本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用數(shù)字PCR檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的方法及其專用成套試劑。

背景技術(shù)：

馬鈴薯是世界上種植和食用國家最多的作物，也是在全球經(jīng)濟(jì)中繼水稻、小麥和玉米之后的第4大糧食作物。馬鈴薯是全世界的高產(chǎn)作物之一，中國種植馬鈴薯面積居全世界第一位。近年來，我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，馬鈴薯在我國國民經(jīng)濟(jì)增長中占有重要比重，但我國現(xiàn)階段馬鈴薯整體生產(chǎn)水平低于世界平均水平，其主要原因便是受馬鈴薯病毒的影響。馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是一種馬鈴薯病毒，是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的代表種，分布于所有馬鈴薯種植區(qū)。馬鈴薯Y病毒對(duì)馬鈴薯的危害最大，可導(dǎo)致馬鈴薯退化，降低馬鈴薯產(chǎn)量，嚴(yán)重的減產(chǎn)可達(dá)80％以上，甚至絕產(chǎn)。

目前，檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、電鏡技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，這些技術(shù)有的操作步驟繁瑣，檢測(cè)周期長，靈敏度低，有的易于造成交叉污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。數(shù)字PCR(Digital-PCR)是一種新型的PCR檢測(cè)方法，其基本原理是通過將微量樣品進(jìn)行大倍數(shù)稀釋和分液，直至每個(gè)樣品中所含有的待測(cè)分子數(shù)不超過1個(gè)，再將所有樣品在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有PCR擴(kuò)增熒光信號(hào)記為1，無熒光信號(hào)記為0，有熒光信號(hào)的反應(yīng)單元中至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，針對(duì)反應(yīng)結(jié)果采用泊松分布(Poisson distribution)公式，便可計(jì)算出樣本的最初拷貝數(shù)或濃度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測(cè)馬鈴薯Y病毒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的成套試劑。

本發(fā)明所提供的檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的成套試劑，可由引物對(duì)X1和探針PVY-p組成；所述引物對(duì)X1可由引物PVY-f和引物PVY-r組成；所述引物對(duì)X1的靶序列含有特異DNA片段；所述特異DNA片段可為如下y1)或y2)：

y1)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

y2)將序列4經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；

所述探針PVY-p可為20-30個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA分子，與所述特異DNA片段中的部分區(qū)段相同。

上述成套試劑中，所述引物PVY-f可為如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的單鏈DNA分子；

a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的單鏈DNA分子。

上述成套試劑中，所述引物PVY-r可為如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列2所示的單鏈DNA分子；

b2)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的單鏈DNA分子。

上述成套試劑中，所述探針PVY-p可為如下c1)或c2)：

c1)序列表中序列3所示的單鏈DNA分子；

c2)將序列3經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的單鏈DNA分子。

上文中，所述y2)、所述a2)、所述b2)或所述c2)中，所述“經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加”可為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述成套試劑中，所述探針PVY-p的末端可具有熒光標(biāo)記。

上述成套試劑中，所述探針PVY-p的末端具有熒光標(biāo)記具體可為所述探針PVY-p的5′末端具有FAM熒光標(biāo)記和/或3′末端具有TAMRA熒光標(biāo)記。

上述成套試劑中，所述引物PVY-f、所述引物PVY-r和所述探針PVY-p的摩爾比具體可為2：2：1。

上述成套試劑中，所述引物PVY-f、所述引物PVY-r和所述探針PVY-p的量具體可如下：0.5μmol所述引物PVY-f、0.5μmol所述引物PVY-r和0.25μmol所述探針PVY-p。

上述成套試劑中所述引物對(duì)X1也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述引物對(duì)X1中，所述引物PVY-f和所述引物PVY-r的摩爾比具體可為1：1。

上述引物對(duì)X1中，所述引物PVY-f和所述引物PVY-r的量具體可如下：0.5μmol所述引物PVY-f和0.5μmol所述引物PVY-r。

c1)或c2)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

c1)上述成套試劑的制備方法，為將上述成套試劑中的所述引物PVY-f、所述引物PVY-r和所述探針PVY-p分別單獨(dú)包裝；

c2)上述引物對(duì)X1的制備方法，為將上述引物對(duì)X1中各引物分別單獨(dú)包裝。

上述成套試劑或上述引物對(duì)X1的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述成套試劑或上述引物對(duì)X1的應(yīng)用可為如下d1)或d2)或d3)或d4)：

d1)制備用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的試劑盒；

d2)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有或疑似含有馬鈴薯Y病毒；

d3)制備用于鑒定或輔助鑒定馬鈴薯Y病毒的試劑盒；

d4)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為候選的馬鈴薯Y病毒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了含有上述成套試劑或上述引物對(duì)X1的試劑盒。

所述試劑盒的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述試劑盒的應(yīng)用可為如下d2)或d4)：

d2)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有或疑似含有馬鈴薯Y病毒；

d4)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為候選的馬鈴薯Y病毒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)待測(cè)樣品是否含有馬鈴薯Y病毒的方法。

本發(fā)明所提供的檢測(cè)待測(cè)樣品是否含有馬鈴薯Y病毒的方法，為A1)或A2)或A3)：

A1)以待測(cè)樣品的cDNA為模板，以所述成套試劑進(jìn)行數(shù)字PCR，然后進(jìn)行如下評(píng)判：如果所述成套試劑可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所述cDNA的數(shù)字PCR，則待測(cè)樣品中含有或疑似含有馬鈴薯Y病毒；如果所述成套試劑不能實(shí)現(xiàn)對(duì)所述cDNA的數(shù)字PCR，則所述待測(cè)樣品不含有或疑似不含有馬鈴薯Y病毒；

A2)以待測(cè)樣品的cDNA為模板，以所述引物對(duì)X1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行如下評(píng)判：如果所述引物對(duì)X1可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所述cDNA的PCR擴(kuò)增，則待測(cè)樣品中含有或疑似含有馬鈴薯Y病毒；如果所述引物對(duì)X1不能實(shí)現(xiàn)對(duì)所述cDNA的PCR擴(kuò)增，則所述待測(cè)樣品不含有或疑似不含有馬鈴薯Y病毒；

A3)檢測(cè)待測(cè)樣品的cDNA中是否含有特異DNA片段，然后進(jìn)行如下評(píng)判：如果待測(cè)樣品的cDNA中含有特異DNA片段，則待測(cè)樣品中含有或疑似含有馬鈴薯Y病毒；如果待測(cè)樣品的cDNA中不含有特異DNA片段，則待測(cè)樣品不含有或疑似不含有馬鈴薯Y病毒；

所述特異DNA片段為如下y1)或y2)：

y1)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

y2)將序列4經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子。

上述方法中，所述待測(cè)樣品可為植物樣品。所述植物樣品具體可為感染了馬鈴薯M病毒(potato virus M，PVM)的馬鈴薯葉片、感染了馬鈴薯X病毒(potato virus X，PVX)的馬鈴薯葉片、感染了馬鈴薯Y病毒的馬鈴薯葉片、感染了煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的煙草葉片或感染了黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的黃瓜葉片。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種鑒定待測(cè)病毒是否為候選的馬鈴薯Y病毒的方法。

本發(fā)明所提供的鑒定待測(cè)病毒是否為候選的馬鈴薯Y病毒的方法，可為B1)或B2)或B3)：

B1)以待測(cè)病毒的cDNA為模板，以所述成套試劑進(jìn)行數(shù)字PCR，然后進(jìn)行如下評(píng)判：如果所述成套試劑可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所述cDNA的數(shù)字PCR，則待測(cè)病毒為候選的馬鈴薯Y病毒；如果所述成套試劑不能實(shí)現(xiàn)對(duì)所述cDNA的數(shù)字PCR，則待測(cè)病毒為候選的非馬鈴薯Y病毒；

B2)以待測(cè)病毒的cDNA為模板，以所述引物對(duì)X1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行如下評(píng)判：如果所述引物對(duì)X1可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所述cDNA的PCR擴(kuò)增，則待測(cè)病毒為候選的馬鈴薯Y病毒；如果所述引物對(duì)X1不能實(shí)現(xiàn)對(duì)所述cDNA的PCR擴(kuò)增，則待測(cè)病毒為候選的非馬鈴薯Y病毒；

B3)檢測(cè)待測(cè)病毒的cDNA中是否含有特異DNA片段，然后進(jìn)行如下評(píng)判：如果待測(cè)病毒的cDNA中含有特異DNA片段，則待測(cè)病毒為候選的馬鈴薯Y病毒；如果待測(cè)病毒的cDNA中不含有特異DNA片段，則待測(cè)病毒為候選的非馬鈴薯Y病毒；

所述特異DNA片段為如下y1)或y2)：

y1)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

y2)將序列4經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子。

上述任一所述的方法中，所述“進(jìn)行數(shù)字PCR”的反應(yīng)體系可包括：2×SuperMix、所述引物PVY-f、所述引物PVY-r、所述探針PVY-p和模板。所述模板可為將待測(cè)樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA或待測(cè)病毒的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。

上述任一所述的方法中，所述“進(jìn)行數(shù)字PCR”的反應(yīng)體系具體可由2×SuperMix、所述引物PVY-f、所述引物PVY-r、所述探針PVY-p、模板和水組成。所述模板可為將待測(cè)樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA或待測(cè)病毒的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。

上述任一所述的方法中，所述“進(jìn)行數(shù)字PCR”的反應(yīng)體系具體可為體系1或體系2。

20μL所述體系1可由10μL 2×SuperMix、引物PVY-f(濃度為0.4-0.6μM)、引物PVY-r(濃度為0.4-0.6μM)、探針PVY-p(濃度為0.2-0.3μM)、模板和無核酸酶水組成。所述模板可為將待測(cè)樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA或待測(cè)病毒的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。

20μL所述體系1具體可由10μL 2×SuperMix、1μL引物PVY-f(濃度為10μM)、1μL引物PVY-r(濃度為10μM)、0.5μL探針PVY-p(濃度為10μM)、2μL模板和5.5μL無核酸酶水組成。所述模板可為將待測(cè)樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。

所述體系2可為向所述體系1中加入數(shù)字PCR反應(yīng)用油得到的體系。

所述體系2可為20μL向所述體系1中加入70μL數(shù)字PCR反應(yīng)用油得到的體系。

上文中，所述2×SuperMix和所述數(shù)字PCR反應(yīng)用油均可為美國Bio-Rad公司的產(chǎn)品。

上述任一所述的方法中，所述“進(jìn)行數(shù)字PCR”和所述“進(jìn)行PCR擴(kuò)增”的退火溫度可為55-60℃(如58℃)。

上述任一所述的方法中，所述“進(jìn)行數(shù)字PCR”的反應(yīng)程序具體可為：50℃熱激活5min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，58℃退火及延伸60s，40個(gè)循環(huán)。

上述任一所述的方法中，所述“進(jìn)行數(shù)字PCR”可在數(shù)字PCR反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行。

上述任一所述的方法中，所述“進(jìn)行數(shù)字PCR”具體可在Bio-Rad數(shù)字PCR反應(yīng)系統(tǒng)(Bio-Rad QX200)中進(jìn)行；Bio-Rad數(shù)字PCR反應(yīng)系統(tǒng)(Bio-Rad QX200)為美國Bio-Rad公司的產(chǎn)品。

針對(duì)馬鈴薯Y病毒設(shè)計(jì)檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的成套試劑，并基于該成套試劑建立了利用數(shù)字PCR檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的方法。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明所提供的方法數(shù)字PCR檢測(cè)馬鈴薯Y病毒，特異性好(可從PVM、PVX、PVY、TMV、CMV中準(zhǔn)確鑒定出PVY)且靈敏度高(在20μL反應(yīng)體系中，靈敏度可達(dá)0.9拷貝/μL)，適用于潛隱病癥和病毒含量低的樣品中PVY的檢測(cè)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2為靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)為Takara公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為RR064A。One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)在下文中簡(jiǎn)稱實(shí)時(shí)熒光一步RT-PCR試劑盒。

PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)為Takara公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為RR037A。PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)在下文中簡(jiǎn)稱反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

植物總RNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為DP432。

數(shù)字PCR相關(guān)反應(yīng)試劑耗材和Bio-Rad數(shù)字PCR反應(yīng)系統(tǒng)(Bio-Rad QX200)均為美國Bio-Rad公司的產(chǎn)品；數(shù)字PCR相關(guān)反應(yīng)試劑耗材包括2×SuperMix、數(shù)字PCR微滴生成卡和數(shù)字PCR反應(yīng)用油；Bio-Rad數(shù)字PCR反應(yīng)系統(tǒng)(Bio-Rad QX200)包括PCR儀、Droplet Generator微滴生成器和Droplet Reader微滴讀取儀。

馬鈴薯M病毒(Potato Virus M，PVM)記載于如下文獻(xiàn)中：張永江，劉忠梅，燕照玲，劉洪義，馬潔，陳林，辛言言，馬云霞.寧夏固原地區(qū)馬鈴薯M病毒的檢測(cè)鑒[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，08:79-81+85.。公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院(即申請(qǐng)人)處獲得。

馬鈴薯X病毒(potato virus X，PVX)和馬鈴薯Y病毒(potato virus Y，PVY)均記載于如下文獻(xiàn)中：魏梅生，劉洪義，李桂芬，陳燕芳.馬鈴薯X病毒和馬鈴薯Y病毒膠體金免疫層析試紙條的研制[J].植物保護(hù)，2006，32(6)：139-141.。公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院(即申請(qǐng)人)處獲得。

煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)記載于如下文獻(xiàn)中：張永江，馬榮群，辛言言，黃粵.煙草花葉病毒屬條形碼鑒定方法的建立[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54(11)：2624-2627.。公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院(即申請(qǐng)人)處獲得。

黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)記載于如下文獻(xiàn)中：李桂芬，朱水芳，周群，施宗偉，張永江，李明福.侵染紫松果菊的黃瓜花葉病毒分離物鑒定[J].植物保護(hù)2007，33(1)54-56.。公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院(即申請(qǐng)人)處獲得。

實(shí)施例1、檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的成套試劑的制備

檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的成套試劑由引物對(duì)X1和探針PVY-p組成。引物對(duì)X1由引物PVY-f：5′-CCAAACCCGAACAAAGGAAAG-3′(序列表中序列1)和引物PVY-r：5′-GGACGTGATAGCCTTGATTCTC-3′(序列表中序列2)組成。探針PVY-p為：5′-FAM-AATGCAGGCACATCTGGGACACATACTGT-TAMRA-3′(序列表中序列3)。探針PVY-p的5′末端具有FAM熒光標(biāo)記，3′末端具有TAMRA熒光標(biāo)記。

檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的成套試劑中，引物PVY-f、引物PVY-r和探針PVY-p分別獨(dú)立包裝。成套試劑中，引物PVY-f、引物PVY-r和探針PVY-p的摩爾比為2:2:1。

合成引物PVY-f、引物PVY-r和探針PVY-p。

實(shí)施例2、利用數(shù)字PCR檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的方法的建立

1、待測(cè)樣品的總RNA的提取

用植物總RNA提取試劑盒提取待測(cè)樣品的總RNA，得到待測(cè)樣品的總RNA。

2、待測(cè)樣品的cDNA的獲得

取待測(cè)樣品的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，采用實(shí)施例1合成的引物PVY-r進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得待測(cè)樣品的cDNA。

3、數(shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)

(1)配制反應(yīng)體系

反應(yīng)體系甲為20μL，由10μL 2×SuperMix、1μL引物PVY-f、1μL引物PVY-r、0.5μL探針PVY-p、2μL待測(cè)樣品的cDNA和5.5μL無核酸酶水組成；初始體系中，引物PVY-f的濃度為0.5μM，引物PVY-r的濃度為0.5μM，探針PVY-p的濃度為0.25μM。

反應(yīng)體系乙(作為陰性對(duì)照)為20μL，用等體積的健康馬鈴薯的cDNA代替待測(cè)樣品的cDNA，其它同反應(yīng)體系甲。

健康馬鈴薯的cDNA的制備方法如下：用植物總RNA提取試劑盒提取健康馬鈴薯的葉片的總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，采用實(shí)施例1合成的引物PVY-r進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到健康馬鈴薯的cDNA。

反應(yīng)體系丙(作為空白對(duì)照)為20μL，用等體積的無核酸酶水代替待測(cè)樣品的cDNA，其它同反應(yīng)體系甲。

(2)完成步驟(1)后，將反應(yīng)體系(反應(yīng)體系甲、反應(yīng)體系乙或反應(yīng)體系丙)轉(zhuǎn)移至數(shù)字PCR微滴生成卡的體系加樣孔中，并在反應(yīng)用油加樣孔中加入70μL的數(shù)字PCR反應(yīng)用油(在加樣過程中，應(yīng)避免在孔底產(chǎn)生氣泡)。

(3)完成步驟(2)后，將所述數(shù)字PCR微滴生成卡轉(zhuǎn)移至Droplet Generator微滴生成器中，啟動(dòng)儀器，得到微滴體系。

(4)完成步驟(3)后，將所述微滴體系轉(zhuǎn)移至96孔板中，封膜。

(5)完成步驟(4)后，將所述96孔板置于PCR儀中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)程序：50℃熱激活5min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，58℃退火及延伸60s，40個(gè)循環(huán)。

(6)完成步驟(5)后，將所述96孔板取出，置于Droplet Reader微滴讀取儀中進(jìn)行微滴熒光讀取，然后通過FAM單通道熒光收集單個(gè)微滴熒光信號(hào)。

(7)完成步驟(6)后，儀器通過分析熱點(diǎn)圖確定熒光閾值限并自動(dòng)確定陰性微滴和陽性微滴。然后進(jìn)行如下判斷：

如果待測(cè)樣品產(chǎn)生陽性微滴信號(hào)，則待測(cè)樣品含有馬鈴薯Y病毒；如果待測(cè)樣品不產(chǎn)生陽性微滴信號(hào)，則待測(cè)樣品不含有馬鈴薯Y病毒。

實(shí)施例3、特異性檢測(cè)

按照實(shí)施例2的方法，進(jìn)行特異性檢測(cè)。待測(cè)樣品為0.1g感染了PVM的馬鈴薯葉片、0.1g感染了PVX的馬鈴薯葉片、0.1g感染了PVY的馬鈴薯葉片、0.1g感染了TMV的煙草葉片或0.1g感染了CMV的黃瓜葉片。2μL待測(cè)樣品的cDNA中，DNA含量均為580ng/μL。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1(A05和B05均為PVY，C05為PVX，D05為PVM，E05為TMV，F(xiàn)05為CMV，G05為陰性對(duì)照，H05為空白對(duì)照)。結(jié)果表明，僅感染了PVY的馬鈴薯葉片產(chǎn)生陽性微滴，其它待測(cè)樣品、陰性對(duì)照和空白對(duì)照均不產(chǎn)生陽性微滴(此時(shí)判定為陽性微滴的熒光閾值限為0，低于0的微滴儀器判斷為陰性，高于0的微滴儀器判斷為陽性)。因此，僅感染了PVY的馬鈴薯葉片含有馬鈴薯Y病毒，與預(yù)期結(jié)果完全一致。

上述結(jié)果表明，實(shí)施例1所提供的檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的成套試劑的特異性高。

實(shí)施例4、靈敏度檢測(cè)

1、用植物總RNA提取試劑盒提取感染了PVY的馬鈴薯葉片的總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，采用實(shí)施例1合成的引物PVY-r進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得感染了PVY的馬鈴薯葉片的cDNA。將感染了PVY的馬鈴薯葉片的cDNA命名為稀釋液1(稀釋度記為10⁰)。

2、完成步驟1后，取1體積份稀釋液1，加入9體積份的無核酸酶水，混合均勻，得到稀釋液2(稀釋度記為10^-1)；以此類推制成稀釋液3(稀釋度記為10^-2)、稀釋液4(稀釋度記為10^-3)、稀釋液5(稀釋度記為10^-4)、稀釋液6(稀釋度記為10^-5)、稀釋液7(稀釋度記為10^-6)、稀釋液8(稀釋度記為10^-7)、稀釋液9(稀釋度記為10^-8)和稀釋液10(稀釋度記為10^-9)。

3、完成步驟2后，按照實(shí)施例2步驟3的方法，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。待測(cè)樣品的cDNA為步驟2制備的稀釋液6、稀釋液7、稀釋液8、稀釋液9或稀釋液10。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2(E03和F03均為稀釋液6，G03和H03均為稀釋液7，A04和B04均為稀釋液8，C04和D04均為稀釋液9，E04和F04均為稀釋液10，G04和H04為空白對(duì)照)。結(jié)果表明，稀釋液6、稀釋液7、稀釋液8和稀釋液9中均產(chǎn)生陽性微滴，稀釋液10和空白對(duì)照均不產(chǎn)生陽性微滴(此時(shí)判定為陽性微滴的的熒光閾值限為0，低于0的微滴儀器判斷為陰性，高于0的微滴儀器判斷為陽性)。稀釋液6、稀釋液7、稀釋液8、稀釋液9和稀釋液10中含有PVY模板的拷貝數(shù)依次分別為900拷貝/μL、90拷貝/μL、9拷貝/μL、0.9拷貝/μL和0.09拷貝/μL，因此，實(shí)施例1所提供的檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的成套試劑在上述反應(yīng)體系中的的靈敏度為0.9拷貝/μL。

<110> 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院

<120> 利用數(shù)字PCR檢測(cè)馬鈴薯Y病毒的方法及其專用成套試劑

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ccaaacccga acaaaggaaa g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggacgtgata gccttgattc tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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