本發(fā)明屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種K亞群禽白血病病毒的RT-LAMP檢測引物組及試劑盒。

背景技術(shù)：

禽白血病病毒(Avian leukosis viruses,ALVs)是反轉(zhuǎn)錄病毒科、腫瘤病毒亞科的一員，該病毒群引起的所有良性和惡性腫瘤統(tǒng)稱為禽白血病(avian leukosis,AL)。(殷震，1997)。禽白血病被列為2012-2020年國家優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一(高鴻賓，2012)。禽白血病病毒誘發(fā)的腫瘤主要包括白血病、結(jié)締組織腫瘤、上皮性腫瘤、內(nèi)皮性腫瘤及其他相關(guān)腫瘤，其中白血病又可分為淋巴細(xì)胞性白血病(Lymphoid Leucosis,LL)、成紅細(xì)胞性白血病(Erythroblastosis,EB)、成髓細(xì)胞性白血病(Myeloblastosis,MB)和髓細(xì)胞性白血病(Myelocytomatosis,ML)(Purchase et al.,1984；霍夫斯塔，1980)。

目前，病毒分離鑒定是檢測禽白血病病毒最常規(guī)基礎(chǔ)的方法，主要是測定病毒或病毒抗原，準(zhǔn)確性較高、易操作。其缺點(diǎn)在于耗時(shí)長，從采樣到檢出結(jié)果至少需要10天時(shí)間；存在假陽性或病毒隱性未檢出的可能性；花費(fèi)高；操作流程繁瑣。因此，該方法不適用于大范圍、多樣品的檢測，難以在臨床中推廣和應(yīng)用。病毒中和試驗(yàn)是檢測禽白血病病毒最靈敏的方法之一。但存在操作步驟繁瑣，耗時(shí)耗力，花費(fèi)高等缺點(diǎn)，臨床實(shí)際檢測中很少用到。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是哈爾濱獸研所在20世紀(jì)80年代建立的方法。該方法需要拔羽取髓，會(huì)引起雞群較大的應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)特異性也較低，會(huì)受內(nèi)源性病毒的干擾，出現(xiàn)一定的假陽性。(關(guān)云濤等，2002)。IFA的基本原理是根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)，將熒光色素標(biāo)記在已知抗體(或抗原)上，當(dāng)其與對應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后，就能夠在熒光顯微鏡下觀察到特異性的熒光信號(hào)。IFA的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)，反應(yīng)速度快，結(jié)果易觀察，但是，操作步驟繁瑣，專業(yè)要求高，耗時(shí)長，敏感度低，會(huì)因非特異染色而出現(xiàn)假陽性，在臨床上推廣范圍較窄。

近幾年來，禽白血病發(fā)生頻繁，給我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展帶來很大沖擊。經(jīng)典外源性的禽白血病病毒亞群ALV-A、ALV-B、ALV-J在檢測、凈化等方面已經(jīng)相對成熟，而對于在2008年才發(fā)現(xiàn)命名的ALV-K亞群，在相關(guān)方面的研究非常滯后。因此，建立一種快速有效的針對ALV-K的檢測方法就顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速的K亞群禽白血病病毒T-LAMP檢測引物組及試劑盒。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種用于快速檢測K亞群禽白血病病毒的RT-LAMP檢測引物組，包括一對外引物和一對內(nèi)引物，所述引物組是根據(jù)K亞群禽白血病病毒序列的gp85區(qū)段進(jìn)行設(shè)計(jì)的。

作為優(yōu)選的，所述引物組的核苷酸序列如下所示：

F3：5’-ACACAATCTTTTTAGGGGGA-3’(SEQ ID NO.1)，

B3：5’-ACTAGCTGTACAGTTCGC-3’(SEQ ID NO.2)；

FIP：5’-GAGAACCTGTCTGTGCACAATTGTACTGCGGTACATATGGT-3’(SEQ ID NO.3)，

BIP：5’-GCACACGCACAGGAGGTATACTGAACGGCTTTGTCTCG-3’(SEQ ID NO.4)。

一種用于快速檢測K亞群禽白血病病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其含有上述用于快速檢測K亞群禽白血病病毒的RT-LAMP檢測引物組。

所述試劑盒中還包含有DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、熒光染料。

一種用于快速檢測K亞群禽白血病病毒的RT-LAMP檢測方法，包括如下步驟：

(1)提取待檢樣品病毒RNA；

(2)利用權(quán)利要求1或2的引物組對待檢樣品RNA進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；

(3)結(jié)果判斷：在上述反應(yīng)管中加入熒光染料，根據(jù)反應(yīng)液顏色變化或擴(kuò)增曲線來判定

結(jié)果。

作為優(yōu)選的，所述RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)程序中內(nèi)引物的濃度為1.6μM，外引物濃度為0.1μM。

作為優(yōu)選的，所述熒光染料為SYBR GREENⅠ。

作為優(yōu)選的，RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?1℃，恒溫反應(yīng)60分鐘。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明所篩選得到的K亞群禽白血病病毒的RT-LAMP檢測引物組能夠特異性的擴(kuò)增出ALV-K，種內(nèi)和種間的特異性均非常好；反應(yīng)最低能夠檢測到8.4×10⁴copies/μL的核酸，ALV-K的RT-LAMP檢測方法操作簡便，成本低，耗時(shí)短，適用于臨床快速檢測ALV-K。

附圖說明

圖1為陽性重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖(M.DNA Marker 4500；1.RT-PCR產(chǎn)物；2.重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；3.陰性對照)；

圖2為引物濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(內(nèi)引物濃度為0.4μM和0.8μM；從左至右擴(kuò)增曲線內(nèi)引物和外引物濃度依次為(單位μM)：0.8、0.05，0.8、0.15，0.8、0.1，0.8、0.2，0.4、0.2，0.4、0.15，0.4、0.1，0.4、0.05)；

圖3為引物濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(內(nèi)引物濃度為1.2μM和1.6μM；從左至右擴(kuò)增曲線內(nèi)引物和外引物濃度依次為(單位μM)：1.6、0.1，1.6、0.2，1.2、0.1，1.2、0.2，1.2、0.15，1.6、0.05，1.6、0.15，1.2、0.0)；

圖4為反應(yīng)溫度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖5為ALV-K的RT-LAMP檢測法種內(nèi)特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖6為ALV-K的RT-LAMP檢測法種間特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖7為ALV-K的RT-LAMP檢測法的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖8為普通PCR的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(1-9模板含量分別為(單位copies/μL)：8.4×10¹⁰；8.4×10⁹；8.4×10⁸；8.4×10⁷；8.4×10⁶；8.4×10⁵；8.4×10⁴；8.4×10³；10為陰性對照)；

圖9為臨床樣品的檢測結(jié)果圖；

圖10為臨床樣品的檢測結(jié)果圖；

圖11為臨床樣品的檢測結(jié)果圖(M.DNA Marker 2000；1.陽性對照；2-4.臨床樣品；5.陰性對照)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施了對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1亞群禽白血病病毒RT-LAMP檢測方法的建立

1實(shí)驗(yàn)材料

毒株、細(xì)胞

美國ATCC雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1)、A亞群禽白血病RAV-1株(GenBank登錄號(hào)：M19113)、B亞群禽白血病RAV-2株(GenBank登錄號(hào)：M14902)、J亞群禽白血病HPRS-103株(GenBank登錄號(hào)：Z46390)、E亞群禽白血病RAV-0株(GenBank登錄號(hào)：M12172)、K亞群禽白血病GDFX0601株(GenBank登錄號(hào)：KP686142.1)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(REV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參考GDFX0601株前病毒全基因組，設(shè)計(jì)了一對引物用于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建：env-F：5’-CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGATAC-3’(SEQ ID NO.5)；env-R：5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTACACTGCTCCATTTTCG-3’(SEQ ID NO.6)。利用該引物對特異性的擴(kuò)增ALV-K，目的基因1850bp，瓊脂凝膠電泳結(jié)果顯示在1850bp附近有一條特異性的目的條帶；再以構(gòu)建的陽性質(zhì)粒為模板，得到預(yù)期大小的目的條帶(圖1)，測序結(jié)果顯示插入的基因序列與目的基因一致，結(jié)果表明陽性重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的定量：DNA拷貝數(shù)＝{[X(g/μL)DNA/DNA長度bp×660]×6.02×10²³}＝Y(jié)(拷貝/μL)。用蛋白核酸定量儀測定陽性重組質(zhì)粒DNA濃度，質(zhì)粒濃度為170ng/μL＝170×10^-9g/μL；質(zhì)粒的分子量＝1850(堿基總數(shù))×660(堿基對的平均分子量)；DNA拷貝數(shù)＝(170×10^-9×6.02×10²³)/(1850×660)＝8.4×10¹⁰copies/μL。

2.2RT-LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成

選取K亞群禽白血病病毒序列的gp85區(qū)段進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)的引物的設(shè)計(jì)。包括內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3(表1)，用于RT-LAMP檢測。

表1RT-LAMP引物

2.3反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化

根據(jù)廣州迪澳生物科技有限公司的RNA擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，25μL反應(yīng)體系：

上述試劑混勻后，加入20μL密封液，混勻離心，蓋緊管蓋。

優(yōu)化RT-LAMP反應(yīng)體系，以達(dá)到最佳的擴(kuò)增效果。內(nèi)引物(FIP/BIP)濃度從0.4μmol/L至1.6μmol/L以0.4μmol/L遞增，外引物濃度(F3/B3)從0.05μmol/L至0.2μmol/L以0.05μmol/L遞增，其它條件完全一致，反應(yīng)時(shí)間為60min，采用矩陣法進(jìn)行篩選試驗(yàn)，以確定內(nèi)外引物的最佳濃度、比例。結(jié)果如圖2和圖3。當(dāng)內(nèi)引物和外引物的濃度分別為1.6μM和0.1μM時(shí)，反應(yīng)出現(xiàn)最小的Ct值和最大的熒光度，此時(shí)為反應(yīng)的最佳引物濃度。此外，隨著內(nèi)引物濃度的逐漸提高，反應(yīng)的Ct值越小，熒光值越大。

使用Genie II等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)，以優(yōu)化后的引物濃度為條件，反應(yīng)溫度從59℃為開始，以1℃遞增，直到66℃，反應(yīng)時(shí)間為60min，以確定最佳反應(yīng)溫度。結(jié)果如圖4所示。當(dāng)溫度在61℃時(shí)，反應(yīng)出現(xiàn)最小的Ct值和最大的熒光度，此時(shí)為反應(yīng)的最佳溫度。

實(shí)施例2ALV-K的RT-LAMP檢測法的特異性

用優(yōu)化的反應(yīng)體系，以ALV-K、ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-E為模板，確認(rèn)RT-LAMP檢測法種內(nèi)特異性。再以ALV-K、NDV、REV、AIV、MDV、IBV、DF-1為模板，確認(rèn)RT-LAMP檢測法種間特異性。如圖5和圖6所示，實(shí)時(shí)熒光法結(jié)果顯示RT-LAMP引物只能特異性的擴(kuò)增出ALV-K，其他模板均為陰性；顯色法結(jié)果顯示只有ALV-K呈綠色為陽性，其余皆呈橙色為陰性，證明該方法具有很強(qiáng)的特異性。

實(shí)施例3ALV-K的RT-LAMP檢測法的靈敏度

將陽性的重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋，從8.4×10¹⁰copies/μL到8.4×10²copies/μL，用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。設(shè)計(jì)一對引物(F：5’-ACGCTTTCAGATTGGTCC-3’(SEQ ID NO.7)；R：5’-AAGCGAGAACCTGTCTGTGC-3’(SEQ ID NO.8))，目的基因182bp，以同樣稀釋的陽性重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，比較兩種檢測方法的靈敏度。結(jié)果如圖7所示。RT-LAMP最低能夠檢測到8.4×10⁴copies/μL。根據(jù)圖8的結(jié)果，普通PCR最低能夠檢測到8.4×10³copies/μL。

實(shí)施例4ALV-K的RT-LAMP的臨床應(yīng)用

隨機(jī)抽取珠海斗門雞場供澳門的40只肉雞，以優(yōu)化的RT-LAMP反應(yīng)條件，進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖9所示，雞群均未感染ALV-K。利用RT-LAMP檢測臨床樣品，如圖10所示，檢測結(jié)果與普通PCR一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120> K亞群禽白血病病毒的RT-LAMP檢測引物組及試劑盒

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acacaatctt tttaggggga 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actagctgta cagttcgc 18

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagaacctgt ctgtgcacaa ttgtactgcg gtacatatgg t 41

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcacacgcac aggaggtata ctgaacggct ttgtctcg 38

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatccg ccaccatgga agccgtcata aaggcatttc tgactggata c 51

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaggaaaaaa gcggccgctt acactgctcc attttcg 37

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgctttcag attggtcc 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagcgagaac ctgtctgtgc 20