本項發(fā)明主要涉及到植物病毒全序列的快速擴增及DNA重組技術(shù)，具體涉及朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒全序列的擴增、克隆轉(zhuǎn)化及其專用引物。

背景技術(shù)：

朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)是2013年在中國云南發(fā)現(xiàn)的番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)的新種，屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)。該病毒危害極為嚴重，能夠侵染朱頂紅(Hippeastrum rutilum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、喜林芋(Philodendron bipinnatifidum)、煙草(Nicotiana tabacum)、蜘蛛蘭(Hymenocallis littoralis)、君子蘭(Clivia miniata)等經(jīng)濟作物，引起染病植物出現(xiàn)壞死、壞死斑、同心環(huán)紋、葉片畸形等癥。目前已在中國南部地區(qū)如云南、廣東、廣西、福建和海南等地鑒定出該病毒，危害極為嚴重。

HCRV病毒粒子呈球形，直徑為80-120nm。其核酸為三分體基因組，從大到小分別為L，M，S序列，S RNA序列長約2745nt，正向編碼一個非結(jié)構(gòu)蛋白NSs(Non-structural protein by the small RNA)，反向編碼核殼體蛋白NP(Nucleocapsid protein)。M RNA序列長約4762nt，正向編碼一個非結(jié)構(gòu)蛋白Nsm(Non-structural protein by the middle RNA)，反向編碼糖蛋白前體Gn/G(Glycoproteins)。L RNA序列長約8908bp，編碼依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)。

基于HCRV病毒基因組序列比較長，目前還沒有一種快速獲得該病毒全序列的方法。正是因為該病毒序列較長，對該病毒序列進行克隆轉(zhuǎn)化較為困難，導致NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的HCRV S，M和L序列各自分別僅有一條。而與HCRV同屬于Tospovirus的番茄斑萎病毒(TSWV)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布了上百條序列。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒全序列的分子生物學方法及其專用引物。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1.一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒S序列的專用引物HCRV-S，該專用引物HCRV-S由HCRV-S前引物和HCRV-S后引物組成，所述HCRV-S前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述HCRV-S后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目標產(chǎn)物片段長度為2745bp。

2.一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒M1序列的專用引物HCRV-M1，該專用引物HCRV-M1由HCRV-M1前引物和HCRV-M1后引物組成，所述HCRV-M1前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述HCRV-M1后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，目標產(chǎn)物片段長度為2558bp。

3.一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒M2序列的專用引物HCRV-M2，所述專用引物HCRV-M2由HCRV-M2前引物和HCRV-M2后引物組成，所述HCRV-M2前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述HCRV-M2后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，目標產(chǎn)物片段長度為2383bp。

4.一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L1序列的專用引物HCRV-L1，所述專用引物HCRV-L1由HCRV-L1前引物和HCRV-L1后引物組成，所述HCRV-L1前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述HCRV-L1后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，目標產(chǎn)物片段長度為3115bp。

5.一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L2序列的專用引物HCRV-L2，所述專用引物HCRV-L2由HCRV-L2前引物和HCRV-L2后引物組成，所述HCRV-L2前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述HCRV-L2后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：10所示，目標產(chǎn)物片段長度為3337bp。

6.一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L3序列的專用引物HCRV-L3，所述專用引物HCRV-L3由HCRV-L3前引物和HCRV-L3后引物組成，所述HCRV-L3前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：11所示，所述HCRV-L3后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：12所示，目標產(chǎn)物片段長度為3206bp。

7.一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L4序列的專用引物HCRV-L4，所述專用引物HCRV-L4由HCRV-L4前引物和HCRV-L4后引物組成，所述HCRV-L4前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：13所示，所述HCRV-L4后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：14所示，目標產(chǎn)物片段長度為673bp。

8.一組快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒全序列的專用引物，它是由專用引物HCRV-S、專用引物HCRV-M1、專用引物HCRV-M2、專用引物HCRV-L1、專用引物HCRV-L2、專用引物HCRV-L3和專用引物HCRV-L4組成；

所述專用引物HCRV-S由HCRV-S前引物和HCRV-S后引物組成，所述引物HCRV-S前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述引物HCRV-S后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，目標產(chǎn)物片段長度為2745bp；

所述專用引物HCRV-M1由HCRV-M1前引物和HCRV-M1后引物組成，所述HCRV-M1前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述HCRV-M1后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，目標產(chǎn)物片段長度為2558bp；

所述專用引物HCRV-M2是由HCRV-M2前引物和HCRV-M2后引物組成，所述HCRV-M2前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述HCRV-M2后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：6所示，目標產(chǎn)物片段長度為2383bp；

所述專用引物HCRV-L1由HCRV-L1前引物和HCRV-L1后引物組成，所述HCRV-L1前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：7所示，所述HCRV-L1后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：8所示，目標產(chǎn)物片段長度為3115bp；

所述專用引物HCRV-L2由HCRV-L2前引物和HCRV-L2后引物組成，所述HCRV-L2前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，所述HCRV-L2后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：10所示，目標產(chǎn)物片段長度為3337bp；

所述專用引物HCRV-L3由HCRV-L3前引物和HCRV-L3后引物組成，所述HCRV-L3前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：11所示，所述HCRV-L3后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：12所示，目標產(chǎn)物片段長度為3206bp；

所述專用引物HCRV-L4由HCRV-L4前引物和HCRV-L4后引物組成，所述HCRV-L4前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：13所示，所述HCRV-L4后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：14所示，目標產(chǎn)物片段長度為673bp。

9.一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒全序列的分子生物學方法，包括提取感染朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒樣品的總RNA，RT-PCR，用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，克隆轉(zhuǎn)化，測序和序列拼接；其特征在于：在對朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒進行序列擴增時，分別所用的引物是技術(shù)方案8所述的一組快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒全序列的專用引物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中最早公布的HCRV-HLS1-2的S segment(GenBank登錄號：JX833564.1)、M segment(GenBank登錄號：JX833565.1)、HCRV L segment(GenBank登錄號：HG763861.1)序列設(shè)計了7對特異性引物，其中針對HCRV的S序列設(shè)計了1對引物HCRV-S，可以直接擴增出HCRV S RNA的全序列(擴增片段長度：2745bp)。針對HCRV的M序列設(shè)計了2對引物，分別為HCRV-M1(擴增片段長度：2558bp)和HCRV-M2(擴增片段長度：2383bp)。針對HCRV的L序列設(shè)計了4對引物。分別為HCRV-L1(擴增片段長度：3115bp)，HCRV-L2(擴增片段長度：3337bp)，HCRV-L3(擴增片段長度：3206bp)，HCRV-L4(擴增片段長度：673bp)。擴增出這7個片段的PCR產(chǎn)物后，將其連接到T載體上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，通過菌液PCR篩選出陽性重組子后，每個片段送三個陽性重組子到測序公司進行測序。待測序公司返回的每個重組子的測序結(jié)果后，人工去掉序列上的載體序列，并利用NCBI將去掉載體序列的HCRV各片段進行Blast，確保序列是我們所需的目的序列，同時確保序列的方向是從5’到3’。然后利用DNAstar軟件的Seqman程序?qū)1和M2進行序列拼接，獲得HCRV的M全序列。對L1，L2，L3和L4進行序列拼接，獲得HCRV的L全序列。目前，通過克隆轉(zhuǎn)化的方法獲得某基因組序列，一般都是克隆1000bp左右的序列，然后通過拼接的方法獲得全序列，導致工作量極為巨大，試劑成本高昂。本發(fā)明具有快速，工作量小，可靠的特點，僅用7對引物就擴增出HCRV三條序列共16415bp的全序列，克隆轉(zhuǎn)化所需載體及感受態(tài)細胞少，從而減少了獲取病毒全序列所需要的時間以及成本，可以幫助快速的獲取HCRV病毒的全基因組序列，方便研究人員對想要獲得的HCRV病毒分離物進行全基因組分析。

因此，本發(fā)明不僅準確，可靠，特異性高，而且能夠節(jié)省時間和成本。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是HCRV-S前引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是HCRV-S后引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是HCRV-M1前引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是HCRV-M1后引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是HCRV-M2前引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：6所示的是HCRV-M2后引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：7所示的是HCRV-L1前引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：8所示的是HCRV-L1后引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：9所示的是HCRV-L2前引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：10所示的是HCRV-L2后引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：11所示的是HCRV-L3前引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：12所示的是HCRV-L3后引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：13所示的是HCRV-L4前引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：14所示的是HCRV-L4后引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：15所示的是引物TSWV-NP-F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：16所示的是引物TSWV-NP-F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：17所示的是引物HCRV-NP-F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：18所示的是引物HCRV-NP-R的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：19所示的是引物CCSV-NP-F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：20所示的是引物CCSV-NP-R的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：21所示的是引物TZSV-NP-F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：22所示的是引物TZSV-NP-R的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：23所示的是引物INSV-NP-F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：24所示的是引物INSV-NP-R的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：25所示的是引物CaCV-NP-F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：26所示的是引物CaCV-NP-R的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：27所示的是通用引物的前引物J13的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：28所示的是通用引物的后引物UHP的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：29所示的是HCRV-S全序列。

序列表中SEQ ID NO：30所示的是HCRV-M全序列。

序列表中SEQ ID NO：31所示的是HCRV-L全序列。

序列表中SEQ ID NO：32所示的是通用引物M13前引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：33所示的是通用引物M13后引物的堿基序列。

附圖說明

圖1：提取的蔥蓮樣本總RNA電泳檢測圖，M泳道為2000bp分子量的marker，RNA泳道表示提取的蔥蓮總RNA。

圖2：對采集到的蔥蓮樣本進行病毒PCR鑒定的電泳圖，泳道1到6為番茄斑萎病毒屬病毒的特異性引物擴增產(chǎn)物，其中泳道1為HCRV-NP引物擴增條帶，泳道2為CCSV-NP引物擴增條帶，泳道3為TZSV-NP引物擴增條帶，泳道4為CaCV-NP引物擴增條帶，泳道5為TSWV-NP引物擴增條帶，泳道6為INSV-NP引物擴增條帶，泳道7是番茄斑萎病毒屬通用引物擴增產(chǎn)物，M泳道是2000bp分子量的marker。

圖3：本發(fā)明所設(shè)計的7對HCRV序列擴增引物：專用引物HCRV-S,專用引物HCRV-M1，專用引物HCRV-M2，專用引物HCRV-L1，專用引物HCRV-L2，專用引物HCRV-L3，專用引物HCRV-L4進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中泳道M為10000bp分子量的marker，S泳道為專用引物HCRV-S經(jīng)PCR擴增的條帶，M1為專用引物HCRV-M1經(jīng)PCR擴增的條帶，M2為專用引物HCRV-M2經(jīng)PCR擴增的條帶，L1為專用引物HCRV-L1經(jīng)PCR擴增的條帶，L2為專用引物HCRV-L2經(jīng)PCR擴增的條帶，L3為專用引物HCRV-L3經(jīng)PCR擴增的條帶，L4為專用引物HCRV-L4經(jīng)PCR擴增的條帶。

圖4：專用引物HCRV-S經(jīng)PCR擴增的HCRV-S產(chǎn)物經(jīng)過克隆轉(zhuǎn)化，挑取單菌落搖菌后的菌液PCR電泳圖。M是10000bp的marker，其余泳道為挑取的20管HCRV-S片段的單菌落搖菌后的菌液PCR。

圖5：專用引物HCRV-M1經(jīng)PCR擴增的HCRV-M1產(chǎn)物經(jīng)過克隆轉(zhuǎn)化，挑取單菌落搖菌后的菌液PCR電泳圖。M是10000bp的marker，其余泳道為挑取的20管HCRV-M1片段的單菌落搖菌后的菌液PCR。

圖6：專用引物HCRV-L3經(jīng)PCR擴增的HCRV-L3產(chǎn)物經(jīng)過克隆轉(zhuǎn)化，挑取單菌落搖菌后的菌液PCR電泳圖。M是10000bp的marker，其余泳道為挑取的17管HCRV-L3片段的單菌落搖菌后的菌液PCR。

圖7：專用引物HCRV-L4經(jīng)PCR擴增的HCRV-L4產(chǎn)物經(jīng)過克隆轉(zhuǎn)化，挑取單菌落搖菌后的菌液PCR電泳圖。其中M是10000bp的marker，其余泳道為挑取的20管HCRV-L4片段的單菌落搖菌后的菌液PCR。

具體實施方式

以下結(jié)合具體的實例對本發(fā)明作進一步闡述，以便于更好地理解本發(fā)明。

下列實施例中實驗方法無特殊說明的為常規(guī)方法，所用試劑、材料，均能從生化試劑公司等購買到。

實施例1本發(fā)明所用到的實驗材料的采集及鑒定方法。

①樣品的采集

本發(fā)明所用帶毒植物樣品采集自云南省昆明市具有壞死、褪綠、葉片畸形等HCRV病毒典型癥狀的蔥蓮(Zephyranthes candida)植株。

②RNA的提取

應(yīng)用植物總RNA提取試劑盒(購置于北京全式金公司)從上述步驟①中取得的新鮮植株組織中提取RNA，操作步驟根據(jù)北京全式金公司植物總RNA提取試劑盒提供的使用說明操作(RNA電泳圖見附圖1)。

③RT-PCR鑒定該樣品

本實驗用大連寶生物工程有限公司(大連TaKaRa公司)提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成RT反應(yīng)(反應(yīng)體系見表1和續(xù)表1)，獲得感病樣本的cDNA。然后利用SuperMix酶(北京全式金公司)，以cDNA為模板，利用6對特異性引物和1對通用引物(引物信息見表3)進行擴增(反應(yīng)體系見表2)。如果對應(yīng)引物擴增出目的條帶，則說明樣品中有該病毒侵染。

表1 RT反應(yīng)體系

置于PCR儀65℃孵育5min，置于冰上。

續(xù)表1 RT反應(yīng)體系

RT反應(yīng)程序：30℃10min，42℃30-60min，95℃5min。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：94℃5min，從94℃30sec，55℃30sec至72℃1min，35個循環(huán)，72℃10min。

表3蔥蓮樣本鑒定所用引物信息

表3中：HCRV-NP表示擴增朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)的核殼體蛋白基因(Nucleocapsid protein，NP)的特異性引物，CCSV-NP表示檢測馬蹄蓮褪綠斑病毒(Calla lily chlorotic spot virus，CCSV)NP基因的特異性引物，TZSV-NP表示擴增番茄環(huán)紋斑點病毒(Tomato zonate spot virus，TZSV)NP基因的特異性引物，CaCV-NP表示擴增辣椒褪綠病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)NP基因的特異性引物，TSWV-NP表示擴增番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)NP基因的特異性引物，INSV-NP表示擴增鳳仙花壞死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)NP基因的特異性引物，J13表示番茄斑萎病毒屬的通用引物的前引物，UHP表示番茄斑萎病毒屬的通用引物的后引物。

④電泳檢測

PCR反應(yīng)終止后，取5μl PCR產(chǎn)物，1.2％瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果。能夠擴增出對應(yīng)引物目的條帶的片段即為對應(yīng)病毒侵染。本發(fā)明所用實驗材料鑒定結(jié)果電泳圖見圖2，電泳結(jié)果顯示特異性引物中僅有HCRV-NP引物能夠擴增出目的條帶，證明樣品是HCRV侵染的。

實施例2本發(fā)明快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒S序列的專用引物HCRV-S的設(shè)計和用該專用引物HCRV-S快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒S序列的方法。

①用引物HCRV-S及其設(shè)計與合成

專用引物HCRV-S是以在NCBI上公布的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒HLS1-2株系的S序列(GenBank登錄號：JX833564.1)為模板，使用Primer 6.0設(shè)計的，將其編號為專用引物HCRV-S，它是由HCRV-S前引物和HCRV-S后引物組成，所述HCRV-S前引物的堿基序列如SEQ ID NO：1所示，所述HCRV-S后引物的堿基序列如SEQ ID NO：2所示，該專用引物HCRV-S的目標產(chǎn)物是HCRV S RNA的全長即HCRV-S全序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，擴增片段長度為2745bp。

上述專用引物HCRV-S由北京擎科生物技術(shù)有限責任公司合成。

②專用引物HCRV-S的擴增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以實施例1中獲得的cDNA為模板，利用本發(fā)明所設(shè)計的專用引物HCRV-S進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系見表4。

表4專用引物HCRV-S進行PCR的反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：95℃1min，從95℃20sec，50℃20sec至72℃1min30sec 40個循環(huán)，72℃5min。

③瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR反應(yīng)終止后，取5μl PCR產(chǎn)物，1.2％瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果。能夠擴增出2745bp左右的片段即為HCRV的S片段。本實施例HCRV S片段擴增電泳圖見圖3中的S泳道。

實施例3本發(fā)明快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒M1序列的專用引物HCRV-M1的設(shè)計和用該專用引物HCRV-M1快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒M1序列的方法。

①用引物HCRV-M1及其設(shè)計與合成

專用引物HCRV-M1是以在NCBI上公布的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒HLS1-2株系的M序列(GenBank登錄號：JX833565.1)為模板，使用Primer 6.0設(shè)計的，將其編號為專用引物HCRV-M1，它是由HCRV-M1前引物和HCRV-M1后引物組成，所述HCRV-M1前引物的堿基序列如SEQ ID NO：3所示，所述HCRV-M1后引物的堿基序列如SEQ ID NO：4所示，該專用引物HCRV-M1的擴增范圍是HCRV M片段的1-2558bp，擴增片段長度為2558bp。

上述專用引物HCRV-M1由北京擎科生物技術(shù)有限責任公司合成。

②專用引物HCRV-M1的擴增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以實施例1中獲得的cDNA為模板，利用本發(fā)明所設(shè)計的專用引物HCRV-M1進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系見表5。

表5專用引物HCRV-M1進行PCR的反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：95℃1min，從95℃20sec，50℃20sec至72℃1min15sec40個循環(huán)，72℃5min。

③瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR反應(yīng)終止后，取5μl PCR產(chǎn)物，1.2％瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果。能夠擴增出2558bp左右的片段即為HCRV的M1片段。本實施例HCRV M1片段擴增電泳圖見圖3中的M1泳道。

實施例4本發(fā)明快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒M2序列的專用引物HCRV-M2的設(shè)計和用該專用引物HCRV-M2快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒M2序列的方法。

①引物HCRV-M2及其設(shè)計與合成

專用引物HCRV-M2是以在NCBI上公布的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒HLS1-2株系的M序列(GenBank登錄號：JX833565.1)為模板，使用Primer 6.0設(shè)計的，將其編號為專用引物HCRV-M2，它是由HCRV-M2前引物和HCRV-M2后引物組成，所述HCRV-M2前引物的堿基序列如SEQ ID NO：5所示，所述HCRV-M2后引物的堿基序列如SEQ ID NO：6所示，該專用引物HCRV-M2的擴增范圍是HCRV M片段的2380-4762bp，擴增片段長度為2383bp。

上述專用引物HCRV-M2由北京擎科生物技術(shù)有限責任公司合成。

②專用引物HCRV-M2的擴增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以實施例1中獲得的cDNA為模板，利用本發(fā)明所設(shè)計的專用引物HCRV-M2進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系見表6。

表6專用引物HCRV-M2進行PCR的反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：95℃1min，95℃20sec，50℃20sec至72℃1min 15sec40個循環(huán)，72℃5min。

③瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR反應(yīng)終止后，取5μl PCR產(chǎn)物，1.2％瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果。能夠擴增出2383bp左右的片段即為HCRV的M2片段。本實施例HCRV M2片段擴增電泳圖見圖3中的M2泳道。

實施例5本發(fā)明快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L1序列的專用引物HCRV-L1的設(shè)計和用該專用引物HCRV-L1快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L1序列的方法。

①用引物HCRV-L1及其設(shè)計與合成

專用引物HCRV-L1是以在NCBI上公布的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的L序列(GenBank登錄號：HG763861.1)為模板，使用Primer 6.0設(shè)計的，將其編號為專用引物HCRV-L1，它是由HCRV-L1前引物和HCRV-L1后引物組成，所述HCRV-L1前引物的堿基序列如SEQ ID NO：7所示，所述HCRV-L1后引物的堿基序列如SEQ ID NO：8所示，該專用引物HCRV-L1的擴增范圍是HCRV L片段的1-3115bp，擴增片段長度為3115bp。

上述專用引物HCRV-L1由北京擎科生物技術(shù)有限責任公司合成。

②專用引物HCRV-L1的擴增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以實施例1中獲得的cDNA為模板，利用本發(fā)明所設(shè)計的專用引物HCRV-L1進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系見表7。

表7專用引物HCRV-L1進行PCR的反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：95℃1min，95℃20sec，50℃20sec至72℃1min 30sec 40個循環(huán)，72℃5min。

③瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR反應(yīng)終止后，取5μl PCR產(chǎn)物，1.2％瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果。能夠擴增出3115bp左右的片段即為HCRV的L1片段。本實施例HCRV L1片段擴增電泳圖見圖3中的L1泳道。

實施例6本發(fā)明快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L2序列的專用引物HCRV-L2的設(shè)計和用該專用引物HCRV-L2快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L2序列的方法。

①用引物HCRV-L2及其設(shè)計與合成

專用引物HCRV-L2是以在NCBI上公布的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的L序列(GenBank登錄號：HG763861.1)為模板，使用Primer 6.0設(shè)計的，將其編號為專用引物HCRV-L2，它是由HCRV-L2前引物和HCRV-L2后引物組成，所述HCRV-L2前引物的堿基序列如SEQ ID NO：9所示，所述HCRV-L2后引物的堿基序列如SEQ ID NO：10所示，該專用引物HCRV-L2的擴增范圍是HCRV L片段的2654-5990bp，擴增片段長度為3337bp。

上述專用引物HCRV-L2由北京擎科生物技術(shù)有限責任公司合成。

②專用引物HCRV-L2的擴增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以實施例1中獲得的cDNA為模板，利用本發(fā)明所設(shè)計的專用引物HCRV-L2進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系見表8。

表8專用引物HCRV-L2進行PCR的反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：95℃1min，從95℃20sec，50℃20sec至72℃1min 45sec40個循環(huán)，72℃5min。

③瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR反應(yīng)終止后，取5μl PCR產(chǎn)物，1.2％瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果。能夠擴增出3337bp左右的片段即為HCRV的L2片段。本實施例HCRV L2片段擴增電泳圖見圖3中的L2泳道。

實施例7本發(fā)明快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L3序列的專用引物HCRV-L3的設(shè)計和用該專用引物HCRV-L3快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L3序列的方法。

①用引物HCRV-L3及其設(shè)計與合成

專用引物HCRV-L3是以在NCBI上公布的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的L序列(GenBank登錄號：HG763861.1)為模板，使用Primer 6.0設(shè)計的，將其編號為專用引物HCRV-L3，它是由HCRV-L3前引物和HCRV-L3后引物組成，所述HCRV-L3前引物的堿基序列如SEQ ID NO：11所示，所述HCRV-L3后引物的堿基序列如SEQ ID NO：12所示，該專用引物HCRV-L3的擴增范圍是HCRV L片段的5631-8836bp，擴增片段長度為3206bp。

上述專用引物HCRV-L3由北京擎科生物技術(shù)有限責任公司合成。

②專用引物HCRV-L3的擴增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以實施例1中獲得的cDNA為模板，利用本發(fā)明所設(shè)計的HCRV-L3引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系見表9。

表9專用引物HCRV-L3進行PCR的反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：95℃1min，95℃20sec，50℃20sec至72℃1min 45sec40個循環(huán)，72℃5min。

③瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR反應(yīng)終止后，取5μl PCR產(chǎn)物，1.2％瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果。能夠擴增出3206bp左右的片段即為HCRV的L3片段。本實施例HCRV L3片段擴增電泳圖見圖3中的L3泳道。

實施例8本發(fā)明快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L4序列的專用引物HCRV-L4的設(shè)計和用該專用引物HCRV-L4快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒L4序列的方法。

①用引物HCRV-L4及其設(shè)計與合成

專用引物HCRV-L4是以在NCBI上公布的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的L序列(GenBank登錄號：HG763861.1)為模板，使用Primer 6.0設(shè)計的，將其編號為專用引物HCRV-L4，它是由HCRV-L4前引物和HCRV-L4后引物組成，所述HCRV-L4前引物的堿基序列如SEQ ID NO：13所示，所述HCRV-L4后引物的堿基序列如SEQ ID NO：14所示，該專用引物HCRV-L4的擴增范圍是HCRV L片段的8236-8908bp，擴增片段長度為673bp。

上述專用引物HCRV-L4由北京擎科生物技術(shù)有限責任公司合成。

②專用引物HCRV-L4的擴增

利用FastPfu高保真酶(北京全式金公司)，以實施例1中獲得的cDNA為模板，利用本發(fā)明所設(shè)計的HCRV-L4引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系見表10。

表10專用引物HCRV-L4進行PCR的反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：95℃1min，從95℃20sec，50℃20sec至72℃30sec 40個循環(huán)，72℃5min。

③瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR反應(yīng)終止后，取5μl PCR產(chǎn)物，1.2％瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果。能夠擴增出673bp左右的片段即為HCRV的L4片段。本實施例HCRV L4片段擴增電泳圖見圖3中的L4泳道。

實施例9PCR產(chǎn)物的純化，克隆轉(zhuǎn)化，測序及序列拼接

①PCR產(chǎn)物膠回收純化

利用膠回收純化試劑盒(北京百泰克公司)將實施例2-8中擴增出來的PCR產(chǎn)物進行膠回收純化。若擴增得到的PCR產(chǎn)物在電泳檢測結(jié)果顯示目的條帶單一且明亮，可以省去這一步。

②PCR產(chǎn)物克隆轉(zhuǎn)化

利用pEASY T1載體(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)對上一步驟①獲得的條帶單一且明亮的HCRV 7個片段的PCR產(chǎn)物進行克隆，具體步驟如下：

a.克隆體系的建立

在PCR管中依次加入已純化的PCR產(chǎn)物4μL，pEASY T1Cloning Vector 1μL，輕輕混合。7個片段中S,M1，M2，L1，L2，L3都是25℃反應(yīng)20min，L4片段是25℃反應(yīng)10min。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。

b.轉(zhuǎn)化

1.將連接產(chǎn)物加入50μL Trans T1感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴30min。

2.42℃熱激30s，立即置于冰上2min。

3.加250μL LB液體培養(yǎng)基，200r/min，37℃孵育1h。

4.準備好含有千分之一氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，制備平板，待其凝固。

5.每塊平板上加入20μL的X-gal(20mg/mL)以及8μL的IPTG(25mg/mL),均勻涂布后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱30min。

6.取100μL的菌液均勻涂布在LB平板上，37℃倒置過夜。

③挑取單菌落培養(yǎng)

從過夜培養(yǎng)的平板里挑取白色的單菌落，置于5mL的液體LB培養(yǎng)基中，置于37℃，200r/min的搖床中培養(yǎng)8h。

④菌液PCR及電泳檢測

通過菌液PCR的方法對挑取的菌進行篩選，利用T載體的通用引物M13F/R對各自片段對應(yīng)的菌液進行菌液PCR擴增，如果電泳檢測條帶大小正確，則說明是陽性菌液。菌液PCR是利用保真酶Primerstar Max進行PCR的，PCR反應(yīng)程序及體系見表11。

表11菌液PCR反應(yīng)體系

⑤將陽性重組子菌液送到測序公司測序

將上一步④中篩選出來的陽性重組子，送三個到鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序。測序的引物是用的T載體的通用引物M13。

⑥對測序公司返回的菌液送測結(jié)果進行處理得到S,M1，M2，L1，L2，L3，L4。

序列處理主要是有兩個方面，第一是去掉載體序列；第二是確保序列的方向是從5’-3’的。

⑦序列拼接及病毒全序列的獲得

步驟⑥中去掉載體序列后的S序列即為朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的S全序列，該朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的S序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，該序列全長2745nt。

利用DNAstar(http://www.dnastar.com/)軟件中的Seqman程序?qū)Σ襟E⑥中得到的M1，M1進行序列拼接處理，從而得到了朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的M全序列，該朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的M序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示；該序列全長4762nt。

利用DNAstar軟件中的Seqman程序?qū)Σ襟E⑥中得到的L1，L2，L3，L4進行序列拼接處理，從而得到了朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的L全序列,該朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的L序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示；該序列全長8908nt。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南農(nóng)業(yè)大學

<120> 一種快速獲得朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒全序列的分子生物學方法及其引物

<130> /

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 1

agagcaatcg aggtataaac aaataatcat acac 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 2

agagcaatcg aggtataaaa cataaattct gaac 34

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 3

acaattaaat atctaaaaca gcttc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 4

gaactaggtt gccttgctat aaatg 25

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 5

tgtattggga ctctatctg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 6

agagcaatcg gtgcaataa 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 7

agagcaagtc gagcaacga 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 8

cagcaggaac attcagtaag g 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 9

attgtccctc taatctact 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 10

ttcaacccta actctact 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 11

aaaactggct ctggatag 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 12

cttaggcttc tcgattgt 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 13

agagcaagtc gagcaacg 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 14

atgacattaa gggcaagt 18

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus）

<400> 15

cacacttaag caagcacaag ca 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus）

<400> 16

accctaagaa acgactgcgc 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 17

cacaataaac acacaaaca 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 18

cttcctaagt aaacaccat 19

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 馬蹄蓮褪綠斑病毒（Calla lily chlorotic spot virus）

<400> 19

ttcaacaaat gcggcta 17

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 馬蹄蓮褪綠斑病毒（Calla lily chlorotic spot virus）

<400> 20

tgcaaagtgg ctaaagt 17

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus）

<400> 21

tggttaaaaa gacagatcat tgct 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus）

<400> 22

ctacttgcca acatgtctaa cgtc 24

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 鳳仙花壞死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus）

<400> 23

cccaaaatca atagtagc 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 鳳仙花壞死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus）

<400> 24

aggagaacat agtcaagc 18

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 辣椒褪綠病毒（Capsicum chlorosis virus）

<400> 25

acgcgtcgac tcacacttct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 辣椒褪綠病毒（Capsicum chlorosis virus）

<400> 26

cgggatccat gtctaacgtc 20

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）

<400> 27

cccggatcca gagcaat 17

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）

<400> 28

cactggatcc ttttgttttt gttttttg 28

<210> 29

<211> 2745

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 29

agagcaatcg aggtataaac aaataatcat acacagctgg aatcacaata agcaagaaat 60

actaattcag ccatgtctac cgttaaaaca acagcagttg aattcttctc caactacggg 120

ttatcttgcg attcccgttc aatcaatgac tgttacaggg tattctctag cagaggagaa 180

accctcatgg atgtctttat gcactcaact attggcatca aatctgcttt cagtataact 240

ggacttggag aaagtgagga cataaagact catgaagcag aaatcattga tgaacatcac 300

aattataatg tctttgagaa gtttggctta gacatgaatt tctgcaacca ccttttggag 360

ataactgtaa agaaaccatc tgtaaaaaac tatgagacaa aattccaaat gcacaatcaa 420

atatttgagc cttcagaaca gctgattagc tatggtatgg gtaaaatagc agagaaagat 480

ttttacaact gttctgagat ctctcctgaa gacatatacc caagtgattg gtttatcaat 540

gaagctaaga aaaagaactt ttacatggcc gacatctctg ggttcagcat ggactggggt 600

ttttctgtaa tgggaaggac aacatcttac tggaaagaaa acatggaaaa aacatcactg 660

gtttctgtgg agcagaaatc agcagctttt ccttcagtgc ctacaaacag agtactatct 720

gtttccacaa tcaaagcggt tgaaatagcc tctaaaattg catgtgataa atcaactatc 780

ctctcagtca ggcaagactt gagatcagat ctgagaactc aattcaggat ctcactgcct 840

ggagaataca gcgatgctag tgttgccaga acctacttgc ttcatcaggg cagtaaaggg 900

cagtatatat gcatttatgc aagaactact atggacagtc ctaatgagag aactacattg 960

ataataaaaa tcttcactca aagcaaacca ggtagtttca ccacaacact tcttccaaat 1020

gatcactcca actgtagaaa aatggttgga gctagttttg gcatagttga acaaagaatg 1080

acagatccta attacaataa aataattgct catgagctat tgtctgtgca cacaaacttt 1140

gctttaaaaa tatcaaaagt tttacaaaag cctgtgatag tgtacaaagt ctatgagaaa 1200

gaactccttc caaagagagt ggaaatagac ggcagaacgt tcaactacca agaagacatt 1260

gatggtaatg tttactttct gtcaacaact ttggcaattt tgcctctatc tctttctgtt 1320

ttgtcctatc tggattctgc ctccccaccc tgttggaagg agtctaaagg tttgggccac 1380

ttcactgtag aggagatcca gtaaatttaa ttataactag ctttttaaga tattagagtt 1440

atatcaacct aatccactct caatgtatgt aaataaatcg tttaaatata agccaataaa 1500

tcaaaaacaa aaaaatcaaa ttttaaatta aaaaaccaaa aaaccaaaaa aaccaaaaaa 1560

accaaaaaaa ccaaaaagag ccttcgggcc gattgtggtt tccttaccta ttacaagcat 1620

cagtaagaaa accatgattt gcccgaaggc tttttttgtt tgttttttgg ttttttggtt 1680

tttttgggtt ttgtttattt atttattttt atttctttta tttattattg ttttgagttt 1740

ttatttttta gttttatttt atttaaggtt ttttatgaaa cacaataaac acacaaacat 1800

ttgcaagcta tataacgcac aaatcatcaa ccaagaatta agagatcaat cagaatcctt 1860

gattcttctt agaagcagac ctaggttttg aagaactagc ttcattatca tcaacaattt 1920

taccaaaagc attctccaga gctttaatct gctcattgaa tttgttcaat gaagcagcac 1980

cagttgtccc gggagtgcag tcattcagaa tttttatggt ctcttcaaaa atctctttag 2040

cagttccagt gaaaacaaat tcttttgttg ccataactct ggctatttta catagctgct 2100

cataagtaga gaatttgttg atgcccagag cctctttttt aacattctgg aaatatgcca 2160

gcgggaatgc agctgcagca aatttgtcta agcttgccat tagggggaga ggaccaccta 2220

atgttagcat tactcttgca gtggttgcat caaatctggg gctaggtttt aagccatatg 2280

cattgaccat agggaggtca cacagttttt catacatttt ttgctgctca gttgaactct 2340

ctacagcaag cagttccata aacattttgg ctctaatgaa accctccaat ctcctgaacg 2400

tccaatcttc ttgtccaggg ttggaagtaa cattgggaac cacaatgggt ttcccttgga 2460

atttaaaatt ccctgctttc accattttgt aaatggcagc tctatttctc aaaatggtgt 2520

aaccgttgtt aaaagtcatt ttcacgttgc cattagccaa tacaaattcc ttgaagttga 2580

atcctgtggt ttcttcagct tcaatctcta catctgcttc gccacctgca agaagcttct 2640

caacgttcac tttgctcaac cttgcggtag tcatggtgtt tacttaggaa gctgcttact 2700

tggctgaagt tgttcagaat ttatgtttta tacctcgatt gctct 2745

<210> 30

<211> 4762

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 30

acaattaaat atctaaaaca gcttctgcca agtgattcgt aaccagtatg tctcgcataa 60

ctaacgtgtt tgaaaacttc ggcaaaagtg aaggcaaaga aatgattcct gcaattaaga 120

aagctgaaac agacaacaga ctcgttttga gcaggaaagt gacaagcaaa gatgtgagtg 180

atgccatgaa gaaaaaagct tctacattta atggcaatca atacatctct gcttctgaca 240

aaactgtttt gggttcctat gaaagtggtc aatctataga gaacagttca gatgatatct 300

tgtccaggct tatagtcgag aaaagcactc atctgagtaa ttggaaagat gattctcttg 360

ttggcaatgg agaggaaaaa gtgagctgta caataaacat cattccaaca tgggacagca 420

agaagaaata catgcatata tcaaggctga ttgtgtgggt tgttcccaca ataccggact 480

ctaaaggatt tgtgaaagca acaataatag atcaaaacaa gctgactcct aaagaaaagc 540

taatcattgg caagcaagga acacttgaga accctttgtg ttttgttttc catctgaact 600

ggtcttttaa caaagacaga aatgtaccaa agagatgcat gcagctcaat ctaacgagca 660

atgaaaaata tgcaaaagga gtttcctttg catcagttat gtattcttgg gtgaagaatt 720

tctgtgatac agctatagct tctgacagca acacatgtga tttgattcct atcaatagag 780

ctaaagcaat caaatctgct gctctaattg aagcatgcaa actcatgatc ccgaaaggaa 840

ctacaggaaa ggctataaag aaccagatag tgtctctcca aaaaattgct gagaaagtag 900

cattagaaga tgatgctgat gaaagtacag aaattgtaga gatagatata gatgatccta 960

ataatcaatt ttaaaagaac taaagatctt tcatatgtct atctttatta aataaaatcg 1020

taaaacaaac aaaacaaaaa taaagaagaa aagaacaaaa raagagaaaa agaaaaagaa 1080

aaaacaaaaa aaagagaaaa aagaagaaaa caaaaaagaa aaaagaaaaa gaaaaaagaa 1140

aaaggaaaaa caaaaagaaa agaaaagaat gtatataaat aaggccaagg ccaactttgg 1200

cctttttagg ctctttttgt tttattttat ttctatttta ttttattttt aattttattt 1260

ttattttatt tttttgtttt tgtttcattt atttatttta tctgcatttg aatacttcat 1320

ctggtctaga actctagagg aaattcaaat gtttttggcg ggcttcttct tctaggttct 1380

ccatctctct ttgacatagt caaaagagat tgactgactt cttcaaggtc gaactccatt 1440

ttccttttcc ttttttcttt ataataacta aaagataagt tatagatata actgattatg 1500

taaattccta cacagacagc taaaatcact aaaagtaccc tcactacatc aaagaaacta 1560

ccgaaaaatg aggctaccca attgaaagga gcttttatcc aatcccacaa tgtagccaac 1620

cctgtgtcag catgatgtat gttctcgtca tgagcgctct tatcatcata actaattata 1680

gtgtcttggt ctataacatc cacttgatcg attttcagct caattgacaa ttcatcttga 1740

tcctctgcaa tcattttgat gcttttatct tttagactgt ctgaacaata tgccttgaac 1800

tttttcttat taggaccaat gtaactgcct aattggtcag atttaaatga acaaccttca 1860

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atagcacatt taaaacagcc tgtgcagcta acttttgttt cgctaagcac tggtttgctt 1980

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<210> 31

<211> 8908

<212> DNA

<213> 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus）

<400> 31

agagcaagtc gagcaacgaa attaaaatcc aaaatgaatc ttcaaaatgt acatagcttc 60

ctagaaatca caggccaaat tactgtcttt ctaaatgagt tacgagagaa acttatgatt 120

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taccaaagca caatgtcaat tgaccaaaaa gaaatggaga agaagatatt catatttata 300

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tatttggagt actgctccga gacacaagat ataagcaaca agatagaaaa tctgaatgaa 480

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