本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的引物對、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

鼠輪狀病毒(Murine Rotavirus,MRV)，為雙股RNA病毒，在小鼠中普遍存在，造成乳鼠流行性腹瀉(Epidemic Diarrhea of mice,EDIM)，我國開放飼養(yǎng)的小鼠中本病發(fā)生率很高，嚴重危害開放飼養(yǎng)各品系小鼠的乳鼠。EDIM病毒屬呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，為雙股RNA病毒，其外殼上具有區(qū)別于其它輪狀病毒的特異性抗原，MRV屬于A組輪狀病毒，與嬰幼兒的輪狀病毒有交叉反應(yīng)，而與乳大鼠的B組輪狀病毒沒交叉反應(yīng)。所以，MRV只會引起乳小鼠的發(fā)病。小鼠是EDIM病毒的唯一自然宿主。本病通過消化道和呼吸道傳播，是一種高度接觸性傳染病。EDIM主要高發(fā)于第一胎15日齡以內(nèi)的乳鼠。乳鼠可表現(xiàn)腹瀉、發(fā)育遲緩、脫水等癥狀，偶爾死亡。成年小鼠呈隱性感染并不斷向外排毒。

小鼠輪狀病毒在鼠群中感染很普遍，給生產(chǎn)和科研都帶來了很大的損失。由于在臨床上易與由其他因素引起的腹瀉相混淆,這也給診斷帶來一定的難度。目前，人們還未對這一病毒感染給予足夠的重視。小鼠發(fā)生腹瀉后往往是從細菌感染、飼料、氣候等方面來考慮。因此，人們往往很容易忽略這種隱性感染的嚴重性，給生產(chǎn)群以及種群帶來了潛在的危害。目前，在實驗小鼠MRV的檢測中，國內(nèi)現(xiàn)在使用的方法仍然局限于，血清學檢測MRV抗體，通常都是建立基于MRV結(jié)構(gòu)蛋白的ELISA方法。雖然這種方法也可以進行大樣本檢測，且檢測方法相對簡單，只需檢測血清樣本，但該方法需要制備特異性的抗體，而且無法區(qū)分免疫與感染產(chǎn)生的抗體。其中鼠的采血，血清分離都是特別繁瑣和耗時的，特別是在大型的實驗動物飼養(yǎng)機構(gòu)，每年的實驗鼠的檢測，傳統(tǒng)ELISA方法太過于繁瑣了，且現(xiàn)如今市場上有的鼠輪狀病毒感染檢測ELISA試劑盒，大部分為進口試劑盒，價格都在2000-3000元左右，而且僅可以檢測96個樣，傳統(tǒng)的方法存在著繁瑣、局限性、靈敏度低、價格高等不足。

所以，建立MRV的可靠檢測方法，及時發(fā)現(xiàn)并監(jiān)測實驗鼠的健康狀況，降低因?qū)嶒炇蟾腥驹斐蓢乐氐慕?jīng)濟損失，本研究擬建立一種快速、簡便、敏感、特異的MRV熒光定量PCR檢測方法，旨在為監(jiān)測MRV提供方法支持。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的引物對、探針、試劑盒及方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的引物對，所述引物對具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的堿基序列。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的探針，采取了以下技術(shù)方案：

一種熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的探針，所述探針具有如SEQ ID No:3所示的堿基序列。

在其中一些實施例中，所述探針的5’結(jié)合有FAM，所述探針的3’結(jié)合有BHQ1。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的試劑盒，采取了以下技術(shù)方案：

一種熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的試劑盒，所述試劑盒包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物對、以及SEQ ID No:3所示的探針。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的方法，采取了以下技術(shù)方案：

一種熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的方法，包括以下步驟：以鼠的腦組織的cDNA為模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2為引物，SEQ ID No:3為探針，進行熒光定量RT-PCR擴增，采集熒光信號。

在其中一些實施例中，所述熒光定量RT-PCR擴增的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq 10μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、cDNA模板2μL、SEQ ID No:1引物0.4μL、SEQ ID No:2引物0.4μL、SEQ ID No:3探針0.8μL、加滅菌蒸餾水至20μL。

在其中一些實施例中，所述熒光定量RT-PCR擴增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，60℃退火延伸34sec，40個循環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明通過設(shè)計出特異性的引物對和探針，優(yōu)化熒光定量RT-PCR檢測方法的反應(yīng)條件，從而快速、準確、特異性地針對小鼠體內(nèi)鼠輪狀病毒核酸(MRV)進行檢測，不僅可以實現(xiàn)對實驗鼠的大樣本篩查，也可以對細胞系和生物原材料進行外源因子檢測；

2、本發(fā)明的熒光定量RT-PCR檢測方法理論上只需收集能提取到微量的cDNA的組織即可，MRV主要生長于小腸上皮細胞內(nèi)，感染鼠的糞便中也會大量含有病原體病毒，所以可以收集新鮮糞便，抽提cDNA，且本發(fā)明僅需要合成引物對，探針，染料試劑盒，便可方便快捷的檢測幾千個樣本，便捷廉價；

3、本發(fā)明的熒光定量RT-PCR檢測方法的最低檢測限為10個拷貝數(shù)/μL，高于普通PCR方法100倍，常見的小鼠病毒株均無特異性擴增，沒發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2％，靈敏度、重復(fù)性和特異性都可以保證。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1的臨床樣本的檢測結(jié)果(X-軸表示PCR循環(huán)數(shù)，Y-軸表示擴增反應(yīng)的熒光值)；

圖2為本發(fā)明試驗例1中熒光定量PCR檢測方法的標準曲線圖；

圖3為本發(fā)明試驗例1中熒光定量PCR檢測方法的動力學曲線圖；其中，1-8號對應(yīng)模板濃度依次為：1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹、1×10⁰拷貝數(shù)/μL；9為陰性對照(X-軸表示PCR循環(huán)數(shù)，Y-軸表示擴增反應(yīng)的熒光值)；

圖4為本發(fā)明試驗例1中熒光定量PCR檢測方法的特異性結(jié)果圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學實驗指南》(F.M.奧斯伯,R.E.金斯頓,J.G.塞德曼等主編，馬學軍,舒躍龍的譯.北京：科學出版社，2004)中所述的方法進行。

實施例1熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒

1、實驗樣品

來自上海實驗動物研究中心的小鼠的腸道組織樣品病料246份。

2、cDNA合成

取部分小鼠的腸道組織，加PBS加鋼珠放入震蕩器中震蕩1min左右，離心4000rpm，2min，吸去上清，提取RNA。提取方法參照TIANamp Virus RNA Kit提取盒說明書，提取的核酸RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

模板為提取的病毒RNA，引物對為OligdT18，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系(40μL)為：RNA模板20μL，引物對2μL，5×反轉(zhuǎn)錄Buffer 8μL，dNTP(10mmol/L)4μL，Ribonuclease Inhibitor(40U/μL)1μL，Prime Script反轉(zhuǎn)錄酶(200U)1μL，DEPC水4μL。42℃水浴1h，70℃水浴10min，冰浴4min。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、設(shè)計引物對和探針

根據(jù)NCBI上發(fā)表的鼠輪狀病毒PEC9毒株全基因組序列(DQ288856.1)，在其保守特異區(qū)域919-1022nt處，設(shè)計了引物對和探針：

上游引物對qRT-MRV-F，其序列為：

5’-AATTGCTTCTTCAGCCACATTC-3’(SEQ ID No:1)

下游引物對qRT-MRV-R，其序列為：

5’-CCTTCTCGGTCTGTGC TATTC-3’(SEQ ID No:2)

Taqman探針FAM-MRV，其序列為：

5’-FAM-ACGTTAACCTGCTATCAGAGCAGCTG-BHQ1-3’(SEQ ID No:3)。

4、TaqMan熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR擴增反應(yīng)總體系為20μL，其中：

熒光定量PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，60℃退火延伸34sec，40個循環(huán)，采集熒光。

5、檢測結(jié)果

檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，上海實驗動物研究中心的小鼠中未出現(xiàn)鼠輪狀病毒(MRV)的感染，利用本實施例的檢測方法可以實現(xiàn)針對鼠輪狀病毒的監(jiān)控目的。

試驗例1熒光定量RT-PCR的標準曲線的繪制及最佳線性范圍的確定

本試驗例檢測了實施例1建立的MRV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法的特異性，敏感性和穩(wěn)定性。

1、標準曲線和動力學曲線的繪制

人工合成鼠輪狀病毒EB-C8/G16P[16]毒株(Genbank：KJ477127.1)全基因組的2421-2528nt DNA序列，送GENEWIZ公司合成，與pUC57載體連接，構(gòu)建pUC-MRV的質(zhì)粒標準品。按1×10⁸拷貝數(shù)/μL為起始模板濃度，以10倍比稀釋次數(shù)(分別為1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹、1×10⁰拷貝數(shù)/μL)和相應(yīng)的Ct值繪制出標準曲線和動力學曲線，標準曲線如圖2所示，從圖2可知，當MRV的最終濃度分別在1×10⁷～1×10⁰拷貝數(shù)/μL時，其相關(guān)系數(shù)R²大于0.99，標準曲線都具有良好的線關(guān)系，各個稀釋度相關(guān)性好，誤差較??；擴增效率E＝2.22，擴增效率理想，說明優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件很好。動力學曲線如圖3所示，MRV的靈敏度可以達到10個拷貝/μL，且動力學擴增曲線指數(shù)增長階段和平臺期都完整，熒光定量PCR的結(jié)果是可靠的。

2、敏感性試驗

將pUC-MRV的質(zhì)粒標準品分別做8個稀釋度從1×10⁷～1×10⁰拷貝數(shù)/μL，以倍比稀釋為模板分別進行熒光定量PCR擴增，Ct值大于35，視為陰性，同時利用引物對SEQ ID No:1和SEQ ID No:2進行常規(guī)RT-PCR擴增。

檢測結(jié)果如圖3，結(jié)果表明，利用本發(fā)明的方法檢測MRV標準質(zhì)粒的靈敏度可達1×10¹拷貝數(shù)/μL，而普通PCR最低可以檢測到1×10³拷貝數(shù)/μL，說明本發(fā)明的方法高于普通PCR方法1000倍。

3、特異性試驗

通過本發(fā)明實施例1的檢測方法，分別對小鼠通常感染的病毒，小鼠微小病毒(MVM)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠肝炎病毒A59株(MHV-A59)、仙臺病毒(SEV)均由上海實驗動物研究中心提供。MVM提取病毒DNA，PVM、MHV-A59和SEV提取病毒總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為DNA。在調(diào)整濃度后，分別作為模板進行EMV的實時熒光定量PCR反應(yīng)，進行檢測，驗證方法的特異性。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，除MRV標準品會有特征性的擴增曲線外，其他病毒均沒有特征性的擴增曲線，證明本發(fā)明建立的熒光定量PCR檢測方法特異性強，與其他常見的鼠類病毒株均無交叉反應(yīng)。在圖4中，1：MVM；2：PVM；3：MHV-A59；4：SEV；5：陰性對照。

4、重復(fù)性試驗

以MRV質(zhì)粒標準品中的1×10⁶和1×10⁴拷貝數(shù)/μL兩個稀釋度的作為模板，對這兩個稀釋度在不同時間段進行2次重復(fù)測定，每次對同一模板同時進行3次重復(fù)測定及設(shè)置3個重復(fù)孔，按照本發(fā)明實施例1所述的方法進行實時熒光定量PCR。其中：變異系數(shù)(β)＝標準偏差(SD)/平均數(shù)(X)，結(jié)果見表1。

表1.熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性

表1結(jié)果表明批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2％，說明本發(fā)明建立的熒光定量PCR檢測方法具有較好的重復(fù)性，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。

序 列 表

＜110＞ 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所

＜120＞ 熒光定量RT-PCR檢測鼠輪狀病毒的引物對、探針、試劑盒及方法

＜130＞ 3

＜170＞ PatentIn version 3.1

＜210＞ 1

＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 1

aattgcttct tcagccacat tc 22

＜210＞ 2

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 2

ccttctcggt ctgtgctatt c 21

＜210＞ 3

＜211＞ 26

＜212＞ DNA

＜213＞ 人工序列

＜400＞ 3

acgttaacct gctatcagag cagctg 26