專利名稱：一種高活性抗雞法氏囊病毒、流感病毒復(fù)合抗體口服制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高活性抗雞法氏囊病毒、流感病毒復(fù)合抗體口服制劑，屬于獸藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
卵黃抗體是從免疫禽蛋中提取出的針對(duì)特定抗原的抗體，是一種具有較強(qiáng)免疫功能的蛋白質(zhì)，有效成份為IgY。IgY在多種環(huán)境下均具有良好的穩(wěn)定性，如耐熱、耐酸、耐堿和抗酶降解。IgY對(duì)反復(fù)凍融具有耐受性，實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)5次反復(fù)凍融，其抗原結(jié)合活性幾乎不受影響。在通常情況下，IgY基本能夠耐受巴氏消毒，37°C下其活性基本無明顯變化。當(dāng)溫度達(dá)到65°C時(shí)，IgY的活性可保持24h以上。在IgY溶液中添加適宜佐劑可以提高其熱穩(wěn)定性，使IgY在70-80°C依然能夠保持較高的活性。IgY在pH4. 0-11. O的范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。此外，IgY能夠抵抗幼齡動(dòng)物的胃酸屏障及腸道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的消化。IgY在37°C、強(qiáng)酸性低濃度胃蛋白酶存在下，處理2小時(shí)后用檢測，其活性僅損失25%。經(jīng)相關(guān)試驗(yàn)證明，IgY對(duì)多種胃腸道蛋白酶的穩(wěn)定性極好。禽類在特定免疫后在其卵黃中產(chǎn)生的大量高純度特定IgY，其對(duì)禽類特定疫病具有明顯治療和緊急預(yù)防作用。目前，禽類病毒性疾病發(fā)病率呈上升趨勢，而畜牧行業(yè)可用于抗病毒的藥物屈指可數(shù)，給疾病防控帶來巨大壓力。卵黃抗體屬于高效、無污染、無殘留的生物制劑，經(jīng)大量臨床試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)特異病毒病有顯著治療和防控作用。但是目前臨床使用的抗體制劑大多數(shù)為單一病原抗體，而臨床病毒病多為混合感染，因此，不能很好控制疾病。同時(shí)此類產(chǎn)品必須通過注射給藥,無形中增加了大量人力成本,并且對(duì)禽產(chǎn)生極大應(yīng)激反應(yīng)，降低產(chǎn)蛋量和肉品質(zhì)。因此，此類產(chǎn)品使用有很大局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有的抗體制劑存在的僅為單一病原抗體和必須通過注射給藥的缺點(diǎn)，通過特殊工藝提取高純度的禽卵黃抗體有效成分LgY，并配以高效穩(wěn)定劑和增效劑，使其通過內(nèi)服給藥到達(dá)腸道后迅速被吸收，進(jìn)入血液后能與特定的病原菌黏附因子結(jié)合，使病原菌不能黏附易感細(xì)胞而失去致病性。本發(fā)明卵黃抗體制備工藝簡單，生產(chǎn)原料來源廣泛。因此，本發(fā)明為復(fù)合卵黃抗體口服制劑的常規(guī)化量產(chǎn)提供廣闊的前景。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種高活性抗雞法氏囊病毒、流感病毒復(fù)合抗體口服制齊U，其特征是，由雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體、禽流感濃縮抗體、穩(wěn)定劑和增效劑組成，按體積比雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體禽流感濃縮抗體穩(wěn)定劑增效劑=1:0. 8 I. 2:4 6:0. 8 I. 2，優(yōu)選比例范圍為1:1:5: I。所述雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體對(duì)健康產(chǎn)蛋雞強(qiáng)化免疫雞傳染性法氏囊炎滅活油佐劑組織苗，當(dāng)雞翅靜脈采集血清檢測抗雞傳染性法氏囊病瓊擴(kuò)效價(jià)為16以上時(shí)，收集雞蛋，獲得卵黃原液；然后加入其質(zhì)量5. 5 6. 5倍的純化水，攪拌使卵黃充分分散于水中，形成均質(zhì)溶液，用O. 5±0. lmol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值到5. 2±0. 3，然后使用高速離心機(jī)(6000r/min, 30min)離心獲取上清液(除去大量的脂類),加入20% (w/v)的硫酸鈉(即IOOml上清液加入20g的硫酸鈉)攪拌溶解均勻，靜置，再用上述離心方法獲取沉淀，即為卵黃抗體；然后加入其質(zhì)量O. 8 I. 2倍的濾膜過濾的生理鹽水充分混合均勻，加壓超濾濃縮(采用截流值為80-100KDa的超濾濃縮設(shè)備)，得到總蛋白濃度為900±50mg/ml的濃縮抗體。所述禽流感濃縮抗體為對(duì)健康產(chǎn)蛋雞進(jìn)行強(qiáng)化免疫禽流感滅活油佐劑組織苗，當(dāng)雞翅靜脈采集血清檢測抗雞禽流感病瓊擴(kuò)效價(jià)為16以上時(shí)，收集雞蛋，獲得卵黃原液；然后加入其質(zhì)量5. 5 6. 5倍的純化水，攪拌使卵黃充分分散于水中，形成均質(zhì)溶液，用
O.5±0. lmol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值到5. 2±0. 3，然后使用高速離心機(jī)(6000r/min，30min)離心獲取上清液，加入20% (w/v)的硫酸鈉(即IOOml上清液加入20g的硫酸鈉),攪拌溶解均勻，靜置，再用上述離心方法獲取沉淀，即為卵黃抗體；然后加入其質(zhì)量O. 8 I. 2倍的濾膜過濾的生理鹽水充分混合均勻，加壓超濾濃縮(采用截流值為SO-IOOKDa的超濾濃縮設(shè)備)，得到總蛋白濃度為900±50mg/ml的濃縮抗體。所述穩(wěn)定劑按I升純化水中加入甘露醇60±lg、蔗糖粉75±1. 5g的比例制成澄
清溶液。所述增效劑用純化水將N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺溶解，制成6±0. 5wt%的水溶液。制備方法將雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體、禽流感濃縮抗體、穩(wěn)定劑和增效劑混合均勻；然后將濾液用濾膜加壓過濾除菌；最后無菌環(huán)境分裝，常溫密封保存，即得復(fù)合抗體口服制劑。由于IgY在多種環(huán)境下均具有良好的穩(wěn)定性，因此該制劑在4°C貯存5年或在室溫下貯存6-12個(gè)月，其抗體活性仍無明顯變化。服用方法雛雞每只每次內(nèi)服O. 5ml，成年雞每次內(nèi)服I. Oml ;預(yù)防用量減半。每日早晚各一次，連用3-6天。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明制劑純度> 95%，效價(jià)> 107、生物利用度高、臨床效果更顯著，制備工藝方便實(shí)用、綠色無污染。同時(shí)本發(fā)明制劑通過飼養(yǎng)蛋雞獲得抗體，在獲取抗體期間，由于持續(xù)免疫作用，不僅不影響蛋雞產(chǎn)蛋量，而且大幅降低發(fā)病率，從而充分保證能持續(xù)獲得高質(zhì)量的抗體。此外，本發(fā)明所使用儀器設(shè)備相對(duì)簡單、工藝設(shè)計(jì)合理，所以本發(fā)明制劑生產(chǎn)極低，更適合于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I(一)雞傳染性法氏囊炎抗體的制備I.將有病變的法氏囊組織稱重，用研磨器研磨成勻漿，按質(zhì)量比I :5加滅菌生理鹽水，繼續(xù)研磨均勻，然后用3層140目尼龍過濾網(wǎng)過濾，加入O. 50%的甲醛，混合均勻，置于37°C作用24小后添加2%吐溫80充分混合均勻后，用普通培養(yǎng)基檢查雜菌，合格后，保存于陰涼處。2.傳染性法氏囊炎滅活油佐劑組織苗的制備選用10號(hào)白油添加3%氫氧化鋁混合均勻后加熱充分溶解。與步驟I中液體按3 1配比制成。3.選取無特定傳染病的健康高產(chǎn)蛋雞，將傳染性法氏囊炎滅活油佐劑組織苗，給每只雞皮下注射I. 6ml。4. 10-14天后，從雞翅靜脈采集血清做傳染性法氏囊瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)到16以上，即可收獲雞蛋。5.將雞蛋用水清洗干凈,浸入新潔爾滅溶液中消毒5分鐘，撈出擦干后，用75%酒精擦拭，涼干，無菌操作去蛋皮，獲取卵黃，然后按I :6加入純化水，攪拌使卵黃充分分散于水中，形成均質(zhì)溶液，用O. 5mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值到5. 2±0. 3，然后使用高速離心機(jī)(6000r/min, 30min)離心獲取上清液,加入20%硫酸鈉(100ml上清液加入20g的硫酸鈉)攪拌溶解均勻，靜置3小時(shí)，再用上述離心方法獲取沉淀，即為卵黃抗體；然后按1:1比例加入用O. 22 μ m濾膜過濾的生理鹽水充分混合均勻。6. 4°C 8°C保存待用。
(二)禽流感組織滅活苗的制備I.將符合流感病變要求的肺臟、脾臟和肝臟稱重，用研磨器研磨成勻漿，按質(zhì)量比I 5加滅菌生理鹽水，繼續(xù)研磨均勻，然后用3層140目尼龍過濾網(wǎng)過濾，加入O. 50%的甲醛，混合均勻，置于37°C作用24小后添加2%吐溫80充分混合均勻后，用普通培養(yǎng)基檢查雜菌，合格后，保存于陰涼處。2.禽流感滅活油佐劑組織苗的制備選用選用10號(hào)白油添加3%氫氧化鋁混合均勻后加熱充分溶解。與步驟I中液體按3:1配比制成。3.選取無特定傳染病的健康高產(chǎn)蛋雞，將禽流感滅活油佐劑組織苗，給每只雞皮下注射I. 5ml。4. 14-15天后，從雞翅靜脈采集血清檢測HI抗體水平擴(kuò)效價(jià)達(dá)到16以上，即可收
獲雞蛋。5.將雞蛋用水清洗干凈，浸入新潔而滅溶液中消毒5分鐘，撈出擦干后，用75%酒精擦拭，涼干，無菌操作去蛋皮，獲取卵黃，然后按I :6加入純化水，攪拌使卵黃充分分散于水中，形成均質(zhì)溶液，用O. 5mol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值到5. 2±0. 3，然后使用高速離心機(jī)(6000r/min, 30min)離心獲取上清液,加入20%硫酸鈉(100ml上清液加入20g的硫酸鈉)攪拌溶解均勻，靜置3小時(shí)，再用上述離心方法獲取沉淀，即為卵黃抗體；然后按1:1比例加入用O. 22 μ m濾膜過濾的生理鹽水充分混合均勻。6. 4°C 8°C保存待用。(三)復(fù)合抗體口服制劑制備I.超濾、濃縮將上述(一)和(二)中待用抗體用截流值為80_100KDa的超濾濃縮設(shè)備分別加壓超濾濃縮至總蛋白濃度為900mg/ml，濾液即為濃縮抗體，然后按1:1的體積比混勻。2.加入穩(wěn)定劑按I升純化水中加入甘露醇60g、蔗糖粉75g的比例制成澄清溶液。 3.增效劑用純化水將N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺溶解，做成6%水溶液。4.混合將步驟1、2、3中各成分按2 5 1的體積比混合均勻。5.除菌將超濾得到的濾液用孔徑為O. 22 μ m的濾膜加壓過濾除菌。6.分裝無菌環(huán)境分裝，常溫密封保存，即得所述復(fù)合抗體口服制劑。該制劑的純度 96%，效價(jià) 2X107。以下結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明的效果作進(jìn)一步說明。I.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取7日齡體重在100g±5g雛雞，通過實(shí)驗(yàn)室診斷(ELISA檢測法)選取患有法氏囊病毒和流感病毒混合感染并有臨床癥狀的病雞120只。隨機(jī)分成4組，每組30只，一組為空白對(duì)照組，其余三組按不同劑量使用抗體，具體用量如表I所示。2.實(shí)驗(yàn)藥物本發(fā)明實(shí)施I制備的復(fù)合抗體制劑。
3.試驗(yàn)方法表I實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種高活性抗雞法氏囊病毒、流感病毒復(fù)合抗體口服制劑，其特征是，由雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體、禽流感濃縮抗體、穩(wěn)定劑和增效劑組成，按體積比雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體禽流感濃縮抗體穩(wěn)定劑增效劑=1:0. 8 I. 2:4 6:0. 8 I. 2 ;所述雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體和禽流感濃縮抗體的總蛋白濃度均為900±50mg/ml ;所述穩(wěn)定劑為按I升純化水中加入甘露醇60±lg、蔗糖粉75±1. 5g的比例制成澄清溶液；所述增效劑為用純化水將N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺溶解制成6±0. 5wt%的水溶液。
2.如權(quán)利要求I所述的一種高活性抗雞法氏囊病毒、流感病毒復(fù)合抗體口服制劑，其特征是， 所述雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體的制備方法為對(duì)健康產(chǎn)蛋雞強(qiáng)化免疫雞傳染性法氏囊炎滅活油佐劑組織苗，當(dāng)雞翅靜脈采集血清檢測抗雞傳染性法氏囊病瓊擴(kuò)效價(jià)為16以上時(shí)，收集雞蛋，獲得卵黃原液；然后加入其質(zhì)量5. 5 6. 5倍的純化水，攪拌使卵黃充分分散于水中，形成均質(zhì)溶液，用O. 5±0. lmol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值到5. 2±0. 3，然后使用高速離心機(jī)離心獲取上清液，上清液加入20% (w/v)的硫酸鈉攪拌溶解均勻，靜置，再使用高速離心機(jī)離心獲取沉淀，即為卵黃抗體；然后卵黃抗體加入其質(zhì)量O. 8 I. 2倍的濾膜過濾的生理鹽水充分混合均勻，加壓超濾濃縮，得到總蛋白濃度為900±50mg/ml的雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體； 所述禽流感濃縮抗體為對(duì)健康產(chǎn)蛋雞進(jìn)行強(qiáng)化免疫禽流感滅活油佐劑組織苗，當(dāng)雞翅靜脈采集血清檢測抗雞禽流感病瓊擴(kuò)效價(jià)為16以上時(shí)，收集雞蛋，獲得卵黃原液；然后加入其質(zhì)量5. 5 6. 5倍的純化水，攪拌使卵黃充分分散于水中，形成均質(zhì)溶液，用O.5±0. lmol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值到5. 2±0. 3，然后使用高速離心機(jī)離心獲取上清液，上清液加入20% (w/v)的硫酸鈉攪拌溶解均勻，靜置，再使用高速離心機(jī)離心獲取沉淀，即為卵黃抗體；然后卵黃抗體加入其質(zhì)量O. 8 I. 2倍的濾膜過濾的生理鹽水充分混合均勻，力口壓超濾濃縮，得到總蛋白濃度為900±50mg/ml的禽流感濃縮抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的一種高活性抗雞法氏囊病毒、流感病毒復(fù)合抗體口服制劑，其特征是，所述超濾濃縮采用截流值為SO-IOOKDa的超濾濃縮設(shè)備。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的一種高活性抗雞法氏囊病毒、流感病毒復(fù)合抗體口服制劑，其特征是，按體積比雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體禽流感濃縮抗體穩(wěn)定劑增效劑=1:1:5:1。
5.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的口服制劑的制備方法，其特征是，將雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體、禽流感濃縮抗體、穩(wěn)定劑和增效劑混合均勻；然后將濾液用濾膜加壓過濾除菌；最后無菌環(huán)境分裝，常溫密封保存，即得復(fù)合抗體口服制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高活性抗雞法氏囊病毒、流感病毒復(fù)合抗體口服制劑。該口服制劑由雞傳染性法氏囊炎濃縮抗體、禽流感濃縮抗體、穩(wěn)定劑和增效劑組成。本發(fā)明克服了現(xiàn)有的抗體制劑存在的僅為單一病原抗體和必須通過注射給藥的缺點(diǎn)，通過特殊工藝提取高純度的禽卵黃抗體有效成分LgY，并配以高效穩(wěn)定劑和增效劑，使其通過內(nèi)服給藥到達(dá)腸道后迅速被吸收，進(jìn)入血液后能與特定的病原菌黏附因子結(jié)合，使病原菌不能黏附易感細(xì)胞而失去致病性。本發(fā)明卵黃抗體制備工藝簡單，生產(chǎn)原料來源廣泛。因此，本發(fā)明為復(fù)合卵黃抗體口服制劑的常規(guī)化量產(chǎn)提供廣闊的前景。
文檔編號(hào)A61K39/42GK102861333SQ20121039630
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者王立明, 梁運(yùn)霞, 張寶泉, 李紅梅, 李冬梅, 車建軍 申請(qǐng)人:濟(jì)南大東農(nóng)生物技術(shù)有限公司