本發(fā)明屬藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類5-異丙基-2-(4-烴基甲酰氧基苯基羰基甲基硫基)-6-環(huán)己甲基嘧啶酮類化合物、其制備方法和用途。該類化合物具有顯著的抗HIV-1病毒活性，且毒性小，選擇性指數(shù)高，可在治療艾滋病等疾病的相關(guān)藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前抗艾滋病藥物研發(fā)主要基于對HIV生命周期的認(rèn)識，通過阻斷其循環(huán)的各個環(huán)節(jié)以抑制HIV病毒的復(fù)制。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-1RT)是HIV病毒復(fù)制的必需蛋白，因其在HIV病毒mRNA轉(zhuǎn)錄為DNA的關(guān)鍵作用，一直是抗HIV藥物設(shè)計的重要靶點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑據(jù)其作用機(jī)理可分為核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)兩類，后者能結(jié)合到病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的活性位點(diǎn)，通過抑制酶，阻止病毒復(fù)制到DNA。在其活化過程中不涉及細(xì)胞內(nèi)的磷酸化過程，因而能更有效、更迅速地發(fā)揮抗病毒作用。目前已有60多類結(jié)構(gòu)各異的NNRTIs，經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)有五種：奈韋拉平(Nevirapine)、德拉韋定(Delavidine)、依非韋倫(Efavitrenz)、依曲韋林(Etravine)和利匹韋林(Rilpivirine)。NNRTIs作為HAART療法的主要組分，在抗AIDS臨床治療中發(fā)揮了重要作用。逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑雖然有很多，但由于較嚴(yán)重的毒副作用、HIV病毒易變異、耐藥性的出現(xiàn)等問題還需要開發(fā)更多的新型逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。
在前期工作中，我們基于對高效嘧啶酮類NNRTIs DB02(下式中的化合物DB02)的作用機(jī)理研究(PLOS ONE，2013，11(8)：1-11)，提出了一種新型的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑2-(4-烴基甲酰氧基苯基羰基甲基硫基)嘧啶酮類化合物(下式中的化合物A)，具有良好的抗HIV-1病毒活性(見中國發(fā)明專利文件ZL 201210010392.2)：
上式中R1和R2為環(huán)己基、苯基。
經(jīng)分子模擬研究發(fā)現(xiàn)，化合物A和RT之間除了具有DB02的藥效團(tuán)外，其C-2側(cè)鏈酯鍵上的羰基和Val106殘基主鏈酰胺鍵上的氨基形成了一個新的氫鍵,該作用將有利于提高DB02抗V106L的敏感性。由于該C-2酯鏈末端苯基或環(huán)已基處于RT活性口袋開口處，進(jìn)入溶劑界面，該位置取代基在體積大小、電性、疏水性各方面均可允許有較大變化，是設(shè)計尋找新型NNRTIs的有利修飾位點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種新型的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑5-異丙基-2-(4-烴基甲酰氧基苯基羰基甲基硫基)-6-環(huán)己甲基嘧啶酮類化合物，其制備方法和用途。該類化合物不但具有顯著的抗HIV-1病毒活性，而且毒性小，具有很高的選擇性指數(shù)。
本發(fā)明基于背景技術(shù)部分所述化合物A的基本骨架，在其C-2側(cè)鏈末端苯環(huán)對位通過酯鏈引入取代基，將嘧啶環(huán)C-5位乙基替換為體積更大的異丙基后，得到了一類具有顯著抗HIV活性的新型NNRTIs。
本發(fā)明化合物為如下通式I所示的5-異丙基-2-(4-烴基甲酰氧基苯基羰基甲基硫基)-6-環(huán)己甲基嘧啶酮類化合物，以及其N-氧化物、其立體異構(gòu)體形式、其立體異構(gòu)體混合物，其藥學(xué)上可接受的鹽，其藥學(xué)上可接受的前體藥物和衍生物：
其中：R為對甲氧苯基，(苯并[d][1,3]二氧雜環(huán)戊烷)-5-甲基，苯乙烯基，聯(lián)苯基；
所述藥學(xué)上可接受的鹽為鹽酸鹽、或硫酸鹽、或酒石酸鹽、或檸檬酸鹽。
本發(fā)明所述化合物的醫(yī)藥用途為用于制備治療和預(yù)防人類免疫缺陷病毒(HIV)感染藥物。
特別地，本發(fā)明的5-烷基-2-(4-烴基甲酰氧基苯基羰基甲基硫基)-6-環(huán)已甲基嘧啶酮類化合物具有如下結(jié)構(gòu)通式：
其中：
R為
本發(fā)明所述化合物的制備方法是按以下反應(yīng)通式進(jìn)行：
上式中，以環(huán)己基乙氰1及α-溴代異戊酸乙酯2為起始原料，經(jīng)類似Reformarsky反應(yīng)制備4-環(huán)已基-2-異丙基-3-氧代丁酸乙酯3，化合物3與硫脲在乙醇鈉催化下與硫脲關(guān)環(huán)得5-異丙基-6-環(huán)己甲基硫脲嘧啶4，最后，化合物4與各種4-(2-溴乙酰)苯酯5在DMF中、碳酸鉀催化下經(jīng)硫烷基化反應(yīng)引入C-2側(cè)鏈得本發(fā)明所述化合物。所有的原料都可以通過有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法制備，也可商購。
本發(fā)明的有益效果：經(jīng)生物活性測試表明，本發(fā)明所提出的具體的4個5-異丙基-2-(4-烴基甲酰氧基苯基羰基甲基硫基)-6-環(huán)已甲基嘧啶酮類化合物，具有顯著的抗HIV-1病毒活性、較小的細(xì)胞毒性和較高的選擇性指數(shù)，可用于制備治療和預(yù)防病毒性感染特別是HIV病毒感染藥物。
具體實(shí)施方式
通過下述實(shí)例將有助于理解本發(fā)明，但是不能限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)例1：4-環(huán)已基-2-異丙基-3-氧代丁酸乙酯的合成
將52.4g活化鋅粉和450ml無水THF，在N2保護(hù)下滴加幾滴α-溴代異戊酸乙酯2以引發(fā)反應(yīng)，66℃回流攪拌45min待反應(yīng)液變成墨綠色后一次性加入20.324g(0.165mol)環(huán)己基乙腈，并在1h以內(nèi)緩慢加入2(88.71g，0.4243mol)，繼續(xù)回流1H后停止加熱，冷卻到室溫，加入80ml 50％的K2CO3溶液劇烈攪拌10min，反應(yīng)液靜置分層，分離有機(jī)相，用THF萃取殘余物，合并有機(jī)相，加入150ml 15％的HCl水解，分出有機(jī)層減壓濃縮，水層用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，分別用飽和碳酸氫鈉溶液、飽和NaCl洗滌3次，無水Na2SO4干燥，減壓除去溶劑得到化合物3的粗品紅棕色液體38.4g，本品可不經(jīng)純化直接用于下一步的反應(yīng)。
實(shí)例2：6-環(huán)己基-5-異丙基-2-硫尿嘧啶的制備
在干燥的反應(yīng)瓶中，將10g(0.43mol)金屬鈉分批加入300mL無水乙醇中，待鈉溶解冷卻后，一次性加入24g(0.315mol)硫脲，然后滴加上述化合物3(0.27mol)的乙醇溶液20mL，將混合物加熱回流5—7個小時，TLC跟蹤至化合物3原料點(diǎn)消失后停止加熱，冷卻，減壓蒸去溶劑，將殘余物溶于300mL水中，用濃鹽酸調(diào)pH值為6左右，有大量白色沉淀產(chǎn)生，抽濾，用水洗滌濾餅，烘干得6-環(huán)己基-5-異丙基-2-硫尿嘧啶，可不經(jīng)純化直接用于下一步目標(biāo)化合物的合成。
實(shí)例3：5-異丙基-2-(4-烴基甲酰氧基苯基羰基甲基硫基)-6-環(huán)已甲基嘧啶酮類化合物I的制備
將5-異丙基-6-環(huán)己甲基-2-硫尿嘧啶(2mmol)溶于10ml干燥的DMF溶液，加入K2CO3(2mmol),室溫攪拌反應(yīng)半小時，加入4-(2-溴乙酰)苯酯5(2.2mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤至原料點(diǎn)消失，停止反應(yīng)，將反應(yīng)液到入50ml冰水中，攪拌析出沉淀，過濾，用水洗滌沉淀，抽濾烘干，得粗品，柱層析或重結(jié)晶得純品。
從5-異丙基-6-環(huán)己基-2-硫基-2,3-二氫嘧啶-4(1H)-酮出發(fā)，按照上述方法操作，與不同的4-(2-溴乙酰)苯酯發(fā)生烷基化反應(yīng)，可制得本發(fā)明所述I系列化合物。
操作如上，得白色晶體Ia；收率：75％：熔點(diǎn)：223.1℃；1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：0.80-1.18(m,6H,Cyclohexyl),1.22-1.25(d,6H,J＝9.0,2CH3),1.39-1.63(m,5H,Cyclohexyl),2.20-2.22(d,2H,J＝6.0,CH2-Cyclohexyl),2.88(s,1H,CH(CH3)2),3.83(s,3H,CH3-O-Ph),4.49(s,2H,SCH2),6.89-6.94(t,2H,J＝7.5,Ph-H),7.13-7.19(t,1H,J＝9.0,Ph-H),7.30(s,1H,Ph-H),8.05-8.10(t,4H,J＝7.5,Ph-H),12.77(s,1H,NH)；13C NMR(CDCl3)δ(ppm)：19.83(2C),26.31(3C),28.17,33.11(2C),37.25,37.62,41.39,55.58,113.98(2C),121.21,122.13(2C),130.17(2C),132.35,132.45(2C),133.50,154.42,155.23,158.71,162.30,164.19,164.65,192.11
操作如上，得白色晶體Ib；收率：68％：熔點(diǎn)：213-214℃；1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：0.86-1.15(m,6H,Cyclohexyl),1.19-1.22(d,6H,J＝9.0,2CH3),1.36-1.60(m,5H,Cyclohexyl),2.14-2.18(d,2H,J＝12.0,CH2-Cyclohexyl),2.82(s,1H,CH(CH3)2),4.46(s,2H,SCH2),5.99(s,2H,OCH2O),6.78-6.83(t,1H,J＝7.5,Ph-H),7.09-7.12(d,2H,J＝9.0,Ph-H),7.23-7.29(t,1H,J＝9.0,Ph-H),7.48-7.50(d,1H,J＝6.0,Ph-H),7.68-7.74(t,1H,J＝7.5,Ph-H),8.02-8.05(d,2H,J＝9.0,Ph-H),12.76(s,1H,NH)；13C NMR(CDCl3)δ(ppm)：19.83(2C),26.31(3C),27.75,33.11(2C),37.24,37.62,42.13,102.12,108.28,109.93,122.18(2C),123.08,125.37,130.19(2C),133.58,138.70,148.03,152.35,152.54,155.10,158.71,162.28,164.37,192.02.
操作如上，得白色晶體Ic；收率：62％：熔點(diǎn)：228-229℃；1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：0.80-1.21(m,6H,Cyclohexyl),1.30-1.32(d,6H,J＝6.0,2CH3),1.46-1.70(m,5H,Cyclohexyl),2.27(d,2H,J＝9.0,CH2-Cyclohexyl),2.93(s,1H,CH(CH3)2),4.55(s,2H,SCH2),6.62(m,H,Ph-CH＝CH),6.67(s,1H,Ph-H),7.21(s,1H,Ph-CH＝CH),7.32-7.35(d,2H,J＝9.0,Ph-H),7.59(s,3H,Ph-H),7.88-7.93(d,1H,J＝15.0,Ph-CH＝CH),8.12-8.14(d,2H,J＝6.0,Ph-H),12.89(s,1H,NH)；13C NMR(CDCl3)δ(ppm)：19.9(2C),26.35(3C),27.7,33.1(2C),37.2,37.6,42.16,116.69,121.69(2C),125.39,128.45(2C),129.11(2C),130.22(2C),133.58,133.97,138.68,147.48,154.46,154.95,162.29,163.63,164.70,192.05
操作如上，得白色晶體Id；收率：75％：熔點(diǎn)：169-170℃；白色粉狀固體,熔點(diǎn)：232.9-233℃.1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：0.80-1.22(m,6H,Cyclohexyl),1.28-1.32(d,6H,J＝7.0,2CH3),1.48-1.63(m,5H,cyclohexyl),2.29-2.31(d,2H,J＝9.0,CH2-cyclohexyl),4.70(s,2H,SCH2),7.45-7.52(m,5H,Ph-H),7.60-7.92(m，4H,Ph-H)，8.17-8.23(m,4H,Ph-H)，12.59(s,1H,NH).13C NMR(CDCl3)δ(ppm)：19.87(2C),25.6(3C),27.8,32.5(2C),36.2,37.2,39.2,118.6(C5),122.2(2C),127.1(2C),127.2(2C),127.3,128.6(3C),129.1,130.0(2C),130.6(2C,),133.5,145.6,154.5，159.2,160.8,162.8,163.9,192.2.
實(shí)例4：抗HIV生物活性測試
采用HIV-1感染的C8166細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞水平抗HIV生物活性測試。方法描述如下。
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：化合物對C8166細(xì)胞的毒性采用MTT法測定。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將化合物進(jìn)行五倍倍比稀釋，每孔加入4×105/ml C8166細(xì)胞懸液。每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置不含藥物的細(xì)胞對照及AZT藥物對照。37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天，每孔加MTT溶液37℃孵育4小時。每孔再加入10％SDS-50％DMF，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜?；靹蚝笥肂IO-TEK ELx800ELISA儀測定OD值(測定波長：595nm；參考波長：630nm)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制計量反應(yīng)曲線，計算CC50(50％細(xì)胞產(chǎn)生毒性時的化合物濃度)。
合胞體抑制實(shí)驗(yàn)：將4×105/ml C8166細(xì)胞懸液接種到含化合物五倍倍比稀釋的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入HIV-1ⅢB稀釋上清(MOI＝0.04)，每個濃度梯度設(shè)3個復(fù)孔。同時設(shè)置不含化合物的HIV-1ⅢB感染的陰性對照孔和含AZT藥物的陽性對照孔。37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天，倒置顯微鏡下(100×)，選取5個不重疊的視野，計數(shù)合胞體數(shù)目。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制計量反應(yīng)曲線，按Reed&Muench法計算出化合物抑制病毒的50％有效濃度(EC50，50％有效濃度)。計算公式：致細(xì)胞病變抑制率(％)＝(1－實(shí)驗(yàn)孔合胞體數(shù)/對照孔合胞體數(shù))×100％
本發(fā)明用AZT及Nevirapine作對照品，題述化合物對HIV-1IIIB的抑制活性結(jié)果見表1：
表1.抗HIV活性
aSI(治療指數(shù))＝CC50/EC50
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化學(xué)結(jié)構(gòu)通式中所包含的化合物均可在較低的納摩范圍內(nèi)抑制HIV病毒的復(fù)制，具有十分顯著的抗HIV-1病毒活性,除化合物Ic外，其余3個化合物的CC50值均大于500μM,優(yōu)選化合物Id的選擇性指數(shù)大于陽性對照AZT及Nevirapine。
本發(fā)明不限于上述實(shí)例。