本發(fā)明涉及一種檢測(cè)家蠶二分濃核病毒的LAMP引物及其試劑盒，具體涉及一組環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技術(shù)檢測(cè)家蠶BmBDV病毒引物及其試劑盒，屬于病毒疫病診斷技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

家蠶二分濃核病毒（Bombyx mori Bidensovirus，BmBDV）屬于細(xì)小病毒科濃核病毒亞科。BmBDV主要感染家蠶，病毒感染的家蠶幼蟲(chóng)的癥狀包括厭食、腹瀉及軟化，體型消瘦，出現(xiàn)遲眠、胸部半透明的空頭等現(xiàn)象最終停止進(jìn)食。該病毒具有高致死率，感染持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，引起慢性蠶病，是我國(guó)夏秋季節(jié)蠶繭等經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品減產(chǎn)的重要原因之一。

研究表明，BmBDV為無(wú)囊膜的球狀病毒粒子，直徑約20-24nm，包含2個(gè)線(xiàn)性單鏈DNA分子，大小分別約6.5kb（VD1）和6kb（VD2），其序列已測(cè)定并在GeneBank上登錄（登錄號(hào)DQ017268和DQ017269）。目前該病毒的檢測(cè)方法有電鏡法、PCR檢測(cè)法等，但在實(shí)際檢測(cè)工作中，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)存在以下問(wèn)題：一是靈敏度不夠，無(wú)法檢測(cè)到潛伏感毒樣品；二是容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，對(duì)模板質(zhì)量要求高；三是操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，不利于養(yǎng)殖戶(hù)和一線(xiàn)生產(chǎn)技術(shù)人員來(lái)操作。

LAMP是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，即依據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的原理，針對(duì)靶基因的特定區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，反應(yīng)時(shí)先由外部引物將內(nèi)部引物擴(kuò)增所需要的模板擴(kuò)增出來(lái)，然后由內(nèi)部引物對(duì)靶基因片段進(jìn)行引導(dǎo)合成。由于內(nèi)部引物所擴(kuò)增出的片段含有與該引物5’端DNA片段的反相互補(bǔ)序列，因此這些反相互補(bǔ)序列之間形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)，另外一條內(nèi)部引物與也可形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，片段的兩端形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，如此循環(huán)往復(fù)的過(guò)程最后形成花椰菜形狀的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，可在15min-60min之內(nèi)實(shí)現(xiàn)10⁹-10¹⁰倍的擴(kuò)增。該技術(shù)簡(jiǎn)化了操作步驟，在等溫條件下就可以高效、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列。LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)一般采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度觀(guān)察、染料顯色法和熒光染料觀(guān)察等方法。

瓊脂糖凝膠電泳和熒光染料觀(guān)察需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備，濁度觀(guān)察在含量較低時(shí)也較難觀(guān)察，核酸染料直接顯色法比較適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求。目前常用的核酸染料有鈣黃綠素（Calcein）、SYBR Green、羥基萘酚藍(lán)（HNB）、Eva Green等。利用核酸染顏色的變化來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果，這種方法具有安全、快捷、高效的特點(diǎn)，適合應(yīng)用推廣。目前，該方法在家蠶BmBDV的檢測(cè)中未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一組檢測(cè)BmBDV病毒的LAMP的引物，并提供一種用于檢測(cè)家蠶的BmBDV病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒。該試劑盒特異性強(qiáng)，敏感率高，而且操作簡(jiǎn)便快捷，克服現(xiàn)有檢測(cè)方法不能在生產(chǎn)中直接應(yīng)用的問(wèn)題，適合家蠶BmBDV的篩查。

本發(fā)明所述的引物是根據(jù)GenBank公布的BmBDV VP序列（Accession number: YP_007714630.1）設(shè)計(jì)修改后獲得，利用不同引物的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行篩選，由其中選出三對(duì)引物：

引物BmBDV-F3（SEQ ID NO:1）：TCTGACGTTGGTGGAAGT

引物BmBDV-B3（SEQ ID NO:2）：AACTTGCTTTCCACTCGA

引物BmBDV-FIP（SEQ ID NO:3）：

TGAGGCGTCCATAGGACCTTTTTTGGAAGTGGAAAACGCAGT

引物BmBDV-BIP（SEQ ID NO:4）：

GAGGATCTGGAGGTGGTGGTTTTTTTGGCTTGTAAATAGGTTGG

引物BmBDV-LF（SEQ ID NO:5）：ACCGCCCCCAGACACATT 引物BmBDV-LB（SEQ ID NO:6）：GGAGGTGCTTCAGCAGAGG

本發(fā)明還提供一種家蠶BmBDV病毒LAMP檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含家蠶BmBDV

病毒 LAMP預(yù)反應(yīng)液，所述預(yù)反應(yīng)液包含上述三對(duì)檢測(cè)家蠶BmBDV的LAMP特異性引物。

具體的，所述預(yù)反應(yīng)液包括：1.5～2.0mM BmBDV-FIP和BmBDV-BIP，0.2～0.4mM BmBDV-F3和BmBDV-B3，0.2～0.5mM BmBDV-LF和BmBDV-LB，20～40mM Tris-HCl (pH8.0～9.0)， 10～15mM 氯化鉀，15～20mM 硫酸銨，8～10mM 硫酸鎂， 0.1～0.2% Triton X-100，1.2～1.4mM dNTP， 6-8U Bst DNA 聚合酶大片段（New England Biolabs），0.6～0.8M 甜菜堿；在反應(yīng)管蓋中用低熔點(diǎn)固體石蠟封入1μL SYBR Green I。

本發(fā)明還提供一種家蠶BmBDV病毒LAMP檢測(cè)方法，包括以下檢測(cè)步驟：

S1. 家蠶樣品中BmBDV基因的提取：

（1）取20～30mg家蠶整蠶或蠶沙，或20μL家蠶血淋巴，加入500μL裂解液RA后用研磨棒研磨勻漿，然后加入20μL蛋白酶K以及20μL RNase A（20mg/mL）混勻，56℃水浴30min，至組織完全裂解；

（2）將混合物轉(zhuǎn)入帶有硅膠膜的吸附柱中，12000rpm離心1min，棄掉廢液；

（3）加入600μL去蛋白液RC，室溫靜置1min，12000rpm離心30～60s，棄掉廢液；

（4）加入600μL漂洗液RD，12000rpm離心30s,棄掉廢液；重復(fù)該步驟一次。

（5）在吸附柱中加入50μL TE,室溫放置1min，12000rpm離心1min。可重復(fù)該步驟一次，增加DNA洗脫量。

S2. 家蠶BmBDV病毒LAMP擴(kuò)增：

（1）根據(jù)待檢樣品數(shù)，配制所需的預(yù)反應(yīng)液（含陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照），在預(yù)反應(yīng)液中加入2～5μL DNA模板，再加入適量的去離子水，使反應(yīng)體系總體積為25μL。

（2）標(biāo)記清楚后，將檢測(cè)反應(yīng)管置于61～65℃，反應(yīng)45-60min，85℃滅活并溶解低熔點(diǎn)固體石蠟使得染料溶于反應(yīng)液；其中最適反應(yīng)溫度為62℃，最適反應(yīng)時(shí)間為30min。

（3） 肉眼觀(guān)察反應(yīng)體系的顏色變化，同時(shí)產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

與現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)比較，本發(fā)明所提供的家蠶BmBDV病毒LAMP檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明所采用引物組是根據(jù)BmBDV結(jié)構(gòu)蛋白(VP)基因的六個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)的，又有環(huán)形引物(BmBDV-LF和BmBDV-LB),反應(yīng)速度（常規(guī)PCR通常需要2個(gè)小時(shí)左右，而用這個(gè)方法只需要30分鐘），反應(yīng)速度高于常規(guī)PCR；

（2）本發(fā)明的快速診斷試劑盒檢測(cè)靈敏度高，是常規(guī)PCR的1000倍；（見(jiàn)圖4，圖5）

（3）本發(fā)明的快速診斷試劑盒檢測(cè)時(shí)間短，可以在30min內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，比常規(guī)PCR節(jié)約3～4小時(shí)；

（4）本發(fā)明的快速診斷試劑盒對(duì)儀器設(shè)備要求低，可通過(guò)肉眼直接觀(guān)察；

（5）本發(fā)明中的DNA提取方法簡(jiǎn)單快捷，而且不用到氯仿、巰基乙醇等有害物質(zhì)；

（6）本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒操作步驟簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀(guān)易判定，處于生產(chǎn)一線(xiàn)的技術(shù)員和蠶農(nóng)都可以按步驟指導(dǎo)進(jìn)行操作；

（7）本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒對(duì)人和環(huán)境安全。

附圖說(shuō)明

圖1為擴(kuò)增溫度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響結(jié)果；M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1： 60℃恒溫條件下擴(kuò)增結(jié)果； 泳道2：61℃恒溫條件下擴(kuò)增結(jié)果；泳道3: 62℃恒溫條件下擴(kuò)增結(jié)果；泳道4：63℃恒溫條件下擴(kuò)增結(jié)果；泳道5：64℃恒溫條件下擴(kuò)增結(jié)果；泳道6：65℃恒溫條件下擴(kuò)增結(jié)果。

圖2為擴(kuò)增時(shí)間對(duì)LAMP反應(yīng)的影響結(jié)果；M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1： 62℃恒溫條件下擴(kuò)增30min結(jié)果； 泳道2：62℃恒溫條件下擴(kuò)增45min結(jié)果；泳道3: 62℃恒溫條件下擴(kuò)增60min結(jié)果。

圖3為BmBDV LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖和染料顯色對(duì)比結(jié)果；圖中A為凝膠電泳結(jié)果，B為染色結(jié)果；圖A中，M：DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；泳道1：家蠶二分濃核病毒（BmBDV）；泳道2：家蠶濃核病毒（BmDNV）；泳道3：家蠶核型多角體病毒（BmNPV）；泳道4：家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）；泳道5：家蠶微孢子蟲(chóng)（N. b.）；泳道6：陰性對(duì)照。

圖4為BmBDV LAMP方法檢測(cè)BmBDV的靈敏度比較圖和染料顯色對(duì)比結(jié)果；圖中A為凝膠電泳結(jié)果，B為染色結(jié)果；圖A中，M：DL2000 DNA Marker (TaKaRa公司)；左側(cè)泳道1～9：模板分別為10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9倍稀釋的基因組DNA；泳道10：無(wú)模板。

圖5為常規(guī)PCR方法檢測(cè)BmBDV的靈敏度結(jié)果；M：DL2000 DNA Marker (TaKaRa公司)；泳道1～9：模板分別為10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9倍稀釋的基因組DNA；泳道10：無(wú)模板。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1：

所需材料：

感染家蠶BmBDV病毒的樣本采集自江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院；所用引物與探針由上海生工生物公司合成；Bst DNA 聚合酶大片段購(gòu)自New England Biolabs公司；dNTP、購(gòu)自promega公司；甜菜堿、硫酸鎂等購(gòu)自sigma公司；核酸染料SYBR Green I。

家蠶二分濃核病毒（BmBDV）、家蠶濃核病毒（BmDNV）、家蠶核型多角體病毒（BmNPV）、家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）和家蠶微孢子蟲(chóng)（N. b.）來(lái)源于江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院。

S1. 家蠶BmBDV樣品DNA的提取：

(1)取20～30mg家蠶整蠶或蠶沙，或20μL家蠶血淋巴，加入500μL裂解液RA后用研磨棒研磨勻漿，然后加入20μL蛋白酶K以及20μL RNase A（20mg/mL）混勻，56℃水浴30min，至組織完全裂解；

(2)將混合物轉(zhuǎn)入帶有硅膠膜的吸附柱中，12000rpm離心1min，棄掉廢液；

(3)加入600μL去蛋白液RC，室溫靜置1min，12000rpm離心30～60s,棄掉廢液；

(4)加入600μL漂洗液RD，12000rpm離心30s,棄掉廢液；重復(fù)該步驟一次。

(5)在吸附柱中加入50μL TE,室溫放置1min，12000rpm離心1min。可重復(fù)該步驟一次，增加DNA洗脫量。

S2. 家蠶BmBDV病毒LAMP恒溫?cái)U(kuò)增：

（1）根據(jù)待檢樣品數(shù)，配制相應(yīng)數(shù)量的預(yù)反應(yīng)液（1.6mM BmBDV-FIP和BmBDV-BIP,0.2mM BmBDV-F3和BmBDV-B3,0.05μM，0.2mM BmBDV-LF和BmBDV-LB， BmBDV-FITC-PROBE,20mM Tris-HCl, 10mM 氯化鉀, 15 mM 硫酸銨, 8mM 硫酸鎂, 0.1% Triton X-100,0.6M 甜菜堿，1.4mM dNTP，8U Bst DNA 聚合酶大片段，核酸染料SYBR Green I，每管檢測(cè)預(yù)反應(yīng)液體積為20μL；

（2）分別吸取5μL不同濃度的待檢樣品DNA和不同病毒的DNA加入核酸檢測(cè)反應(yīng)管中，混合均勻；

（3）標(biāo)記清楚后，將檢測(cè)反應(yīng)管置于62℃水浴鍋中，反應(yīng)30min；

（4）將反應(yīng)檢測(cè)管置于85℃中3分鐘，振蕩反應(yīng)管使染料溶于反應(yīng)液。

S3. 肉眼觀(guān)察結(jié)果，陽(yáng)性樣品LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物由黃色變成淺綠色，見(jiàn)圖3B與圖4B圖。S4. 家蠶BmBDV病毒LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳：

（1）配置2%的瓊脂糖凝膠，每個(gè)加樣孔加入5μL的反應(yīng)產(chǎn)物；

（2）電泳30分鐘后凝膠成像，結(jié)果見(jiàn)圖3A和圖4A圖。

如圖1和圖2所示，對(duì)LAMP恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中反應(yīng)溫度和實(shí)際對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明中的方法最適的反應(yīng)溫度為62℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為30min。

圖3實(shí)驗(yàn)為BmBDV LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖和染料顯色對(duì)比結(jié)果；分別將家蠶二分濃核病毒（BmBDV）、家蠶濃核病毒（BmDNV）、家蠶核型多角體病毒（BmNPV）、家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）和家蠶微孢子蟲(chóng)（N. b.）作為反應(yīng)模板，結(jié)果顯示，該方法具有非常好的特異性，對(duì)家蠶二分濃核病毒的檢測(cè)精準(zhǔn)。

圖4為BmBDV LAMP方法檢測(cè)BmBDV的靈敏度比較圖和染料顯色對(duì)比結(jié)果；

利用本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法檢測(cè)BmBDV病毒，經(jīng)過(guò)凝膠電泳，由圖4A可見(jiàn)階梯狀的擴(kuò)增條帶，該方法可檢測(cè)10^-9倍稀釋的基因組DNA，再利用核酸染料SYBR Green I染色后顏色變化肉眼檢測(cè)檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物（染料用蠟封在反應(yīng)管蓋中，反應(yīng)最后用85℃3分鐘使蠟融化從而染料混入擴(kuò)增產(chǎn)物），由圖4B可見(jiàn)與電泳結(jié)果吻合。

與常規(guī)PCR檢測(cè)方法結(jié)果（圖5）相比，本方法靈敏度至少是常規(guī)方法的1000倍，表明該方法具有很好的靈敏度；此外，常規(guī)PCR檢測(cè)樣品至少需要3～4小時(shí)，而本方法檢測(cè)單個(gè)樣品最快僅需要1小時(shí)左右，時(shí)效性遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BmBDV病毒LAMP檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法可以快速、簡(jiǎn)便、靈敏的進(jìn)行該病毒的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇大學(xué)

<120> 一種檢測(cè)家蠶二分濃核病毒的LAMP引物及其試劑盒

<130> 一種檢測(cè)家蠶二分濃核病毒的LAMP引物及其試劑盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctgacgttg gtggaagt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacttgcttt ccactcga 18

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaggcgtcc ataggacctt ttttggaagt ggaaaacgca gt 42

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaggatctgg aggtggtggt ttttttggct tgtaaatagg ttgg 44

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accgccccca gacacatt 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggaggtgctt cagcagagg 19