶，經(jīng)測序均為727bp?；旌衔镲@示兩條特異條帶，經(jīng)測序，一條為412bp，另一條為727bp。其他各個毒株均不顯示任何條帶。

結(jié)果表明，采用引物對甲和引物對乙通過二重二溫式PCR檢測牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒具有如下優(yōu)點：對其它病毒不存在非特異性擴增，對宿主動物(牛)不存在非特異性擴增，特異性優(yōu)良；對牛支原體具有良好的普適性，各個毒株得到412bp的擴增產(chǎn)物；可以實現(xiàn)對牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒混合樣本的檢測，并同時讀出結(jié)果。

實施例5、敏感性實驗

將序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子，克隆入pEASY-T1載體，得到標準品質(zhì)粒甲。

將序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子，克隆入pEASY-T1載體，得到標準品質(zhì)粒乙。

以標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙為溶質(zhì)，以雙蒸水為溶劑，得到各個標準品溶液。標準品溶液1中，標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙的濃度均為1×10⁸拷貝/μL。標準品溶液2中，標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙的濃度均為1×10⁷拷貝/μL。標準品溶液3中，標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙的濃度均為1×10⁶拷貝/μL。標準品溶液4中，標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙的濃度均為1×10⁵拷貝/μL。標準品溶液5中，標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙的濃度均為1×10⁴拷貝/μL。標準品溶液6中，標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙的濃度均為1×10³拷貝/μL。標準品溶液7中，標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙的濃度均為1×10²拷貝/μL。標準品溶液8中，標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙的濃度均為10拷貝/μL。標準品溶液9中，標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙的濃度均為1拷貝/μL。

以標準品溶液為模板，按照實施例3建立的方法(步驟2和步驟3)進行檢測。

結(jié)果見圖2。圖2中，M對應DNA marker(100bp ladder)，1至9依次對應標準品溶液1至標準品溶液9。

結(jié)果表明，采用引物對甲和引物對乙通過二重二溫式PCR檢測牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒具有如下優(yōu)點：對牛支原體的的最低檢測限為10000個拷貝，對牛傳染性鼻氣管炎病毒的最低檢測限為10000個拷貝。

實施例6、干擾性實驗

以實施例5制備的標準品質(zhì)粒甲和標準品質(zhì)粒乙為溶質(zhì)，以雙蒸水為溶劑，得到各個樣品溶液。樣品溶液A中，標準品質(zhì)粒甲的濃度為10⁴拷貝/μL，標準品質(zhì)粒乙的濃度為10⁸拷貝/μL。樣品溶液B中，標準品質(zhì)粒甲的濃度為10⁵拷貝/μL，標準品質(zhì)粒乙的濃度為10⁷拷貝/μL。樣品溶液C中，標準品質(zhì)粒甲的濃度為10⁶拷貝/μL，標準品質(zhì)粒乙的濃度為10⁶拷貝/μL。樣品溶液D中，標準品質(zhì)粒甲的濃度為10⁷拷貝/μL，標準品質(zhì)粒乙的濃度為10⁵拷貝/μL。樣品溶液E中，標準品質(zhì)粒甲的濃度為10⁸拷貝/μL，標準品質(zhì)粒乙的濃度為10⁴拷貝/μL。

以樣品溶液為模板，按照實施例3建立的方法(步驟2和步驟3)進行檢測。

結(jié)果見圖3。圖3中，M對應DNA marker(100bp ladder)，1至5依次對應樣品溶液A至樣品溶液E。

結(jié)果表明，采用引物對甲和引物對乙通過二重二溫式PCR檢測牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒有如下優(yōu)點：當一個引物對的靶標物濃度較高，而另一個模板的靶標物較低時，依然可以同時檢測到兩種靶標物，不影響擴增效率，相互不受干擾。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所

<120> 用于鑒定牛支原體和牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物組及其應用

<130> GNCYX170639

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaacatgaa accttatacg a 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atcctcatag aattgttcaa aga 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggcgtcatt tacaaggaga a 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggccgtgaag cggaagtt 18

<210> 5

<211> 412

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaacatgaa accttatacg aaaatggctt gttaataaaa aacaaagact ataacttttg 60

gattaatcag tttaataaaa ttaaagaaat tttaagtttc aaaaacaata attatattaa 120

tgaactaact aacaaaatgc atcaagcagc caataatatg caatttgaac ttgcattatt 180

tttgcgtgat ggcttaacat atttaaaaaa gttaaaagaa agtcaaatta tagagctaag 240

tcaatataaa aatattgacg tatttgctta taaaacagac gaaaaattaa tttttgctac 300

agttttgttc tatcgctatg gaatattaat caacaaggtt aatttaacaa ttccactagg 360

tttaagtgtt gatgaatcac ttagagtttt ctttgaacaa ttctatgagg at 412

<210> 6

<211> 727

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggcgtcatt tacaaggaga acatcgcgcc gtacacgttc aaggcctaca tttactacaa 60

aaacgtgctc gtgaccggga aaagcccggg gggcacgtac gcggccatta caaaccagta 120

cacggaccgc atgcccgtgg gcatgggcga gatcacggac ctggtggaca agaagtggca 180

ctgcctttcg aaagccgagt acctgcgcag cgggcgcaag gtggtggcct ttgaccgcga 240

cgacgacccc tgggaggcgc cgctgaagcc tgcgcggctg agcgcgcccg gggtgcgggg 300

ctggcacacg acggacgatg tgtacacggc gctgggctcg gcggggctct accgcacggg 360

cacctctgtg aactgcatcg tggaagaagt ggaggcgcgc tcggtgtacc cgtacgactc 420

gttcgcgctc tcgaccgggg acattatcta catgtcgccc ttttacgggc tgcgcgaggg 480

cgcgcaccgc gagcacacca gctactcgcc ggagcgcttc cagcagatcg agggctacta 540

caagcgcgac atggccacgg gccggcgcct caaggagccg gtctcgcgga actttttgcg 600

tacacagcac gtgacggtag cctgggactg ggtgcccaag cgcaaaaacg tgtgctcgct 660

ggccaagtgg cgcgaggcgg acgaaatgct gcgagacgag agccgcggga acttccgctt 720

cacggcc 727