專(zhuān)利名稱(chēng)：：其中結(jié)合5-氮雜-胞嘧啶的寡核苷酸類(lèi)似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用作治療、診斷以及研究試劑的寡核苷酸類(lèi)似物的設(shè)計(jì)、合成和應(yīng)用。提供在寡核苷酸序列中結(jié)合胞嘧啶的類(lèi)似物，5-氮雜-胞嘧啶，例如，以5-氮雜-2'-脫氧胞苷或5-氮雜-胞苷的形式的寡核苷酸類(lèi)似物。這樣的類(lèi)似物可以用于調(diào)節(jié)DNA的甲基化，尤其用于通過(guò)更特異性地靶向人基因組的CpG島而有效抑制胞嘧啶在C-5位置的甲基化。本發(fā)明提供合成這些寡核苷酸類(lèi)似物的方法和調(diào)控C-5胞嘧啶甲基化的方法。特別地，提供亞磷酰胺(phosphoramidite)結(jié)構(gòu)單元和含有地西他濱(5-氮雜-2'-脫氧胞苷；D)、富含DpG(地西他濱-磷酸二酯連接-鳥(niǎo)苷)島和衍生物的寡核苷酸。還提供制備、配制和施用這些化合物或組合物作為需要其的宿主的治療劑的方法。相關(guān)技術(shù)描述地西他濱是目前研發(fā)的用于治療慢性髓細(xì)胞白血病(CML)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、非小細(xì)胞肺(NSCL)癌、鐮刀細(xì)胞貧血癥和急性髓細(xì)胞白血病(AML)的新藥物?？梢詤^(qū)分地西他濱的兩種異構(gòu)形式。(3-正向異構(gòu)體是活性形式，其在圖1中顯示。地西他濱擁有多種藥理學(xué)特性。在分子水平上，它在細(xì)胞周期的S期結(jié)合到DNA中。在細(xì)胞水平上，地西他濱可以誘導(dǎo)細(xì)胞分化和行使血液學(xué)毒性。除了在體內(nèi)具有短半衰期之外，地西他濱具有極好的組織分布。地西他濱的一種功能是其特異性并且有效抑制DNA甲基化的能力。DNA甲基化是許多系統(tǒng)常見(jiàn)的外遺傳作用。這種修飾包括胞嘧啶在C-5位置(la")的共價(jià)修飾。通過(guò)識(shí)別DNA復(fù)制后半甲基化的DNA的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族，甲基化模式穩(wěn)定地保持在CpG二核苷酸。在細(xì)胞內(nèi)，地西他濱首先通過(guò)脫氧胞苷激酶轉(zhuǎn)化成它的活性形式，磷酸化的5-氮雜-脫氧胞苷，其主要在細(xì)胞周期的S期合成。地西他濱對(duì)脫氧胞苷激酶的催化位點(diǎn)的親和力與天然底物，脫氧胞苷相似(Momparler等1985Mol.Pharmacol.(分子藥理學(xué))30:287-299)。在通過(guò)脫氧胞苷激酶轉(zhuǎn)化成它的三磷酸形式后，地西他濱以與天然底物dCTP相似的速率結(jié)合到正在復(fù)制的DNA中(Bouchard和Momparler1983Mol.Pharmacol.(分子藥理學(xué))24:109-114)。在正常細(xì)胞中，持家基因的富含CpG的序列通常免受甲基化。在癌細(xì)胞中，在腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子區(qū)域CpG-島中的異常的過(guò)度甲基化作用是與腫瘤發(fā)生表型的發(fā)展相關(guān)的最常見(jiàn)的事件之一。每種分化的細(xì)胞具有其獨(dú)特的甲基化模式。地西他濱結(jié)合到DNA鏈中具有甲基化不足作用。在染色體復(fù)制后，為了保持這種甲基化模式，在親本鏈中的5-甲基胞嘧啶作用為在互補(bǔ)子DNA鏈的直接甲基化。用在胞嘧啶的C-5位置的碳取代氮干擾這種正常的DNA甲基化過(guò)程。在甲基化特異性位點(diǎn)用地西他濱取代胞嘧啶產(chǎn)生DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的不可逆的失活。地西他濱忠實(shí)地作用為胞嘧啶殘基，直到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶試圖將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到子代細(xì)胞的半甲基化的DNA鏈上。在這一步驟中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶酶被地西他濱共價(jià)截留在DNA中，并且不能進(jìn)一步沉默(甲基化)其余的胞嘧啶殘基(Juttermann等.1994Proc,Natl.Acad.SciUSA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))91:11797-11801)。地西他濱的這種獨(dú)特的作用機(jī)制允許從前輪細(xì)胞分裂沉默的(一旦被甲基化)基因重新表達(dá)。在地西他濱處理后這種活性截留在半甲基化的DNA中存在達(dá)到48小時(shí)。在進(jìn)一步DNA合成和細(xì)胞周期分裂后，來(lái)自半甲基化DNA的子代鏈導(dǎo)致在這些位點(diǎn)完全未甲基化的DNA鏈(JonesP.2001Nature(自然)409:141,143-4)。通過(guò)特異性抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，甲基化所需要的酶，可以逆轉(zhuǎn)腫瘤抑制基因的異常甲基化。除了它在CML、MDS和AML中已證明的抗白血病作用外，地西他濱的潛在應(yīng)用己經(jīng)受到延遲和延長(zhǎng)的骨髓抑制的阻礙。在更長(zhǎng)的時(shí)間階段給與的更低劑量的地西他濱，已經(jīng)將骨髓抑制作用減小到易于管理的程度，而沒(méi)有破壞其通過(guò)其甲基化不足作用而抑制癌癥的能力。在更高的劑量，相關(guān)的毒性是被抑制的。然而，在地西他濱的最大耐受劑量對(duì)血液和實(shí)體瘤的治療是無(wú)效的。骨髓抑制作用的起因尚不清楚?？赡苁怯捎诘匚魉麨I隨機(jī)地和廣泛地結(jié)合到S期細(xì)胞的DNA中，包括參與正常造血作用的骨髓細(xì)胞的DNA中。由于地西他濱的不穩(wěn)定性引起的嚴(yán)重DNA損傷導(dǎo)致壞死。由于地西他濱的結(jié)合不僅僅限于富含CpG的序列，所以由于地西他濱的不穩(wěn)定性，DNA可以斷裂，并且需要在CpG島之外的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)。地西他濱和阿扎胞苷在水性介質(zhì)中不穩(wěn)定，并且進(jìn)行水解降解。在酸性介質(zhì)中，地西他濱在室溫下水解成5-氮雜胞嘧啶和2-脫氧核糖。在室溫下在中性介質(zhì)中，三嗪環(huán)的開(kāi)環(huán)發(fā)生在6-位置，以形成瞬時(shí)的中間甲?；苌?，其進(jìn)一步降解成脒基脲衍生物和甲酸(Piskala,A.;Synackova,M.;Tomankova,H.;Fiedler,P.;Zizkowsky，V.NucleicAcidsRes.(核酸研究)1978,4,sl09-s-113.)。在6-位置的這種水解在酸性和堿性水性介質(zhì)中以甚至更快的速率發(fā)生。考慮與地西他濱相關(guān)的化學(xué)不穩(wěn)定性和毒性，存在開(kāi)發(fā)不但更加穩(wěn)定的地西他濱衍生物而且較好的甲基化不足的試劑的需要，其中結(jié)合盡可能地定位在CpG島，或者實(shí)現(xiàn)甲基化不足作用而沒(méi)有顯著影響DNA的完整性。發(fā)明概述本發(fā)明提供在寡核苷酸序列中結(jié)合5-氮雜-胞嘧啶，例如，以5-氮雜-2'-脫氧核苷(地西他濱)或5-氮雜-胞苷形式的寡核苷酸類(lèi)似物。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供在長(zhǎng)度上具有12個(gè)或更少的堿基的分離的或合成的寡核苷酸類(lèi)似物，其在所述寡核苷酸類(lèi)似物序列中包括一個(gè)或多個(gè)5-氮雜-胞嘧啶殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物具有通式—Z-L-G—,或一G-L-Z—，其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；和L是共價(jià)連接Z和G的化學(xué)接頭。所述寡核苷酸類(lèi)似物任選地在寡核苷酸類(lèi)似物序列中具有大于30%、35%或40°/。的鳥(niǎo)嘌呤殘基。在特別的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物選自由下列各項(xiàng)組成的組5，-DpG-3'，5，-GpD-3，，5，-DpGpD-3，，5'畫(huà)GpGpD-3，，5，-GpDpG-3，,5，-GpDpD-3，，5，-DpDpG-3，，5，-DpGpG-3，，5，-GpDpD-3，，5，-DpGpA-3，,5，-DpGpDpG-3，，5，-DpGpGpD-3，，5，-GpDpGpD-3，，5，-GpDpDpG-3，,5，-DpGpDpGpA-3'，其中D是地西他濱；p是磷酸接頭；A是2'-脫氧腺苷,和G是2'-脫氧鳥(niǎo)苷。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供一種分離的或合成的寡核苷酸類(lèi)似物，其包括2個(gè)或多個(gè)拷貝的具有下述通式的二核苷酸類(lèi)似物—Z-L-G—,或一G-L-Z—，其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；和L是共價(jià)連接Z和G的化學(xué)接頭。任選地，所述寡核苷酸類(lèi)似物包含少于10個(gè)、8個(gè)、6個(gè)或4個(gè)拷貝的二核苷酸類(lèi)似物一Z-L-G—，或一G-L-Z—。在特別的實(shí)施方案中，寡核苷酸類(lèi)似物包括選自由下列各項(xiàng)組成的組的片段5，-DpG-3，，5'層GpD-3'，5，-DpGpD-3，，5，-GpGpD-3，，5，-GpDpG-3，，5'同GpDpD-3',5，-DpDpG-3，，5，-DpGpG-3，，5'-GpDpD-3',5,誦DpGpA-3',5，-DpGpDpG-3',5，-DpGpGpD-3，，5，-GpDpGpD-3，，5，-GpDpDpG-3，,5'-DpGpDpGpA-3',其中D是地西他濱；p是磷酸接頭；A是2'-脫氧腺苷,和G是2'-脫氧鳥(niǎo)苷。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供在長(zhǎng)度上具有至少6個(gè)堿基的分離的或合成的寡核苷酸類(lèi)似物，其在所述寡核苷酸類(lèi)似物的序列中包含一個(gè)或多個(gè)5-氮雜-胞嘧啶殘基，并且與基因片段，優(yōu)選是基因的5'-非翻譯區(qū)，諸如基因的啟動(dòng)子，具有至少75。/。的序列同源性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物具有通式—Z-L-G—,或一G-L-Z—,其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；和L是共價(jià)連接Z和G的化學(xué)接頭。所述寡核苷酸類(lèi)似物任選地在所述寡核苷酸類(lèi)似物序列中具有大于30%，35%,或40%的鳥(niǎo)嘌呤殘基。在特別的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物包含選自由下列各項(xiàng)組成的組的片段5，-DpG-3，，5，-GpD-3，，5，-DpGpD-3，，5，-GpGpD-3，,5,-GpDpG-3，，5,-GpDpD-3，，5，-DpDpG-3，，5，-DpGpG-3,，5，-GpDpD-3,,5，-DpGpA-3，，5,-DpGpDpG醫(yī)3，，5，-DpGpGpD-3，，5'-GpDpGpD-3',5，-GpDpDpG-3，，5，-DpGpDpGpA-3，，其中D是地西他濱；p是磷酸接頭;A是2'-脫氧腺苷，和G是2'-脫氧鳥(niǎo)苷。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供結(jié)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶上的變構(gòu)位點(diǎn)并且由此抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的寡核苷酸類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物具有下述序列5'-CTGGATCCTTGCCCCGCCCCTTGAATTCCC-3'(SEQIDNO:25);5'-GGGAATTCAAATGACGTCAAAAGGATCCAG-3'(SEQIDNO:26);5'-CCTACCCACCCTGGATCCTTGCCCCGCCCCTTGAATTCCCAACCCTCCAC-3，(SEQIDNO:27);5'-ATCCTTGCCCCGCCCCTTGAAT-3'(SEQIDNO:28);或5'-TTGCCCCGCCCCTT(SEQIDNO:29),其中SEQIDNOs:25-29中的至少一個(gè)胞嘧啶殘基用5-氮雜-胞嘧啶取代。例如，所述寡核苷酸類(lèi)似物可以是5'-CTGGATCCTTGCCCDGCCCCTTGAATTCCC-3'(SEQIDNO:30)，其中在SEQIDNO:25中的14個(gè)胞嘧啶殘基在核苷酸位置15的一個(gè)用5-氮雜-胞嘧啶取代。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供一種寡核苷酸類(lèi)似物，其為至少6個(gè)核苷酸長(zhǎng)，具有至少一個(gè)5-氮雜-胞嘧啶作為堿基殘基，并且在室溫如20-25。C在水溶液如水、鹽水或包含20mMHEPES(pH7),12%甘油，1mMEDTA,4mM二硫蘇糖醇，0.1。/。乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40,和3mMMgCl2的緩沖液中采取發(fā)夾構(gòu)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物具有下述通用的二級(jí)結(jié)構(gòu)其中N是任何核苷酸；N'是與N互補(bǔ)的核苷酸；Z是作為堿基殘基的5-氮5^~Nn-Z—Nm-HM'n——G——N'm.雜-胞嘧啶；G是作為堿基殘基的鳥(niǎo)嘌呤；I,n,或m是整數(shù)；核苷酸Nn,Nm,N'n,和N'm位于發(fā)夾的干區(qū)；和N,位于發(fā)夾的環(huán)區(qū)。優(yōu)選地，1,n,或m是大于2，3,4,或5的整數(shù)。任選地，1是2,3,4,5,或6。還任選地，如果Nn,Nm,或N,具有一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶殘基，那么所述胞嘧啶殘基用5-氮雜-胞嘧啶取代。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物(SEQIDNO:31)具有下述發(fā)夾構(gòu)象其中D是地西他濱，A是腺苷或2'-脫氧腺苷.,T是胸苷或2'-脫氧胸苷,和在核苷酸位置21的C任選地用5-甲基-2'-脫氧胞苷取代。在任何上述實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物可以是單鏈的或雙鏈的。當(dāng)所述寡核苷酸類(lèi)似物是雙鏈的時(shí)，第一鏈?zhǔn)撬龉押塑账犷?lèi)似物，并且第二鏈可以是具有與第一鏈互補(bǔ)的序列而胞嘧啶殘基沒(méi)有被5-氮雜-胞嘧啶取代的寡核苷酸。例如，第一鏈可以是5'-TTDGDGAA-3'(SEQIDNO:32)，其中D是地西他濱；而第二鏈可以是5'-TTCGCGAA-3'(SEQIDNO:33)。任選地，當(dāng)寡核苷酸的第二鏈包含一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶殘基時(shí)，至少一個(gè)胞嘧啶殘基被5-甲基-胞嘧啶取代。還任選地，當(dāng)?shù)谝绘溇哂?'-Z-L-G-3'片段時(shí)，第二鏈包含與第一鏈中的5'-Z-L-G-3'片段匹配的3'-G-L-C'-5'片段，其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；L是共價(jià)連接Z和G或G和C'的化學(xué)接頭；和C'是5-甲基-胞嘧啶。還任選地，當(dāng)?shù)谝绘溇哂?'-G-L-Z-3'片段時(shí)，第二鏈包含與第一鏈中的5'-G-L-Z-3'片段匹配的3'-C，-L-G-5'片段，其中Z是5-氮雜-胞嘧啶;G是鳥(niǎo)嘌呤；L是共價(jià)連接Z和G或G和C'的化學(xué)接頭；和C'是5-甲基-胞嘧啶。本發(fā)明還提供合成所述寡核苷酸類(lèi)似物的方法和調(diào)控核酸甲基化的方法。還提供用于合成所述寡核苷酸類(lèi)似物、配制并且施用這些化合物或組合物以治療病況如癌癥和血液學(xué)疾病的亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元。參考文獻(xiàn)結(jié)合本說(shuō)明書(shū)中提及的所有公布和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合于此，其程度與單個(gè)公布或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)引用特別和單獨(dú)指示結(jié)合相同。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的新穎特征特別在后附的權(quán)利要求中描述。通過(guò)參考下述在應(yīng)用本發(fā)明原理的示例性實(shí)施方案中闡述的詳細(xì)描述將獲得對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好理解，并且其附圖為圖l顯示地西他濱，D(la)，胞嘧啶，C(la'),和5-甲基胞嘧啶，mC(la")的結(jié)構(gòu)。圖2A描述地西他濱亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元的實(shí)例。圖2B描述地西他濱亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元ld，其中R嚴(yán)苯氧乙?；D3A描述3'-和5'-0-封端的和控制孔玻璃3'-連接的地西他濱衍生物。圖3B描述保護(hù)的地西他濱3'-連接到控制孔的玻璃支持物上。圖4描述3'-6>-封端的地西他濱衍生物的實(shí)例。圖5圖示寡核苷酸合成的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)。圖6A顯示GpD二核苷酸和四核苷酸的合成方案，其中X+是平衡離子。圖6B顯示GpD二核苷酸(2a)和DpGpGpD四核苷酸(3b)的模式合成循環(huán)。圖7顯示DpGpGpD四核苷酸。圖8顯示GpD二核苷酸和四核苷酸的合成方案。圖9顯示GpDpG三核苷酸和GpDpDpG四核苷酸。圖10顯示3'-連接在聚(乙二醇)上的保護(hù)的地西他濱。圖11顯示3'-和5'-0-封端的GpD二核苷酸的合成方案。圖12顯示3'-和5'-0-封端的DpG二核苷酸的合成方案。圖13顯示具有核酸酶抗性硫代磷酸酯(phosphorthioate)連接的GpD和DpG二核苷酸。圖14顯示具有核酸酶抗性硫代磷酸酯連接的GpDpGpD和DpGpGpD四核苷酸。圖15顯示具有核酸酶抗性硫代磷酸酯連接的DpGpDpG和GpDpDpG四核苷酸。圖16顯示具有胞苷脫氨酶抗性4-氨基基團(tuán)的GpD和DpG二核苷酸。圖17描述具有胞苷脫氨酶抗性4-氨基基團(tuán)和核酸酶抗性硫代磷酸酯連接的GpD和DpG二核苷酸。圖18描述具有胞苷脫氨酶抗性4-氨基基團(tuán)的GpDpGpD和DpGpGpD四核苷酸。圖19描述具有胞苷脫氨酶抗性4-氨基基團(tuán)和核酸酶抗性硫代磷酸酯連接的GpDpGpD和DpGpGpD四核苷酸。圖20描述具有胞苷脫氨酶抗性4-氨基基團(tuán)的帽-0-GpD-0-帽和帽-O-DpG-O-帽二核苷酸。圖21描述具有胞苷脫氨酶抗性4-氨基基團(tuán)和核酸酶抗性硫代磷酸酯連接的帽-O-GpD-O-帽和帽-O-DpG-O-帽二核苷酸。圖22描述具有胞苷脫氨酶抗性4-氨基基團(tuán)的DpGpDpG和GpDpDpG四核苷酸。圖23描述具有胞苷脫氨酶抗性4-氨基基團(tuán)和核酸酶抗性硫代磷酸酯連接的DpGpDpG和GpDpDpG四核苷酸。圖24A描述具有天然磷酸二酯主鏈或修飾的主鏈的-DpG-島。圖24B描述-DpG-島肽主鏈。圖25示例性圖示關(guān)于DNA甲基化的基于細(xì)胞的GFP測(cè)定。版a)顯示對(duì)照細(xì)胞；和版b)的細(xì)胞用本發(fā)明的寡核苷酸和表達(dá)的GFP處理。圖26列出特異性耙向P15、BRAC1或P16的啟動(dòng)子區(qū)的本發(fā)明寡核苷酸類(lèi)似物的實(shí)例，其中D可以是地西他濱或地西他濱類(lèi)似物，和對(duì)于天然磷酸酯連接，px=p，對(duì)于硫代磷酸酯連接，px=ps，對(duì)于硼代磷酸酯(boranophospate)，px=bp，對(duì)于甲基磷酸酉旨連接，px=mp。圖27列出P15啟動(dòng)子區(qū)的序列以及其片段的實(shí)例，基于其可以制備富含DpG和GpD的寡核苷酸類(lèi)似物。圖28列出P16啟動(dòng)子區(qū)的序列以及其片段的實(shí)例，基于其可以制備富含DpG和GpD的寡核苷酸類(lèi)似物。圖29列出BRCA1啟動(dòng)子區(qū)的序列以及其片段的實(shí)例，基于其可以制備富含DpG和GpD的寡核苷酸類(lèi)似物。圖30是GpD(2a)三乙基銨鹽的質(zhì)譜。圖31是DpG(2b)三乙基銨鹽的質(zhì)譜。圖32是DpGpGpD(3b)三乙基銨鹽的質(zhì)譜。圖33是GpDpG(3c')三乙基銨鹽的質(zhì)譜。圖34是DpGpDpG(3c)三乙基銨鹽的質(zhì)譜。圖35是硫代磷酸酯連接的DpG(2f)三乙基銨鹽的質(zhì)譜。圖36是DpG(2b)鈉鹽的質(zhì)譜。圖37是HEG-DpG(2d)三乙基銨鹽的質(zhì)譜。圖38是地西他濱亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元(ld;=苯氧乙?；?的質(zhì)譜。發(fā)明詳述本發(fā)明提供在寡核苷酸類(lèi)似物序列中結(jié)合胞嘧啶的類(lèi)似物，5-氮雜-胞嘧啶，例如，以5-氮雜-2'-脫氧胞苷(也稱(chēng)為地西他濱)或5-氮雜-胞苷(5-氮雜C)的形式的寡核苷酸類(lèi)似物。據(jù)信，由于用地西他濱取代在甲基化的特異性位點(diǎn)的胞嘧啶產(chǎn)生不可逆的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的失活，所以在寡核苷酸中結(jié)合一個(gè)或多個(gè)5-氮雜-胞嘧啶殘基將具有DNA甲基化不足作用。優(yōu)選地，為了更特異性地靶向人基因組的CpG島，地西他濱結(jié)合到5'-臨近鳥(niǎo)嘌呤殘基的寡核苷酸中，以形成DpG島。本發(fā)明目的是克服與常規(guī)甲基化不足試劑諸如地西他濱和5-氮雜-胞嘧啶相關(guān)的潛在的毒性。與隨機(jī)和廣泛地結(jié)合到整個(gè)基因組中的游離核苷形式比較，本發(fā)明的化合物可以作為引物，并且在復(fù)制過(guò)程中主要結(jié)合到DNA的富含CpG的島中。優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物作為引物，并且特異性結(jié)合到治療或診斷重要的基因如腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子的富含CpG的島中。本發(fā)明的化合物可以形成具有親本鏈的暫時(shí)半甲基化的鏈，并且作用為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性截留物(tmp)而不被結(jié)合。本發(fā)明的化合物還可以直接占據(jù)并且截留DNA甲基轉(zhuǎn)移酶而不被結(jié)合到基因組中。由于DNA修飾定位在腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)的富含CpG的島，當(dāng)結(jié)合本發(fā)明的化合物時(shí)，活性截留物被最佳放置，并且更大基因組的整體穩(wěn)定性保持不被破壞。通過(guò)調(diào)控DNA甲基化，本發(fā)明的化合物可以用作治療、診斷以及研究試劑，特別是在癌癥和血液學(xué)疾病的領(lǐng)域中。許多基因如腫瘤抑制基因的異常轉(zhuǎn)錄沉默直接與癌癥和其它疾病的發(fā)病機(jī)理相關(guān)。由于癌癥-相關(guān)基因的甲基化，這些基因的表達(dá)受到抑制或完全沉默。同時(shí)，這些基因的表達(dá)是誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯、分化和/或凋亡性細(xì)胞死亡所需要的。在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中這些基因的失活導(dǎo)致這些細(xì)胞的不可控制的增殖，這最終導(dǎo)致癌癥。因此，通過(guò)使用本發(fā)明的化合物直接主動(dòng)截留DNA甲基轉(zhuǎn)移酶并且不結(jié)合到基因組中或者結(jié)合到這些基因的富含CpG的島中，這些基因的轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)抑制啟動(dòng)子的甲基化而被失活，由此導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖的抑制。由于本發(fā)明化合物的一些實(shí)施方案可以與基因的5'-非翻譯區(qū)或啟動(dòng)子序列雜交，使得夾心式和其它測(cè)定容易地建立以研究這一事實(shí)，所以本發(fā)明的化合物還可以用于研究和診斷。本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物與啟動(dòng)子序列的雜交可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法檢測(cè)。所述方法可以包括酶與寡核苷酸類(lèi)似物的綴合或非共價(jià)結(jié)合，寡核苷酸類(lèi)似物的放射性標(biāo)記，或任何其它適宜的檢測(cè)方法。還可以制備使用這樣的關(guān)于樣品中基因啟動(dòng)子活性調(diào)控的檢測(cè)方法的試劑盒。本發(fā)明還提供合成這些寡核苷酸類(lèi)似物的方法和調(diào)控C-5胞嘧啶甲基化的方法。特別地，提供亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元和含有地西他濱(5-氮雜-2'-脫氧胞苷；D)、富含DpG(地西他濱-磷酸二酯連接-鳥(niǎo)嘌呤)的島和衍生物的寡核苷酸。還提供制備、配制和施用這些化合物或組合物作為需要其的宿主的治療劑的方法。下文詳細(xì)描述本發(fā)明的化合物、合成方法、藥物組合物的配制、容器和試劑盒制備、以及所述化合物或組合物用于治療疾病或病況的應(yīng)用。1.本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物通常，本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物具有結(jié)合到寡核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)5-氮雜-胞嘧啶(以下簡(jiǎn)寫(xiě)為"Z')殘基。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供長(zhǎng)度上具有12個(gè)或更少堿基的分離的或合成的寡核苷酸類(lèi)似物，其在所述寡核苷酸類(lèi)似物的序列中包含一個(gè)或多個(gè)5-氮雜-胞嘧啶殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物具有通式—Z-L-G—，或一G-L-Z—,其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；和L是共價(jià)連接Z和G的化學(xué)接頭。所述寡核苷酸類(lèi)似物任選地在寡核苷酸類(lèi)似物序列中具有大于30%、35%或40%的鳥(niǎo)嘌呤殘基。在特別的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物選自由下列各項(xiàng)組成的組5，-DpG-3，，5，-GpD-3，，5，-DpGpD-3，，5，-GpGpD-3，，5，-GpDpG-3，,5,-GpDpD-3，，5,-DpDpG畫(huà)3'，5'-DpGpG-3',5，-GpDpD-3，，5，-DpGpA-3，，5，-DpGpDpG-3，，5，-DpGpGpD-3，，5，-GpDpGpD-3，，5，-GpDpDpG-3，，5'-DpGpDpGpA-3',其中D是地西他濱；p是磷酸接頭；A是2'-脫氧腺苷,和G是2'-脫氧鳥(niǎo)苷。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供一種分離的或合成的寡核苷酸類(lèi)似物，其包括2個(gè)或多個(gè)拷貝的具有下述通式的二核苷酸類(lèi)似物一Z-L-G—，或一G-L-Z—,其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；和L是共價(jià)連接Z和G的化學(xué)接頭。任選地，所述寡核苷酸類(lèi)似物包含少于10個(gè)、8個(gè)、6個(gè)或4個(gè)拷貝的二核苷酸類(lèi)似物一Z-L-G—，或一G-L-Z—。在特別的實(shí)施方案中，寡核苷酸類(lèi)似物包括選自由下列各項(xiàng)組成的組的片段5，-DpG-3，，5，-GpD-3，，5，-DpGpD-3，，5，-GpGpD-3，，5，-GpDpG-3，,5,-GpDpD-3，，5，-DpDpG-3，，5，-DpGpG-3，，5，-GpDpD-3，，5，-DpGpA-3，,5，-DpGpDpG-3，，5'-DpGpGpD-3',5，-GpDpGpD-3，，5，-GpDpDpG-3，,5，-DpGpDpGpA-3',其中D是地西他濱；p是磷酸接頭；A是2'-脫氧腺苷,和G是2'-脫氧鳥(niǎo)苷。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供在長(zhǎng)度上具有至少6個(gè)堿基的分離的或合成的寡核苷酸類(lèi)似物，其在所述寡核苷酸類(lèi)似物的序列中包含一個(gè)或多個(gè)5-氮雜-胞嘧啶殘基，并且與基因片段，優(yōu)選是基因的5'-非翻譯區(qū)，諸如基因的啟動(dòng)子，具有至少75%的序列同源性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物具有通式一Z-L-G—，或一G-L-Z—，其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；和L是共價(jià)連接Z和G的化學(xué)接頭。所述寡核苷酸類(lèi)似物任選地在所述寡核苷酸類(lèi)似物序列中具有大于30%，35%,或40%的鳥(niǎo)嘌呤殘基。在特別的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物包含選自由下列各項(xiàng)組成的組的片段5，-DpG-3，，5，-GpD-3，，5，-DpGpD陽(yáng)3，，5，-GpGpD-3，，5，-GpDpG-3，，5'-GpDpD-3',5，-DpDpG-3，，5，-DpGpG-3，，5，-GpDpD-3'，5，-DpGpA-3，，5，-DpGpDpG-3，，5，-DpGpGpD-3，，5，-GpDpGpD_3，，5，-GpDpDpG-3',5，-DpGpDpGpA-3，，其中D是地西他濱；p是磷酸接頭；A是2'-脫氧腺苷，和G是2'-脫氧鳥(niǎo)苷。所述基因優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物基因，并且更優(yōu)選地是人基因，并且最優(yōu)選地是人腫瘤抑制基因。人基因的實(shí)例包括，但不限于，VHL(涉及腎細(xì)胞癌的VonHipponLandau基因)；P16/INK4A(涉及淋巴瘤)；E-鈣黏著蛋白(涉及乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌的轉(zhuǎn)移);hMLHl(涉及結(jié)腸癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌中的DNA修復(fù))；BRCA1(涉及乳腺癌和卵巢癌中的DNA修復(fù))；LKB1(涉及結(jié)腸癌和乳腺癌)；P15/INK4B(涉及白血病如AML和ALL);ER(雌激素受體，涉及乳腺癌、結(jié)腸癌和白血病)；06-MGMT(涉及腦癌、結(jié)腸癌、肺癌和淋巴瘤中的DNA修復(fù));GST-pi(涉及乳腺癌、前列腺癌和腎癌);TIMP-3(組織金屬蛋白酶，涉及結(jié)腸癌、腎癌和腦癌轉(zhuǎn)移);DAPK1(DAP激酶，涉及B-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡);P73(涉及淋巴瘤細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡);AR(雄激素受體，涉及前列腺癌);RAR-卩(視黃酸受體-卩，涉及前列腺癌)；內(nèi)皮縮血管肽-B受體(涉及前列腺癌);Rb(涉及成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的細(xì)胞周期調(diào)控)；P14ARF(涉及細(xì)胞周期調(diào)控)；RASSF1(涉及信號(hào)傳導(dǎo))；APC(涉及信號(hào)傳導(dǎo))；胱天蛋白酶-8(涉及程序性細(xì)胞死亡)；TERT(涉及衰老)；TERC(涉及衰老)；TMS-1(涉及程序性細(xì)胞死亡)；SOCS-l(涉及肝癌的生長(zhǎng)因子應(yīng)答)；PITX2(肝癌乳腺癌)；MINT1;MINT2;GPR37;SDC4;MYOD1;MDR1;THBS1;PTC1;禾flpMDRl，如在Santini等.(2001)Ann.ofIntern.Med.(國(guó)際醫(yī)學(xué)年刊)134:573-586中所述，其通過(guò)引用完全結(jié)合于此。這些基因的核苷酸序列可以從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的網(wǎng)址找到。例如，腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子序列，pl5,pl6,禾QBRCA1，分別顯示在圖27，28和29中。與p15，p16,和BRCA1片段具有至少75%的序列同源性的寡核苷酸類(lèi)似物的實(shí)例分別顯示在圖27，28和29中。核酸領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，測(cè)試多核苷酸與其目標(biāo)多核苷酸的序列同源性程度越高，測(cè)試多核苷酸可以保持與目標(biāo)多核苷酸雜交的條件的嚴(yán)格性越高。因此，設(shè)計(jì)靶向特異性基因的本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物是那些在非常低到非常高的嚴(yán)格條件下與目標(biāo)基因雜交的寡核苷酸類(lèi)似物。對(duì)于長(zhǎng)度上至少約100個(gè)核苷酸的寡核苷酸類(lèi)似物，非常低到非常高的嚴(yán)格條件定義為在42。C在5XSSPE,0.3%SDS,200嗎/ml剪切的和變性的鮭精DNA，以及用于非常低和低嚴(yán)格性的25%甲酰胺，用于中等和中高嚴(yán)格性的35%甲酰胺，或用于高和非常高嚴(yán)格性的50%甲酰胺中的預(yù)雜交和雜交，其按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡方法進(jìn)行。使用2XSSC，0.2%SDS將載體材料最后清洗三次，每次15分鐘，優(yōu)選地至少在45。C(非常低的嚴(yán)格性)，更優(yōu)選地至少在5(TC(低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選地至少在55。C(中等嚴(yán)格性)，更優(yōu)選地至少在60°C(中高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選地至少在65°C(高嚴(yán)格性)，和最優(yōu)選地至少在7(TC(非常高的嚴(yán)格性)清洗。對(duì)于長(zhǎng)度上約50個(gè)核苷酸到約100個(gè)核苷酸的更短的寡核苷酸類(lèi)似物，嚴(yán)格性條件定義為在低于使用按照Bolton和McCarthy(1962,尸raceW"gsAeiVa"'omz/Jc<3(iem_yo/5We"ces(美國(guó)國(guó)家禾斗學(xué)院學(xué)報(bào))48:1390)的計(jì)算而計(jì)算出的Tm的5。C到10°C，在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40,1XDenhardt's溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP,和0.2mg酵母RNA/ml中的預(yù)雜交、雜交和雜交后的清洗，其按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡方法進(jìn)行。在低于計(jì)算的L的5'C至ij10°C，將載體材料在6XSCC加0.1%SDS清洗一次持續(xù)15分鐘，用6XSSC清洗兩次每次15分鐘。高嚴(yán)格性條件的另一個(gè)非限制性實(shí)例包括含有例如約5XSSC，0.5%SDS,100pg/ml變性的鮭精DNA和50%的甲酰胺的雜交溶液，在42。C進(jìn)行。在允許，例如，小于5%bp的錯(cuò)配(例如，在65"在0.1%SSC和0.1%SDS中洗滌30分鐘，洗滌兩次)，即，選擇具有95。/?；蚋蟮男蛄邢嗤缘男蛄械母邍?yán)格性條件下清洗印跡。高嚴(yán)格性條件的另一個(gè)非限制性實(shí)例包括在65"C在含有30mMNaCl和0.5%SDS的水性緩沖液中的最終清洗。高嚴(yán)格性條件的另一個(gè)實(shí)例是在7%SDS，0.5MNaP04,pH7,1mMEDTA中在50。C雜交，例如，雜交過(guò)夜，然后在42"C用1%SDS溶液清洗一次或多次。而高嚴(yán)格性清洗可以允許小于5%的錯(cuò)配，減小的或低嚴(yán)格性條件可以允許達(dá)到20%的核苷酸錯(cuò)配。在低嚴(yán)格性的雜交可以按上述完成，但是使用更低的甲酰胺條件，更低的溫度和/或更低的鹽濃度，以及更長(zhǎng)的溫育時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物能夠在低嚴(yán)格性條件下與目標(biāo)序列雜交。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物能夠在中等嚴(yán)格性條件下與目標(biāo)基因雜交。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物能夠在高嚴(yán)格性條件下與目標(biāo)基因雜交。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供結(jié)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶上的變構(gòu)位點(diǎn)并且由此抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的寡核苷酸類(lèi)似物。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制防止DNA甲基化，由此治療與異常的DNA甲基化相關(guān)的疾病，諸如癌癥和血液疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物具有下述序列5，-CTGGATCCTTGCCCCGCCCCTTGAATTCCC■3,(SEQIDNO:25);5,-GGGAATTCAAATGACGTCAAAAGGATCCAG-3，(SEQIDNO鄰；.5，:CCJACCCACCCTGGATCCTTGCCGGGCCCGTTGAATTCCCAA-CCCTCCAC"3'(SEQIDNO:27);5，-ATCCTTGCCCCGCCCCTTGAAT-3'(SEQIDNO:28);或5，-TTGCCCCGCCCCTT(SEQIDNO:29)，其中SEQIDNOs:25一28中的至少一個(gè)胞嘧啶殘基用5-氮雜-胞嘧啶取代。例如，、所述寡核苷酸類(lèi)似物可以是5'-CTGGATCCTTGCCCDGCCCCTTGAATTCCC-3'(SEQIDNO:30)，其中SEQIDNO:25中14個(gè)胞嘧啶殘基中在核苷酸位置15的那個(gè)用5-氮雜-胞嘧啶取代。與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的寡核苷酸的其它實(shí)例可以按照本發(fā)明進(jìn)行修飾，通過(guò)取代至少一個(gè)胞嘧啶殘基而修飾，所述實(shí)例可以在WO99/12027中找到，其通過(guò)引用完全結(jié)合于此。用于檢測(cè)本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物在結(jié)合和抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性中的活性的測(cè)定也可以在WO99/12027中找到。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供一種寡核苷酸類(lèi)似物，其為至少6個(gè)核苷酸長(zhǎng)，具有至少一個(gè)5-氮雜-胞嘧啶作為堿基殘基，并且在室溫如20-25。C在水溶液如水、鹽水或包含20mMHEPES(pH7),12%甘油，1mMEDTA,4mM二硫蘇糖醇，0.1%乙基苯基聚乙二醇P-40，和3mMMgCl2的緩沖液中采取發(fā)夾構(gòu)象。據(jù)信，通過(guò)采取發(fā)夾構(gòu)象，所述寡核苷酸類(lèi)似物比單鏈寡核苷酸更好地模擬DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的雙鏈DNA底物，因此更有效地抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物具有下述通用的二級(jí)結(jié)構(gòu)5^Nn-Z——Nnrr"^N'3^N'n——G——N'm~\^乂或5^~Nn-G—Nm"^N,3LN'n—Z—N'm、>其中N是任何核苷酸；N'是與N互補(bǔ)的核苷酸；Z是作為堿基殘基的5-氮雜-胞嘧啶；G是作為堿基殘基的鳥(niǎo)嘌呤；1,n,或m是整數(shù)；核苷酸Nn，Nm，N'n，和N'm位于發(fā)夾的干區(qū)；和N,位于發(fā)夾的環(huán)區(qū)。優(yōu)選地，1,n,或m是大于2，3，4,或5的整數(shù)。任選地，1是2,3,4,5，或6。還任選地，如果Nn,Nm,或N,具有一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶殘基，所述胞嘧啶殘基用5-氮雜-胞嘧啶取代。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物具有下述通用的二級(jí)結(jié)構(gòu)5'~~Nn~ZG——Nm~//~~^N,3'~N'n—GC'——N'm、」^~~^或5'~Nn~C'G—Nm^"~\！3'~N'n—GZ-N'm、」其中C'是5-甲基-胞嘧啶。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物(SEQIDNO:31)具有下述發(fā)夾構(gòu)象其中D是地西他濱，A是腺苷或2'-脫氧腺苷，T是胸苷或2'-脫氧胸苷，和在核苷酸位置21的C任選地用5-甲基-2'-脫氧胞苷取代。在任何上述實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物可以是單鏈的或雙鏈的。當(dāng)所述寡核苷酸類(lèi)似物是雙鏈的時(shí)，第一鏈?zhǔn)撬龉押塑账犷?lèi)似物，并且第二鏈可以是具有與第一鏈互補(bǔ)的序列而胞嘧啶殘基沒(méi)有被5-氮雜-胞嘧啶取代的寡核苷酸。例如，第一鏈可以是5'-TTDGDGAA-3'(SEQIDNO:32)，其中D是地西他濱；而第二鏈可以是5'-TTCGCGAA-3'(SEQIDNO:33)。任選地，在第一鏈或第二鏈中的至少一個(gè)胞嘧啶殘基可以用5-甲基-胞嘧啶取代。在任何上述實(shí)施方案中，在Z和G殘基之間或在所述寡核苷酸類(lèi)似物的任意兩個(gè)堿基殘基之間的接頭優(yōu)選地是糖磷酸二酯連接。優(yōu)選地所述接頭是通過(guò)2'-脫氧核糖或核糖的磷酸二酯連接，分別如同在DNA和RNA中的天然糖磷酸二酯主鏈。任選地，為了增強(qiáng)對(duì)體內(nèi)核酸酶降解的抗性，天然磷酸二酯接頭一0-P(0)(0')-0-CH2—可以被修飾成硫代磷酸酯接頭—0-P(=0)(S-)-0-CH2—，硼代磷酸酯或甲基磷酸酯接頭；核糖的2'-羥基基團(tuán)可以被修飾成2'-甲氧基基團(tuán)，2'-甲氧基乙基基團(tuán)，或2'-氟基團(tuán)。具有非天然主鏈的這樣的寡核苷酸類(lèi)似物的實(shí)例在圖24A中顯示，其中地西他濱通過(guò)核糖磷酸主鏈與鳥(niǎo)嘌呤連接。還任選地，天然糖磷酸二酯主鏈可以用蛋白質(zhì)核苷酸(PNA)主鏈替代，其中所述主鏈由通過(guò)肽鍵連接的重復(fù)N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單位形成。具有PNA主鏈的這樣的寡核苷酸類(lèi)似物的實(shí)例在圖24B中顯示，其中5-氮雜-胞嘧啶通過(guò)PNA主鏈與鳥(niǎo)嘌呤連接。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，900,540和6,900,301中描述了設(shè)計(jì)成比天然的更加抗核酸酶降解的用于寡核苷酸的其它類(lèi)型的接頭，所述專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合于此。本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物可以是從生物來(lái)源如組織、細(xì)胞和體液分離的那些，并且優(yōu)選地純化到基本的純度等級(jí)，更優(yōu)選地至少80%的純度，并且最優(yōu)選至少95%的純度。所述寡核苷酸類(lèi)似物還可以是合成的那些，其是包含5-氮雜-胞苷的非天然存在的寡核苷酸，例如，在體外化學(xué)或酶促合成的。本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物包括任何藥用鹽、酯、或所述酯的鹽、或任何其它的化合物，當(dāng)施用給動(dòng)物包括人時(shí)，其能夠提供(直接或間接地)生物活性代謝物或其殘基。因此，例如，本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容還涉及本發(fā)明的化合物的前體藥物(prodrugs)和藥用鹽，所述前體藥物的藥用鹽，及其它生物等價(jià)物。術(shù)語(yǔ)"前體藥物"指以無(wú)活性形式制備的治療劑，所述無(wú)活性形式在體內(nèi)或其細(xì)胞內(nèi)通過(guò)內(nèi)源酶或其它化學(xué)品和/或條件的作用可以轉(zhuǎn)化成活性形式(即，藥物)。特別地，本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物的前體藥物形式可以這樣制備，通過(guò)按照于1993年12月9日公布的Gosselin等的WO93/24510，或在Imbach等的WO94/26764和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,770,713中公開(kāi)的方法，使用含有羧基基團(tuán)的有機(jī)化合物，或作為SATE[(S-乙?；?2-硫代乙基)磷酸酯]衍生物，與在糖環(huán)中的任意羥基基團(tuán)形成一個(gè)或多個(gè)酯鍵而制備。術(shù)語(yǔ)"藥用鹽"指本發(fā)明的化合物的生理和藥用鹽即，保留親本化合物的需要的生物活性并且沒(méi)有對(duì)其賦予不需要的毒物學(xué)作用的鹽。藥用堿加成鹽用金屬或胺諸如堿和堿土金屬或有機(jī)胺形成。用作陽(yáng)離子的金屬的實(shí)例是鈉、鉀、鎂、鈣等。適當(dāng)?shù)陌返膶?shí)例是N,N'-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、二環(huán)己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普魯卡因(參見(jiàn)，例如，Berge等，"PharmaceuticalSalts(藥物鹽)，"J.ofPharmaSci.(藥學(xué)科學(xué)雜志)，1977,66,1-19)。所述酸式化合物的堿加成鹽通過(guò)將游離的酸形式與足夠量的需要的堿接觸從而以常規(guī)方式產(chǎn)生所述鹽而制備。所述游離酸形式可以通過(guò)將所述鹽形式與酸接觸并且以常規(guī)方式分離游離酸而再生。游離酸形式與它們各自的鹽形式在某些物理性質(zhì)如在極性溶劑中的溶解性稍微不同，但是另外為了本發(fā)明的目的，所述鹽等價(jià)于它們各自的游離酸。當(dāng)用在本文時(shí)，"藥物添加鹽"包括本發(fā)明的組合物的一種成分的酸性形式的藥用鹽。這些包括胺的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸鹽。優(yōu)選的酸式鹽是鹽酸鹽、乙酸鹽、水楊酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽。其它適當(dāng)?shù)乃幱名}是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的，并且包括各種無(wú)機(jī)和有機(jī)酸的堿式鹽，諸如，例如，使用無(wú)機(jī)酸，諸如例如鹽酸、氫溴酸、硫酸或磷酸；使用有機(jī)羧酸、磺酸、硫代酸或膦酸或N-取代的氨基磺酸，例如，乙酸、丙酸、羥基乙酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、甲基馬來(lái)酸、延胡索酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酸基苯甲酸、embonicacid、煙酸或異煙酸；和使用氨基酸，諸如涉及天然蛋白質(zhì)合成的20種a-氨基酸，例如，谷氨酸或天冬氨酸，并且還使用苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、乙垸-l,2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酯、葡萄糖-6-磷酸，N-環(huán)己基氨基磺酸(形成cyclamates)、或使用其它酸性有機(jī)化合物，諸如抗壞血酸?；衔锏乃幱名}還可以用藥用陽(yáng)離子制備。適當(dāng)?shù)乃幱藐?yáng)離子是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的，并且包括堿、堿土、銨和季銨陽(yáng)離子。碳酸鹽或碳酸氫鹽也是可以的。對(duì)于本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物，優(yōu)選的藥用鹽的實(shí)例包括但不限于，(a)用陽(yáng)離子形成的鹽，陽(yáng)離子例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、聚胺如精胺和亞精胺，等；(b)用無(wú)機(jī)酸形成的酸加成鹽，無(wú)機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；(c)與有機(jī)酸形成的鹽，有機(jī)酸諸如例如，乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、延胡索酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、棕櫚酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對(duì)-甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；和(d)由基本的陰離子如氯、溴和碘形成的鹽。本發(fā)明還包括分離的化合物。分離的化合物是指代表在混合物中存在的化合物的至少10%,優(yōu)選地20%,更優(yōu)選地50%和最優(yōu)選地80%的化合物，并且當(dāng)在生物測(cè)定如結(jié)合的亞硫酸氫鹽限制性分析或COBRA(Xiong,Z.;Laird,RW.NucleicAcidsRes.(核酸研究)1997,25,2532-2534)以及放射性標(biāo)記的甲基結(jié)合測(cè)定(Francis，K.T.;Thompson,R.W.;Krumdieck，C.L.Am.J.Clin.Nutr.(美國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志)1977，30,2028-2032)中檢測(cè)時(shí)，表現(xiàn)出可檢測(cè)的(即，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的)DNA甲基化的抑制活性。2.本發(fā)明的藥物制劑按照本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物或化合物可以配制成用于治療各種疾病和病況的藥用組合物。本發(fā)明的藥用組合物包括一種或多種本發(fā)明的化合物，其與一種或多種在本文中籠統(tǒng)叫作"載體"物質(zhì)的無(wú)毒的、藥用的載體和/或稀釋劑和/或佐劑和/或賦形劑締合，，并且如果需要還包含其它活性成分。本發(fā)明的化合物通過(guò)任何途徑施用，優(yōu)選地適合這樣的途徑的藥物組合物的形式，如在下文舉例說(shuō)明，并且取決于要治療的病況。例如，所述化合物和組合物可以通過(guò)口服、腸胃外、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、透皮、舌下、肌內(nèi)、直腸、經(jīng)頰、鼻內(nèi)、脂質(zhì)體、通過(guò)吸入、陰道、眼內(nèi)、通過(guò)局部遞送(例如通過(guò)導(dǎo)管或斯滕特印模(stent))、皮下、脂肪內(nèi)(intraadiposally)、關(guān)節(jié)內(nèi)、或鞘內(nèi)施用。所述藥物制劑可以任選地進(jìn)一步包含賦形劑，其以足以增強(qiáng)所述組合物的穩(wěn)定性，將產(chǎn)物保持在溶液中，或者防止與本發(fā)明制劑的施用相關(guān)的副作用(例如，潛在的潰瘍、血管發(fā)炎或外滲)的量添加。賦形劑的實(shí)例包括，但不限于，甘露醇，山梨糖醇，乳糖，葡萄糖(dextrox)，環(huán)糊精諸如a-、卩-和Y-環(huán)糊精，和修飾的、無(wú)定形的環(huán)糊精，諸如羥丙基-、羥乙基-、葡糖基-、麥芽糖基-、麥芽三糖基-、羧基酰胺甲基-、羧基甲基-、硫代丁基醚-、和二乙基氨基-取代的a-、P-和"環(huán)糊精。環(huán)糊精諸如來(lái)自楊森制藥(JanssenPharmaceuticals)的Encapsin⑧或等價(jià)物可以用于這一目的。對(duì)于口服施用，所述藥物組合物可以以，例如，片劑、膠囊、混懸液或液體形式存在。藥物組合物優(yōu)選地以包含治療有效量的活性成分的劑量單位形式制備。所述劑量單位的實(shí)例是片劑和膠囊。對(duì)于治療目的，除了活性成分之外，所述片劑和膠囊可以包含常規(guī)載體，諸如粘合劑，例如，阿拉伯樹(shù)膠、明膠、聚乙烯吡咯垸酮、山梨糖醇或西黃蓍膠；填料，例如，磷酸鈣、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨糖醇或蔗糖；滑潤(rùn)劑，例如，硬脂酸鎂、聚乙二醇、二氧化硅或滑石；崩解劑，例如，馬鈴薯淀粉、調(diào)味料或著色劑，或可接受的濕潤(rùn)劑?？诜后w制劑通常以水性或油性溶液、混懸液、乳液、糖漿或酏劑的形式存在，其可以包含常規(guī)的添加劑，諸如混懸劑、乳化劑、非水性劑、防腐劑、著色劑和調(diào)味劑。用于液體制劑的添加劑的實(shí)例包括阿拉伯樹(shù)膠、杏仁油、乙醇、分餾的椰子油、明膠、葡萄糖糖漿、甘油、氫化的食用脂肪、磷脂酰膽堿、甲基纖維素、甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯、丙二醇、山梨糖醇或山梨酸。對(duì)于局部應(yīng)用，本發(fā)明的化合物還可以以用于皮膚或鼻和喉粘膜的適當(dāng)形式制備，并且可以采取乳膏、油膏、液體噴霧劑或吸入劑、錠劑、或喉嚨涂劑的形式。這樣的局部制劑還可以包括化學(xué)化合物，諸如二甲亞砜(DMSO)，以促進(jìn)活性成分的表面滲透。對(duì)于應(yīng)用到眼或耳，本發(fā)明的化合物可以以配制在疏水或親水基質(zhì)如油膏、乳膏、洗液、涂劑或散劑中的液體或半液體形式存在。對(duì)于直腸施用，本發(fā)明的化合物可以以與常規(guī)載體如可可油、蠟或其它甘油酯混合的栓劑形式施用。備選地，本發(fā)明的化合物可以散劑形式存在，其在遞送時(shí)在適當(dāng)?shù)乃幱幂d體中重構(gòu)。藥物組合物可以通過(guò)注射施用。腸胃外施用的制劑可以是水性或非水性等滲無(wú)菌注射溶液或混懸液的形式。這些溶液或混懸液可以由具有一種或多種提及的載體的無(wú)菌散劑或粒劑制備，以用于口服施用的制劑。所述化合物可以溶解在聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、苯甲醇、氯化鈉和/或各種緩沖劑中。本發(fā)明的寡核苷酸類(lèi)似物可以制備和配制成乳劑。乳劑是一種液體以通常直徑超過(guò)0.1pm的小滴分散在另一種液體中的典型異相的系統(tǒng)。(Idson,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中,Lieberman,Rieger和Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第199頁(yè)；Rosoff,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中,Lieberman,Rieger和Banker(Eds.)，1988,MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第245頁(yè)；Block,在PharmaceuticalDosageForms(藥物齊U型)中，Lieberman,Rieger和Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第2巻，第335頁(yè)；Higuchi等，inRemington'sPharmaceuticalSciences(Remington藥物科學(xué)),MackPublishingCo.,Easton,Pa"1985，第301頁(yè))。乳劑通常是包含相互均勻混合和分散的兩種不混溶液體相的兩相系統(tǒng)。通常，乳劑可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)禾中類(lèi)。當(dāng)水相精細(xì)地分配到并且以微小的小滴分散到大量的油相中時(shí)，得到的組合物叫作油包水(w/o)乳劑。備選地，當(dāng)油相精細(xì)地分配到并且以微小的小滴分散到大量的水相中時(shí)，得到的組合物叫作水包油(o/w)乳劑。除了分散相和活性藥物以外，乳劑可以含有其它成分，所述活性藥物可以作為在水相、油相中的溶液或本身作為分離相而存在。當(dāng)需要時(shí)，藥物賦形劑諸如乳化劑、穩(wěn)定劑、染料和抗氧化劑還可以存在于乳劑中。藥物乳劑還可以是包含多于兩相的多重乳劑，諸如例如，在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳劑的情形中。這樣復(fù)合的制劑通常提供簡(jiǎn)單二元乳劑不能提供的某些優(yōu)點(diǎn)。其中o/w乳劑的單個(gè)油滴包含小水滴的多重乳劑構(gòu)成w/o/w乳劑。同樣地，在連續(xù)的油相中穩(wěn)定的包含在水珠中的油滴的系統(tǒng)提供o/w/o乳劑。乳劑特征在于幾乎沒(méi)有或沒(méi)有熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。通常，乳劑的分散或不連續(xù)相充分分散在外部或連續(xù)相中，并且通過(guò)乳化劑或制劑的粘度方式保持在這種形式中。乳劑的每一相可以是半固體或固體，如在乳劑類(lèi)型的油膏基質(zhì)和乳膏情形中。穩(wěn)定乳劑的其它方式需要使用乳化劑，所述乳化劑可以結(jié)合到乳劑的任一相中。乳化劑可以廣泛地分成四類(lèi)合成的表面活性劑，天然存在的乳化劑，吸收基質(zhì)和精細(xì)分散的固體(Idson,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman,Rieger禾口Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第199頁(yè))。合成的表面活性劑(surfactants),也叫作表面活性試劑，已經(jīng)在乳劑制劑中發(fā)現(xiàn)廣泛的應(yīng)用，并且已經(jīng)在文獻(xiàn)中評(píng)論(Rieger,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman,Rieger和Banker(Eds.)，1988,MarcelDekker,Inc.，紐約，紐約，第1巻，第285頁(yè)；Idson,在PharmaceuticalDosageForms(藥物齊ll型)中,Lieberman,Rieger禾口Banker(Eds.)，MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，1988，第1巻，第199頁(yè))。表面活性劑是典型地兩親性的，并且包括親水和疏水部分。表面活性劑親水與疏水性質(zhì)的比例叫作親水/親脂平衡(HLB)，并且是在制備制劑中分類(lèi)和選擇表面活性劑的有價(jià)值的工具。基于親水基團(tuán)的性質(zhì)，表面活性劑可以分類(lèi)為不同的種類(lèi)非離子型、陰離子型、陽(yáng)離子型和兩性的(Rieger,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman,Rieger禾口Banker(Eds.)，1988,MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第285頁(yè))。用于乳劑配制的天然存在的乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、磷脂酰膽堿和阿拉伯樹(shù)膠。吸收基質(zhì)具有親水性質(zhì)，以致它們可以吸收水形成w/o乳劑而保留它們的半固體一致性，諸如無(wú)水羊毛脂和親水礦脂。精細(xì)分開(kāi)的固體也用作良好的乳化劑，特別是與表面活性劑結(jié)合并且用在粘性制劑中。這些包括極性無(wú)機(jī)固體，諸如重金屬氫氧化物、不溶脹的粘土，諸如膨潤(rùn)土，綠坡縷石，水輝石，高嶺土，蒙脫石(mo血orillonite),膠體硅酸鋁和膠體硅酸鋁鎂，顏料和非極性固體，諸如碳或三硬脂酸甘油酯。多種非乳化物質(zhì)也包含在乳劑制劑中，并且構(gòu)成乳劑的特性。這些包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑、親水膠體、防腐劑和抗氧化劑(Block,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman,Rieger和Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第335頁(yè)；Idson,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman,Rieger和Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第199頁(yè))。親水膠體或水狀膠體包括天然存在的樹(shù)膠和合成的聚合物，諸如聚糖(例如，阿拉伯樹(shù)膠、瓊脂、褐藻酸、角叉藻聚糖、瓜耳膠、刺梧桐樹(shù)膠和西黃蓍膠)，纖維素衍生物(例如，羧甲基纖維素和羧丙基纖維素)，和合成的聚合物(例如，卡波姆，纖維素醚，和羧基乙烯基聚合物)。這些分散或膨脹在水中，形成膠體溶液，所述膠體溶液通過(guò)形成圍繞分散的相小滴的強(qiáng)界面薄膜和通過(guò)增加外相的粘度而穩(wěn)定乳劑。由于乳劑通常包含許多成分，諸如可以容易地支持微生物生長(zhǎng)的碳水化合物、蛋白質(zhì)、固醇和磷脂，這些制劑通常結(jié)合防腐劑。包含在乳劑制劑中通常所用的防腐劑包括羥苯甲酯，羥苯丙酯，季銨鹽，苯扎氯銨，對(duì)-羥基苯甲酸酯，和硼酸。通常也將抗氧化劑加入到乳劑制劑中，以防止制劑變質(zhì)。所用的抗氧化劑可以是游離自由基清除劑，諸如生育酚，烷基掊酸鹽，丁基化羥基苯甲醚，丁基化羥基甲苯，或還原劑，諸如抗壞血酸和焦亞硫酸氫鈉，和抗氧化劑增效劑，諸如檸檬酸，酒石酸和磷脂酰膽堿。乳劑制劑通過(guò)皮膚、口服和腸胃外途徑的應(yīng)用和它們的制備方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中綜述(Idson,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman,Rieger和Banker(Eds.)，1988,MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第199頁(yè))。由于配制容易、吸收有效和生物利用度的觀點(diǎn)的原因，用于口服遞送的乳劑制劑已經(jīng)非常廣泛地應(yīng)用。(Rosoff,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman,Rieger禾口Banker(Eds.),1988，MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第245頁(yè)；Idson，在PharmaceuticalDosageForms(藥物齊l(型)中，Lieberman,Rieger禾口Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.，紐約，紐約，第1巻，第199頁(yè))。礦物油基質(zhì)瀉藥、油溶維生素和高脂肪營(yíng)養(yǎng)制劑是通常作為oAv乳劑口服施用的物質(zhì)之一。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸類(lèi)似物配制成微乳。微乳可以定義為水、油和兩親性系統(tǒng)，其是單一光學(xué)各向同性的和熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的液體溶液(Rosoff,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第245頁(yè))。典型地，微乳是通過(guò)首先將油分散在表面活性劑水溶液中，然后加入足夠量的第四成分，通常是中等鏈長(zhǎng)度的醇，以形成透明系統(tǒng)而制備的系統(tǒng)。因此，微乳還被描述為兩種不可混溶的液體的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的、各向同性清澈的分散液，其通過(guò)表面活性分子的界面薄膜而穩(wěn)定(Leung禾口Shah，在ControlledReleaseofDrugs:PolymersandAggregateSystems(藥物的控制性釋放聚合物合聚集系統(tǒng))，Rosoff,M.,Ed.,1989，VCH出版社，紐約，第185-215頁(yè))。微乳通常通過(guò)將包括油、水、表面活性劑、輔助表面活性劑和電解質(zhì)的三到五種成分組合而制備。所述微乳是油包水(w/o)還是水包油(o/w)類(lèi)型取決于所用的油和表面活性劑的性質(zhì)，并且取決于表面活性劑分子的極性頭和烴尾的結(jié)構(gòu)和幾何學(xué)包裝(Schott，在Remington'sPharmaceuticalSciences(Remington藥物禾斗學(xué))中,Mack出版公司，Easton,Pa.,1985,第271頁(yè))。應(yīng)用相圖的現(xiàn)象學(xué)方法已經(jīng)得到廣泛研究，并且已經(jīng)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員產(chǎn)生怎樣配制微乳的全面知識(shí)(Rosoff，在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman，Rieger禾卩Banker(Eds.),1988,MarcelDekker，Inc.,紐約，紐約，第1巻，第245頁(yè)；Block,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，Lieberman,Rieger和Banker(Eds.)，1988，MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第335頁(yè))。與常規(guī)乳劑相比，微乳提供使水不溶性藥物溶解在自動(dòng)形成的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的小滴中的優(yōu)點(diǎn)。在制備微乳中所用的表面活性劑包括，但不限于，離子表面活性劑、非離子型表面活性劑、Brij96、聚氧乙烯油基醚，聚甘油脂肪酸酯，四甘油單月桂酸酯(ML310)，四甘油單油酸酯(MO310)，六甘油單油酸酯(PO310),六甘油五油酸酯(P0500),十甘油單癸酸酯(MCA750),十甘油單油酸酯(M0750)，decaglycerolsequioleate(SO750),十甘油十油酸酯(DAO750),單獨(dú)的或與輔助表面活性劑組合。所述輔助表面活性劑，通常是短鏈的醇，諸如乙醇、l-丙醇、和l-丁醇，作用為增加界面的流動(dòng)性，其通過(guò)滲透到表面活性劑膜中并且由于在表面活性劑分子中產(chǎn)生的空空間因此產(chǎn)生無(wú)序的薄膜而增加界面的流動(dòng)性。然而，微乳可以不使用輔助表面活性劑制備，并且不含醇的自我乳化的微乳系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的。水相典型地可以是，但不限于，水、藥物的水性溶液，甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙三醇、和乙二醇的衍生物。油相可以包括，但不限于，下述物質(zhì)諸如Captex300、Captex355、CapmulMCM、脂肪酸酯、中等鏈(C8-C12)的單、二和三-甘油酯、聚氧乙烯化甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、飽和的聚乙二醇化C8-C10甘油酯、植物油和硅油。從藥物溶解性和增強(qiáng)的藥物吸收的觀點(diǎn)來(lái)看，微乳特別令人感興趣。已經(jīng)提議基于脂質(zhì)的微乳(o/w和w/o)提高藥物的口服生物利用度，所述藥物包括肽(Constantinides等，PharmaceuticalResearch(藥學(xué)研究)，1994,11，1385-1390;Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.(實(shí)驗(yàn)臨床藥學(xué)方法和發(fā)現(xiàn))，1993,13，205)。由于表面活性劑誘導(dǎo)的膜流動(dòng)性和滲透性的改變，制備的容易性，固體劑型口服施用的容易性，提高的臨床功效，和減小的毒性(Constantinides等，PharmaceuticalResearch(藥學(xué)研究)，1994，11，1385;Ho等，J.Pharm.Sci.(藥學(xué)科學(xué)雜志),1996,85,138-143)，微乳提供提高的藥物溶解性、保護(hù)藥物免受酶水解、藥物吸收的可能的提高的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)它們的成分在環(huán)境溫度下混合在一起時(shí)，微乳通?？梢宰园l(fā)形成。當(dāng)配制不耐熱的藥物、肽或寡核苷酸時(shí)，這可能是特別有利的。微乳還在化妝品和藥物應(yīng)用中有效地透皮遞送活性成分。預(yù)計(jì)本發(fā)明的微乳組合物和制劑將促進(jìn)從胃腸道對(duì)寡核苷酸和核酸的增加的系統(tǒng)吸收，以及提高寡核苷酸和核酸在胃腸道、陰道、口腔和其它施用區(qū)域的局部細(xì)胞吸收。本發(fā)明的微乳還可以含有其它成分和添加劑，諸如失水山梨糖醇單硬脂酸酯(Gri13)、Labrasol，和滲透增強(qiáng)劑，以改善所述制劑的性質(zhì)，并且提高本發(fā)明的寡核苷酸和核酸的吸收。在本發(fā)明的微乳中所用的滲透增強(qiáng)劑可以分類(lèi)為屬于五大類(lèi)中的一種表面活性劑、脂肪酸、膽酸鹽、螯合劑、和非螯合非表面活性劑(Lee等，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems(治療藥物載體系統(tǒng)中的重要評(píng)述)，1991,第92頁(yè))。這些種類(lèi)的每一種已經(jīng)在上文討論。除了微乳之外，存在許多已經(jīng)研究過(guò)并且用于配制藥物的有序的表面活性劑結(jié)構(gòu)。這些包括單層、微團(tuán)、雙層和小泡。從藥物遞送觀點(diǎn)看來(lái)，小泡，諸如脂質(zhì)體，由于它們提供的它們的特異性和作用的持久性，已經(jīng)吸引了極大的興趣。當(dāng)用在本發(fā)明中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"脂質(zhì)體"意指由以球形雙層或多個(gè)雙層排列的兩親性脂質(zhì)組成的小泡。脂質(zhì)體是單層的或多層的小泡，其具有由親脂性物質(zhì)形成的膜和水性的內(nèi)部。所述水性部分包含要遞送的組合物。陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有能夠融合到細(xì)胞壁上的優(yōu)點(diǎn)。非陽(yáng)離子脂質(zhì)體，盡管不能有效地與細(xì)胞壁融合，但是在體內(nèi)被巨噬細(xì)胞吸收。為了穿過(guò)完整的哺乳動(dòng)物皮膚，在適當(dāng)?shù)耐钙ぬ荻鹊挠绊懴?，脂質(zhì)小泡必須通過(guò)一系列細(xì)小的孔，每個(gè)孔直徑小于50nm。因此，理想地使用高度可變形的并且能夠通過(guò)這樣的細(xì)孔的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的其它優(yōu)點(diǎn)包括從天然磷脂獲得的脂質(zhì)體是生物相容的和生物可降解的；脂質(zhì)體可以結(jié)合寬范圍的水和脂質(zhì)可溶的藥物；脂質(zhì)體可以保護(hù)包封在它們的內(nèi)部區(qū)室中的藥物免受代謝和降解(Rosoff,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中,Lieberman,Rieger禾口Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，第1巻，第245頁(yè))。在制備脂質(zhì)體制劑中的重要考慮是脂質(zhì)表面電荷、小泡大小和脂質(zhì)體的水性體積。脂質(zhì)體用于將活性成分轉(zhuǎn)移并且遞送到作用位點(diǎn)。由于脂質(zhì)體膜在結(jié)構(gòu)上與生物膜相似，故當(dāng)將脂質(zhì)體用于組織時(shí)，脂質(zhì)體開(kāi)始與細(xì)胞膜融合。當(dāng)脂質(zhì)體和細(xì)胞的融合發(fā)展時(shí)，脂質(zhì)體內(nèi)容物全部倒入活性劑可以作用的細(xì)胞中。脂質(zhì)體制劑己經(jīng)成為關(guān)于許多藥物的遞送模式的廣泛研究的焦點(diǎn)。存在增長(zhǎng)的證據(jù)表明，對(duì)于局部施用，脂質(zhì)體與其它制劑相比，存在一些優(yōu)點(diǎn)。這樣的優(yōu)點(diǎn)包括減少的與施用藥物的高系統(tǒng)吸收相關(guān)的副作用，增加的施用藥物在需要的靶點(diǎn)的積聚，和將寬泛種類(lèi)的藥物包括親水性的和疏水性的藥物施用到皮膚內(nèi)的能力。脂質(zhì)體分成兩大類(lèi)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，其與帶負(fù)電荷的DNA分子相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物。帶正電荷的DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物與帶負(fù)電荷細(xì)胞的表面結(jié)合，并且內(nèi)含在內(nèi)體中。由于在內(nèi)體中的酸性pH，脂質(zhì)體破裂，將它們的內(nèi)含物釋放到細(xì)胞質(zhì)中(Wang等,Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊)，1987,147,980-985)。pH-敏感性或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體捕獲DNA而不是與DNA復(fù)合。由于DNA和脂質(zhì)都帶相似的電荷，所以發(fā)生排斥而不是形成復(fù)合物。然而，一些DNA被捕獲在這些脂質(zhì)體的水性內(nèi)部。pH-敏感的脂質(zhì)體己經(jīng)用于將編碼胸苷激酶基因的DNA遞送到培養(yǎng)物的細(xì)胞單層中。在耙細(xì)胞中檢測(cè)到這些內(nèi)源基因的表達(dá)(Zhou等，JournalofControlledRelease(控制的釋放雜志)，1992,19,269-274)。除了天然來(lái)源的磷脂酰膽堿之外，一種主要類(lèi)型的脂質(zhì)體組合物包含磷脂。例如，中性脂質(zhì)體組合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)或二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)形成。陰離子脂質(zhì)體組合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而陰離子融合脂質(zhì)體主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一種類(lèi)型的脂質(zhì)體組合物由磷脂酰膽堿(PC)諸如例如大豆PC和卵PC形成。另一種類(lèi)型由磷脂和/或磷脂酰膽堿和/或膽固醇的混合物形成。已經(jīng)檢驗(yàn)了非離子型脂質(zhì)體系統(tǒng)，特別是包含非離子型表面活性劑和膽固醇的系統(tǒng)，以確定它們?cè)趯⑺幬镞f送到皮膚中的用途。包含novasomeTM.I(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)和Novasome.TM.II(甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非離子型脂質(zhì)體制劑用于將環(huán)孢素A遞送到小鼠皮膚的真皮中。結(jié)果表明，所述非離子型脂質(zhì)體系統(tǒng)有效促進(jìn)環(huán)孢素A在不同皮膚層中的沉積(Hu等.S.T.P.Pharma.Sci.(S.T.P.藥物科學(xué)〉,1994,4,6,466)。脂質(zhì)體還包括"空間穩(wěn)定的"脂質(zhì)體，其為當(dāng)用于本文時(shí)是指包含一種或多種專(zhuān)門(mén)的脂質(zhì)的脂質(zhì)體的術(shù)語(yǔ)，所述專(zhuān)門(mén)的脂質(zhì)當(dāng)結(jié)合到脂質(zhì)體中時(shí)引起相對(duì)于缺少這樣的專(zhuān)門(mén)的脂質(zhì)的脂質(zhì)體提高的循環(huán)壽命?？臻g穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實(shí)例是下述中的那些，其中脂質(zhì)體的部分小泡-形成脂質(zhì)部分(A)包含一種或多種糖脂，諸如單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂G.sub.Ml，或(B)是用一種或多種親水聚合物如聚乙二醇(PEG)部分衍生的。盡管不希望受到任何具體理論的束縛，但是在本領(lǐng)域中認(rèn)為，至少對(duì)于包含神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘磷脂或PEG-衍生的脂質(zhì)的空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體，這些空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體的提高的循環(huán)半衰期來(lái)源于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)細(xì)胞的減少的吸收(Allen等，F(xiàn)EBSLetters(FEBS通信),1987，223，42;Wu等，CancerResearch(癌癥研究),1993，53，3765)。包含一種或多種糖脂的各種脂質(zhì)體是本領(lǐng)域公知的。Papahadjopoulos等(Ann.N.Y.Acad.Sci.(紐約科學(xué)院年刊)，1987,507,64)報(bào)道了單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂Gsub.Ml、硫酸半乳糖腦苷脂和磷脂酰肌醇提高脂質(zhì)體的血液半衰期的能力。Gabizon等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，1988，85,6949)對(duì)這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了詳細(xì)闡釋。Allen等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,837,028和WO88/04924，公開(kāi)了包含(1)鞘磷脂和(2)神經(jīng)節(jié)苷脂G.sub.Ml或半乳糖腦苷脂硫酸酯的脂質(zhì)體。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,543,152(Webb等)公開(kāi)了包含鞘磷脂的脂質(zhì)體。WO97/13499(Lim等)中公開(kāi)了包含1，2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿的脂質(zhì)體。包含用一種或多種親水聚合物衍生的脂質(zhì)的許多脂質(zhì)體以及制備其的方法，在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。Sunamoto等(Bull.Chem.Soc.Jpn.(日本化學(xué)學(xué)會(huì)公告)，1980,53,2778)描述了包含含有PEG部分的非離子型去污劑2C,sub.1215G的脂質(zhì)體Jllum等(FEBSLett.(FEBS通信)，1984，167，79)注意到使用聚合的甘油親水性包被聚苯乙烯顆粒導(dǎo)致顯著提高的血液半衰期。Sears(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,426,330和4，534,899)描述了通過(guò)連接聚亞垸基二醇(例如，PEG)的羧基基團(tuán)而修飾合成的磷脂。Klibanov等(FEBSLett(FEBS通信)，1990，268，235)描述了證明包含用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂質(zhì)體在血液循環(huán)半衰期中有顯著提高的實(shí)驗(yàn)。Blume等(BiochimicaetBiophysicaActa，1990,1029,91)將這樣的觀察擴(kuò)大到其它PEG-衍生的磷脂，例如，DSPE-PEG，其由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG的組合形成。在其外表面具有共價(jià)結(jié)合的PEG部分的脂質(zhì)體在授予Fisher的歐洲專(zhuān)利號(hào)EP044531Bl和WO90/04384中描述。Woodle等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,013,556和5,356,633)和Martin等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,213,804和歐洲專(zhuān)利號(hào)EP0496813Bl)描述了包含1-20摩爾百分?jǐn)?shù)的用PEG衍生的PE的脂質(zhì)體組合物及其使用方法。包含許多其它脂質(zhì)-聚合物綴合物的脂質(zhì)體在WO91/05545和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,225,212(二者都授予Martin等)中和在WO94/20073(zalipsky等)中公開(kāi)。包含PEG-修飾的神經(jīng)酰胺脂質(zhì)的脂質(zhì)體在WO96/10391(Choi等)中描述。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，540，935(Miyazaki等)和5,556,948(Tagawa等)描述了含有PEG的脂質(zhì)體，其可以在其表面上用官能部分進(jìn)一步衍生。在本領(lǐng)域內(nèi)已知有限數(shù)量的含有核酸的脂質(zhì)體。Thierry等的WO96/40062公開(kāi)了將高分子量的核酸包封在脂質(zhì)體中的方法。Tagawa等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,264,221公開(kāi)了蛋白質(zhì)結(jié)合的脂質(zhì)體，并且斷言這樣的脂質(zhì)體的內(nèi)含物可以包括反義RNA。Rahman等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,665,710描述了將寡脫氧核苷酸包封在脂質(zhì)體中的方法。Love等的WO97/04787公開(kāi)了包含靶向raf基因的反義寡核苷酸的脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)運(yùn)體(transfersome)是另一種類(lèi)型的脂質(zhì)體，并且是高度可變形的脂質(zhì)聚集物，其是引人注意的用于藥物遞送賦形劑的候選物。轉(zhuǎn)運(yùn)體可以描述為脂質(zhì)小滴，其高度可變形，以致它們能夠容易地透過(guò)比所述小滴小的孔。轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠適應(yīng)它們應(yīng)用的環(huán)境，例如，它們自我-最優(yōu)化(適合皮膚中孔的形狀)，自我修復(fù)，通常沒(méi)有斷裂地到達(dá)它們的靶點(diǎn)，并且通常自我-負(fù)荷。為了制備轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以將表面邊緣-激活劑，通常是表面活性劑加入到標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體組合物中。轉(zhuǎn)運(yùn)體已經(jīng)用于將血清白蛋白遞送到皮膚。已經(jīng)表明轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的血清白蛋白的遞送如皮下注射含有血清白蛋白的溶液一樣有效。表面活性劑在制劑如乳劑(包括微乳)和脂質(zhì)體中有廣泛的應(yīng)用。分類(lèi)并且排列天然的和合成的許多不同類(lèi)型的表面活性劑的性質(zhì)的最常用的方法是應(yīng)用親水性/親脂性平衡(HLB)。親水性基團(tuán)(也叫作"頭")的性質(zhì)提供將制劑中所用的不同表面活性劑分類(lèi)的最有用的方式(Rieger,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，MarcelDekker，Inc.，紐約，紐約，1988,第285頁(yè))。如果表面活性劑分子不是離子化的，那么將它分類(lèi)為非離子型表面活性劑。非離子型表面活性劑在藥物和化妝品產(chǎn)品中有廣泛的應(yīng)用，并且適用于寬范圍的pH值。通常，它們的HLB值在2到約18之間，這取決于它們的結(jié)構(gòu)。非離子型表面活性劑包括非離子型酯，諸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、失水山梨糖醇酯、蔗糖酯和乙氧基化的酯。非離子型鏈垸醇酰胺和醚，諸如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包含在這一類(lèi)中。聚氧乙烯表面活性劑是非離子型表面活性劑種類(lèi)中最常見(jiàn)的成員。如果當(dāng)它溶解或分散在水中時(shí)表面活性劑分子攜帶負(fù)電荷，那么將所述表面活性劑分為陰離子型。陰離子表面活性劑包括羧酸鹽，如皂、酰基乳酸酯(acyllactylate)、氨基酸的?；０?，硫酸的酯，如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸酯，如垸基苯磺酸酯、?；u乙基磺酸酯、?；；撬狨ズ突腔晁狨?，以及磷酸酯。陰離子表面活性劑種類(lèi)中最重要的成員是烷基硫酸酯和皂。如果當(dāng)它溶解或分散在水中時(shí)表面活性劑分子攜帶正電荷，那么將所述表面活性劑分為陽(yáng)離子型。陽(yáng)離子表面活性劑包括季銨鹽和乙氧基化胺。季銨鹽是這一種類(lèi)中最常用的成員。如果表面活性劑分子具有攜帶正電荷或負(fù)電荷的能力，那么將所述表面活性劑分為兩性型。兩性表面活性劑包括丙烯酸衍生物、取代的垸基酰胺、N-垸基甜菜堿和磷酯。己經(jīng)綜述了表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳劑中的應(yīng)用(Rieger,在PharmaceuticalDosageForms(藥物劑型)中，MarcelDekker,Inc.,紐約，紐約，1988，第285頁(yè))。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以配制成包含溶解在非水性溶劑中的化合物的藥用組合物，所述非水性溶劑包括甘油、丙二醇、聚乙二醇或它們的組合。據(jù)信所述化合物在這樣的藥物制劑中是穩(wěn)定的，以致所述藥物制劑可以在使用之前儲(chǔ)存延長(zhǎng)的時(shí)間階段。在目前使用地西他濱的臨床治療中，為了將藥物分解減小到最小，地西他濱以凍干的散劑提供，并且在含有溶劑如WFI的至少40%體積的水的冰冷的水性溶液中重構(gòu)，并且在施用前稀釋在冰冷的輸注流體中。這樣的制劑和治療方案遭受一些缺陷。首先，將地西他濱冷凍在冰冷的溶液中變得重要，與可以在更高溫度保持儲(chǔ)存的制劑相比，這在處理上是繁瑣的，并且在經(jīng)濟(jì)上更不理想。其次，由于地西他濱在水性溶液中快速分解，如果溶液已經(jīng)在冰箱中保存了不到7小時(shí)，重構(gòu)的地西他濱溶液只可以持續(xù)最多3小時(shí)輸注給患者。另外，冰冷流體的輸注可能對(duì)患者帶來(lái)更大的不適和疼痛，這誘導(dǎo)了患者對(duì)這樣的治療方案的抵觸性。通過(guò)修飾地西他濱的三嗪環(huán)和/或核糖環(huán)，并且用非水性溶劑配制所述化合物，藥物制劑可以克服上文列出的與目前使用地西他濱的臨床治療相關(guān)的問(wèn)題。據(jù)信，本發(fā)明化合物的這些制劑比在含有溶劑的至少40%體積的水的水性溶液中配制的地西他濱在化學(xué)上更加穩(wěn)定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑含有在溶劑中少于40%的水，任選地在溶劑中少于20%的水，任選地在溶劑中少于10%的水，或任選地在溶劑中少于1%的水。在一種變化中，所述藥物制劑以基本上無(wú)水的形式儲(chǔ)存。任選地，可以將干燥劑加入到所述藥物制劑中以吸收水分。由于提高的穩(wěn)定性，本發(fā)明的制劑可以在環(huán)境溫度下保存和運(yùn)輸，由此顯著減少處理所述藥物的成本。此外，本發(fā)明的制劑可以在施用給患者之前便利地長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。另外，本發(fā)明的制劑可以用常規(guī)輸注流體稀釋(無(wú)需冷凍)，并且在室溫下施用給患者，由此避免給患者帶來(lái)與冰冷流體的輸注相關(guān)的不適。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的化合物以不同濃度溶解在甘油中。例如，所述制劑可以任選地在每ml甘油中包含0.1到200之間；1到100之間；l到50之間；2到50之間；2至(Jl00之間；5妾ljl00之間；10到100之間或20到100mg之間的本發(fā)明化合物。每甘油濃度的本發(fā)明化合物的具體實(shí)例包括但不限于2,5，10,20,22,25,30,40和50mg/ml。不同等級(jí)的甘油(glycerin)(同義詞1,2，3-丙三醇；甘油(glycerol);乙二醇(glycolalcohol);無(wú)水甘油)可以用于制備所述制劑。優(yōu)選地，使用具有高于90%化學(xué)純度的甘油配制所述制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的化合物以不同濃度溶解在丙二醇中。例如，所述制劑可以任選地在每ml丙二醇中包含O.l到200之間；0,1到100之間；0.1到50之間；2到50之間；2到100之間;5到100之間；10到100之間或20到100mg之間的本發(fā)明化合物。每丙二醇濃度的地西他濱的具體實(shí)例包括但不限于2，5,10,20,22,25,30,40和50rng/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明化合物以不同濃度溶解在結(jié)合甘油和丙二醇的溶劑中。丙二醇在溶劑中的濃度是在0.1-99.9%，任選地在1-卯％，10-80%，或50-70%之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明化合物以不同濃度溶解在結(jié)合甘油和聚乙二醇(PEG)如PEG300、PEG400和PEG1000的溶劑中。聚乙二醇在溶劑中的濃度是在0.1-99.9%，任選地在1-90%，10-80%，或50-70°/。之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的化合物以不同濃度溶解在結(jié)合丙二醇、聚乙二醇和甘油的溶劑中。聚乙二醇在溶劑中的濃度是在0.1-99.9%，任選地在1-90%，10-60%，或20-40%之間；并且聚乙二醇在溶劑中的濃度是在0.1-99.9%，任選地在1-90%，10-80%，或50-70%之間。據(jù)信并且實(shí)驗(yàn)證明，加入丙二醇可以進(jìn)一步提高化學(xué)穩(wěn)定性，減小制劑的粘性，并且促進(jìn)本發(fā)明的化合物在溶劑中的溶解。所述藥物制劑可以進(jìn)一步包含以這樣的比例加入到所述制劑中的酸化劑，以致所述制劑具有獲得的在約4和8之間的pH。所述酸化劑可以是有機(jī)酸。有機(jī)酸的實(shí)例包括，但不限于，抗壞血酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、草酸、甲酸、苯磺酸、苯甲酸、馬來(lái)酸、谷氨酸、琥珀酸、天冬氨酸、diatrizoicacid和乙酸。酸化劑還可以是無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、硫酸、磷酸和硝酸。據(jù)信，向所述制劑中加入酸化劑保持相對(duì)中性的pH(例如，在pH4-8內(nèi))促進(jìn)本發(fā)明的化合物迅速溶解在溶劑中，并且提高所述制劑的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。在堿性溶液中，存在地西他濱快速可逆的分解成N-(甲酰脒基)-N'-(3-D-2-脫氧呋喃核糖基脲，其不可逆地分解形成l-(3-D-2'-脫氧呋喃核糖基-3-脒基脲。第一階段的水解降解包括形成N-amidinium-N'-(2-脫氧-卩-D-赤呋喃戊糖基)脲甲酸酯(AUF)。在升高溫度下的第二階段的降解包括胍的形成。在酸性溶液中，形成N-(甲酰脒基)-N'-(3-D-2-脫氧呋喃核糖基脲和一些未鑒定的化合物。在強(qiáng)酸性溶液中(在pH〈.2)，生成5-氮雜胞嘧啶。因此，對(duì)于包含地西他濱的類(lèi)似物和衍生物的制劑，保持相對(duì)中性的pH可以是有利的。在一種變化中，所述酸化劑是抗壞血酸，其濃度為溶劑的0.01-0.2mg/ml，任選地為溶劑的0.04-0.1mg/ml或0.03-0.07mg/ml。藥物制劑的pH可以調(diào)整在pH4和pH8之間，優(yōu)選地在pH5和pH7之間，和更優(yōu)選地在pH5.5和pH6.8之間。當(dāng)在25"C儲(chǔ)存7天、14天、21天、28天或更多天時(shí)，所述藥物制劑優(yōu)選地至少80%、90%、95。/?；蚋臃€(wěn)定。當(dāng)在40。C儲(chǔ)存7天、14天、21天、28天或更多天時(shí)，所述藥物制劑還優(yōu)選地至少80%、90%、95%或更加穩(wěn)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑通過(guò)采用甘油并且將本發(fā)明的化合物溶解在甘油中而制備。例如，這可以通過(guò)將本發(fā)明的化合物加入到甘油中或者通過(guò)將甘油加入到地西他濱中而進(jìn)行。通過(guò)它們的混合，形成藥物制劑。任選地，所述方法還包括增加本發(fā)明的化合物被甘油溶解的比率的額外的步驟。可以進(jìn)行的額外步驟的實(shí)例包括，但不限于，攪拌、加熱、延長(zhǎng)溶解時(shí)間、和應(yīng)用微粉化的本發(fā)明的化合物以及它們的組合。在一種變化中，應(yīng)用攪拌。攪拌的實(shí)例包括但不限于，機(jī)械攪拌、超聲處理、常規(guī)混合、常規(guī)攪拌和它們的組合。例如，按照供應(yīng)商的流程，通過(guò)由SilversonMachines公司(EastLongmeadow，MA)制造的勻漿器，可以進(jìn)行制劑的機(jī)械攪拌。在另一種變化中，可以應(yīng)用加熱。任選地，制劑可以在水浴中加熱。優(yōu)選地，加熱的制劑的溫度可以低于7(TC，更優(yōu)選地，在25。C和40。C之間。例如，制劑可以加熱到37匸。在另一種變化中，本發(fā)明的化合物在延長(zhǎng)的時(shí)間期間溶解在甘油中。在另一種變化中，還可以應(yīng)用本發(fā)明化合物的微粉化形式，以提高溶解動(dòng)力學(xué)。任選地，微粉化可以通過(guò)碾磨方法進(jìn)行。例如，微粉化可以通過(guò)使用IncFluidEnergyAljet公司(Boise，IDTelford，PA)制造的噴氣式(AirJet)磨粉機(jī)進(jìn)行粒度分析碾磨加工而進(jìn)行。任選地，所述方法還包括通過(guò)常規(guī)所用的方法調(diào)整藥物制劑的pH。在一種變化中，pH通過(guò)加入酸如抗壞血酸，或者加入堿如氫氧化鈉進(jìn)行調(diào)整。在另一種變化中，pH通過(guò)加入緩沖溶液如(亞乙基二次氮基)四乙酸二鈉鹽(EDTA)溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)和穩(wěn)定。由于已知地西他濱是pH-敏感的，所以將藥物制劑的pH調(diào)整到接近pH7可以提高治療成分的穩(wěn)定性。任選地，所述方法還包括從藥物制劑分離不溶解的本發(fā)明的化合物。分離可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)行。例如，一種適當(dāng)?shù)姆蛛x方法可以包括藥物制劑的一次或多次過(guò)濾、沉淀和離心?？赡苁怯杀景l(fā)明化合物的不溶顆粒引起的堵塞(Clogging),可能成為施用所述藥物制劑的障礙和對(duì)于患者潛在的危險(xiǎn)。將不溶解的本發(fā)明化合物從藥物制劑中分離可以促進(jìn)施用，并且提高治療產(chǎn)品的安全性。任選地，所述方法還包括將藥物制劑滅菌。滅菌可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)進(jìn)行。例如，適當(dāng)?shù)臏缇椒梢园ㄒ淮位蚨啻螣o(wú)菌過(guò)濾、化學(xué)處理、照射、加熱和向藥物制劑中加入化學(xué)消毒劑。如注意到的，地西他濱在水中不穩(wěn)定，并且因此可以理想地減少用于配制本發(fā)明的化合物的甘油的水含量。因此，在溶解和/或滅菌步驟之前，可以將甘油干燥。甘油或本發(fā)明的化合物在甘油中的溶液的這樣的干燥可以通過(guò)向甘油中加入藥用干燥劑而實(shí)現(xiàn)。例如，甘油或本發(fā)明的制劑可以通過(guò)含有干燥劑的層過(guò)濾而進(jìn)行干燥。任選地，所述方法還可以包括加入一種或多種選自下列各項(xiàng)的組的成員干燥劑、緩沖劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、抗微生物劑和藥物惰性劑。在一種變化中，可以加入抗氧化劑，如抗壞血酸、抗壞血酸鹽及其混合物。在另一種變化中，可以加入穩(wěn)定劑，如二醇。3.包含本發(fā)明的化合物或制劑的容器或試劑盒在本發(fā)明中所述的藥物制劑，可以包含在無(wú)菌容器中，如各種大小和容量的注射器、小瓶或安瓿。所述無(wú)菌容器可以任選地容納1-50ml,1-25ml或1-20ml或1-10ml的制劑。無(wú)菌容器保持藥物制劑的無(wú)菌性，促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存，并且允許無(wú)需在前的滅菌步驟而施用所述藥物制劑。本發(fā)明還提供將本發(fā)明的化合物施用給需要其的宿主的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含以固體，優(yōu)選散劑形式的本發(fā)明的化合物和非水性稀釋劑，所述非水性稀釋劑包含甘油、丙二醇、聚乙二醇或它們的組合。將固體地西他濱和稀釋劑混合優(yōu)選地導(dǎo)致按照本發(fā)明的藥物制劑的形成。例如，所述試劑盒可以包括第一容器，其包含以固體形式的本發(fā)明的化合物；和容器集裝器"essdcontainer),其包含含有甘油的稀釋劑；其中將所述稀釋劑加入到固體的本發(fā)明的化合物中導(dǎo)致形成用于施用本發(fā)明的化合物的藥物制劑。將所述固體的本發(fā)明的化合物與稀釋劑混合可以任選地形成每ml稀釋劑含有0.1和200mg之間的本發(fā)明化合物，任選地每ml溶劑含有0.1禾卩100mg之間，2mg禾卩50mg之間，5mg禾口30mg之間，10mg和25mg之間的本發(fā)明化合物的藥物制劑。按照本實(shí)施方案，所述稀釋劑是丙二醇和甘油的組合，其中丙二醇在溶劑中的濃度在0.1-99.9%,任選地1-90%,10-60%,或20-40%之間。還按照本實(shí)施方案，所述稀釋劑是聚乙二醇和甘油的組合，其中聚乙二醇在溶劑中的濃度在0.1-99.9%,任選地1-90%，10-60%,或20畫(huà)40%之間。還按照本實(shí)施方案，所述稀釋劑是丙二醇、聚乙二醇和甘油的組合，其中丙二醇在溶劑中的濃度在0.1-99.9%,任選地1-90%，10-60%,或20-40%之間；并且聚乙二醇在溶劑中的濃度在0.1-99.9%,任選地1-90%,10-60%，或20-40%之間。所述稀釋劑還任選地包含40%,20%,10%,5%,2%或更少的水。在一種變化中，所述稀釋劑是無(wú)水的，并且可以任選地進(jìn)一步包含干燥劑。所述稀釋劑還可以任選地包含一種或多種干燥劑、二醇、抗氧化劑和/或抗所述試劑盒可以任選地包括使用說(shuō)明。使用說(shuō)明可以描述固體的本發(fā)明化合物和所述稀釋劑應(yīng)該怎樣混合才能形成藥物制劑。使用說(shuō)明還可以描述怎樣將形成的藥物制劑施用給患者。應(yīng)該注意到，使用說(shuō)明可以任選地描述按照本發(fā)明的施用方法。所述稀釋劑和本發(fā)明的化合物可以容納在分開(kāi)的容器中。所述容器可以是不同的大小。例如，所述容器可以包含1和50之間，l和25之間，1和20之間，或1和10ml之間的稀釋劑。在容器或試劑盒中提供的藥物制劑可以以適合直接施用的形式，或者可以以濃縮的形式存在，相對(duì)于施用給患者的形式，所述濃縮的形式需要稀釋。例如，本發(fā)明所述的藥物制劑可以以適合通過(guò)輸注直接施用的形式存在。本文所述的方法和試劑盒提供靈活性，其中包含本發(fā)明化合物的藥物制劑的穩(wěn)定性和治療作用可以進(jìn)一步增強(qiáng)或補(bǔ)充。4.施用本發(fā)明的化合物/組合物的方法本發(fā)明的化合物/制劑可以通過(guò)任何途徑施用，優(yōu)選地以適合這樣的途徑的藥物組合物形式進(jìn)行施用，如下文舉例說(shuō)明，并且取決于治療的病況。例如，化合物或制劑可以口服、腸胃外、局部、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、透皮、舌下、肌內(nèi)、直腸、穿過(guò)口腔、鼻內(nèi)、脂質(zhì)體、通過(guò)吸入、陰道、眼內(nèi)、通過(guò)局部遞送(例如通過(guò)導(dǎo)管或斯滕特印模)、皮下、脂肪內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、或鞘內(nèi)施用。按照本發(fā)明的化合物和/或組合物還可以以緩慢釋放劑型進(jìn)行施用或共同施用。按照本發(fā)明的化合物和/或組合物還可以以任何常規(guī)劑型進(jìn)行施用或共同施用。在本
發(fā)明內(nèi)容中，共同施用定義意指在協(xié)調(diào)的治療療程中施用多于一種的治療劑，以獲得改善的臨床結(jié)果。這樣的共同施用還可以是同延的(coextensive),目P，在重疊的時(shí)間階段內(nèi)發(fā)生。本發(fā)明的化合物或含有本發(fā)明化合物的組合物可以以0.1-1000mg/m2，任選地1-200mg/m，任選地1-50mg/m，任選地1-40mg/m2，任選地1-30mg/m2，任選地1-20mg/m2，或任選地5-30mg/m2的劑量施用給宿主如患者。例如，本發(fā)明的化合物/組合物可以提供為用于注射的無(wú)菌散劑，與緩沖鹽如二氫鉀和pH調(diào)節(jié)劑如氫氧化鈉一起提供。這種制劑優(yōu)選地保存在28"C,其應(yīng)該保持所述藥物穩(wěn)定至少2年。這種散劑制劑可以用10ml無(wú)菌水重構(gòu)用于注射。這種溶液可以用本領(lǐng)域已知的輸注流體如0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖(dextrose)注射液和乳酸化的ringer's注射液(lactatedringer'sinjection)進(jìn)一步稀釋。優(yōu)選地，重構(gòu)和稀釋的溶液應(yīng)該在4-6小時(shí)內(nèi)應(yīng)用，以獲得最大功效的遞送。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物/組合物通過(guò)注射施用給患者，諸如皮下注射、推注(bolus)靜脈內(nèi)注射、連續(xù)靜脈內(nèi)注射和超過(guò)1小時(shí)的靜脈內(nèi)輸注。任選地，本發(fā)明的化合物/組合物通過(guò)每天1-24小時(shí)的靜脈內(nèi)輸注施用給患者，每個(gè)治療周期3-5天，以每天0.1-1000mg/m2的劑量，任選地以每天1-100mg/m2的劑量，任選地以每天2-50mg/n^的劑量，任選地以每天10-30mg/m2的劑量，或任選地以每天5-20mg/r^的劑量進(jìn)行施用。對(duì)于地西他濱或阿扎胞苷，認(rèn)為低于50mg/n^的劑量比在癌癥的常規(guī)化學(xué)治療中所用的劑量低得多。通過(guò)應(yīng)用這樣低劑量的地西他濱或阿扎胞苷的類(lèi)似物/衍生物，癌細(xì)胞中通過(guò)異常甲基化作用而沉默的基因的轉(zhuǎn)錄活性可以被激活，以引發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，分化和程序性細(xì)胞死亡，其最終導(dǎo)致這些癌細(xì)胞的死亡。然而，這種低劑量應(yīng)該對(duì)正常細(xì)胞具有很少的系統(tǒng)細(xì)胞毒性作用，并且因此對(duì)治療的患者具有更少的副作用。所述藥物制劑可以以任何常規(guī)形式與一種或多種選自包含下列各項(xiàng)的組的成員共同施用輸注流體、治療化合物、營(yíng)養(yǎng)流體、抗微生物流體、緩沖劑和穩(wěn)定劑。如上文所述，本發(fā)明化合物通過(guò)將本發(fā)明化合物溶解在非水性溶劑如甘油中而配制成液體形式。所述藥物液體制劑提供可以直接施用(例如，無(wú)需進(jìn)一步稀釋)的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)，并且可以以穩(wěn)定形式保存到施用時(shí)。此外，由于甘油可以容易地與水混合，所以所述制劑可以恰好在施用之前容易地和快速地進(jìn)行進(jìn)一步稀釋。例如，所述藥物制劑可以在施用給患者之前180，60,40,30，20,10，5,2，1分鐘或更短的時(shí)間稀釋在水中?；颊呖梢造o脈內(nèi)接受所述藥物制劑。優(yōu)選的施用途徑是通過(guò)靜脈內(nèi)輸注。任選地，本發(fā)明的藥物制劑可以直接輸注，無(wú)需提前重構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑通過(guò)連接器輸注，諸如Y形位點(diǎn)連接器，其具有三個(gè)臂，每個(gè)臂連接一個(gè)管。例如，可以使用各種大小的BaxterY-連接器。將容納所述藥物制劑的容器附著到管上，所述管還附著到連接器的一個(gè)臂上。輸注流體，諸如0.9°/。氯化鈉、或5%右旋糖(dextrose)、或5%葡萄糖(glucose)、或乳酸化的Ringer's，通過(guò)附著到Y(jié)型位點(diǎn)連接器的另一個(gè)臂上的管輸注。輸注的流體和藥物制劑在Y型位點(diǎn)連接器內(nèi)混合。將得到的混合物通過(guò)與Y型位點(diǎn)連接器的第三個(gè)臂連接的管輸注給患者。這種施用方法比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的化合物在進(jìn)入患者體內(nèi)之前與輸注流體混合，因此減少了可能由于與水接觸而發(fā)生的本發(fā)明化合物的分解的時(shí)間。例如，本發(fā)明的化合物在進(jìn)入患者體內(nèi)之前不到10，5，2或1分鐘混合。由于制劑提高的穩(wěn)定性，患者可以用所述藥物制劑輸注1,2,3,4，5或更多小時(shí)。延長(zhǎng)的輸注時(shí)間能夠制定靈活的施用治療制劑的時(shí)間表。備選地或另外，輸注的速度和體積可以按照患者的需要進(jìn)行調(diào)控。藥物制劑輸注的調(diào)控可以按照現(xiàn)有流程進(jìn)行。所述藥物制劑可以以任何常規(guī)形式與一種或多種選自包括下列各項(xiàng)的組的成員一起共同輸注輸注流體、治療化合物、營(yíng)養(yǎng)流體、抗微生物劑流體、緩沖劑和穩(wěn)定劑。任選地，治療成分可以與本發(fā)明的制劑共同輸注，所述治療成分包括但不限于，抗腫瘤形成劑、烷化劑、是類(lèi)視黃醇超家族成員的藥劑、抗生素藥劑、激素藥劑、植物來(lái)源的藥劑、生物藥劑、白介素、干擾素、細(xì)胞因子、免疫調(diào)控劑和單克隆抗體。在本
發(fā)明內(nèi)容中，共同輸注定義意指在協(xié)調(diào)的治療療程中輸注多于一種的治療劑，以獲得改善的臨床結(jié)果。這樣的共同輸注還可以是同時(shí)的、重疊的、或順序的。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述藥物制劑和輸注流體的共同輸注可以通過(guò)Y型連接器進(jìn)行。靜脈內(nèi)施用的藥物制劑的藥物動(dòng)力學(xué)和代謝與靜脈內(nèi)施用的本發(fā)明化合物的藥物動(dòng)力學(xué)和代謝相似。在人類(lèi)中，當(dāng)通過(guò)生物測(cè)定測(cè)量時(shí)，地西他濱表現(xiàn)出具有7分鐘的半衰期和近似于10-35分鐘的終止半衰期的分布期。分布的體積約4.6L/kg。短的血槳半衰期是由于肝臟胞苷脫氨酶通過(guò)脫氨基作用對(duì)地西他濱的快速滅活而導(dǎo)致。在人類(lèi)中的清除是高的，近似于126mL/min/kg。在總共5名患者中在血漿曲線下的平均面積是408pg/h/L，具有2.01的峰值血漿濃度。在患者中，當(dāng)以100mg/n^輸注3小時(shí)進(jìn)行施用時(shí)，地西他濱濃度約0.4(ig/ml(2pM)。在更長(zhǎng)的輸注時(shí)間(達(dá)到40小時(shí))，血漿濃度約為0.1到0.4iig/mL。使用40-60小時(shí)的輸注時(shí)間，以1mg/kg/h的輸注速率，獲得0.43-0.76嗎/mL的血漿濃度。在1mg/kg/h輸注速率的穩(wěn)定態(tài)血漿濃度估計(jì)為0.2-0.5嗎/mL。中斷輸注后的半衰期是12-20分鐘。在100mg/n^輸注6小時(shí)過(guò)程中，地西他濱的穩(wěn)定態(tài)血漿濃度估計(jì)為0.31-0.39(ig/mL。在600mg/m2輸注過(guò)程中的濃度范圍是0.41-16jig/mL。在36小時(shí)靜脈內(nèi)輸注結(jié)束時(shí)，地西他濱滲透進(jìn)入人的腦脊液達(dá)到14-21%的血漿濃度。未改變的地西他濱的尿排泄很低，在小于總劑量的0.01%到0.9%的范圍，并且在排泄和給藥或血漿藥物水平之間不存在聯(lián)系。高清除值和小于所施用劑量的1。/。的總尿排泄表明，地西他濱快速并且主要通過(guò)代謝過(guò)程而消除。由于與地西他濱相比它們具有提高的穩(wěn)定性，當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)，本發(fā)明的化合物/組合物可以享有更長(zhǎng)的保存限期，并且避開(kāi)了與地西他濱的臨床應(yīng)用相關(guān)的問(wèn)題。例如，本發(fā)明的化合物可以提供為凍干的散劑，任選地具有賦形劑(例如，環(huán)糊精)、酸(例如，抗壞血酸)、堿(氫氧化鈉)或緩沖鹽(一堿價(jià)磷酸二氫鉀)。所述凍干的散劑可以用無(wú)菌水重構(gòu)用于注射，例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下。任選地，所述散劑可以用水性或非水性溶劑重構(gòu)，所述水性或非水性溶劑包括與水混溶的溶劑，如甘油、丙二醇、乙醇和PEG。得到的溶液可以直接施用給患者，或者用輸注流體諸如0.9%氯化鈉;5%右旋糖(dextrose);5%葡萄糖(glucose);和乳酸化的Ringer's輸注流體進(jìn)一步稀釋。本發(fā)明的化合物/組合物可以在環(huán)境條件下或在控制的環(huán)境中如在冷凍(2-8°C;36-46下)下保存。由于與地西他濱相比它們優(yōu)越的穩(wěn)定性，本發(fā)明的化合物/組合物可以在室溫下保存，用注射流體重構(gòu)，并且無(wú)需預(yù)先冷卻所述藥物溶液而施用給患者。另外，由于它們提高的化學(xué)穩(wěn)定性，與地西他濱的血漿半衰期相比，本發(fā)明的化合物/組合物應(yīng)該具有更長(zhǎng)的血漿半衰期。因此，本發(fā)明的化合物/組合物可以以比地西他濱更低的劑量和/或更低的頻率施用給患者。5.使用本發(fā)明的藥物組合物的組合治療本發(fā)明的化合物或藥物制劑可以與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)的抑制劑聯(lián)合使用，從而以協(xié)同方式進(jìn)一步調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，例如，重建通過(guò)組蛋白的高甲基化作用和乙酰化作用而沉默的基因的轉(zhuǎn)錄。HDAC在基因的轉(zhuǎn)錄沉默中起重要作用。組蛋白上乙酰化的量通過(guò)兩種類(lèi)型的酶，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白脫乙酰酶(HDACs)的相反的活性而得到控制。這些酶的底物包括位于組蛋白H3,H4,H2A禾BH2B的氨基端尾部的賴氨酸殘基的s-氨基基團(tuán)。這些氨基酸殘基通過(guò)HATs被乙酰化，并且通過(guò)HDACs脫乙酰化。通過(guò)由HDACs從組蛋白賴氨酸上去除乙?；鶊F(tuán)，賴氨酸殘基恢復(fù)正電荷，由此核小體的結(jié)構(gòu)更緊密，并且使核小體內(nèi)包含的基因沉默。因此，為了激活這些被組蛋白的脫乙酰酶沉默的基因，應(yīng)該抑制HADCs的活性。當(dāng)抑制HDAC時(shí)，組蛋白被乙酰化，并且緊密纏繞在脫乙?；慕M蛋白核心周?chē)腄NA松弛。DNA構(gòu)象的開(kāi)放導(dǎo)致特異性基因的表達(dá)。除了組蛋白的脫乙酰化(deacelation)，HDACs還可以通過(guò)將轉(zhuǎn)錄因子如p53(月中瘤抑制基因),GATA-l,TFIIE和TFIIF脫乙酰而調(diào)控基因表達(dá)。Gu和Roeder(1997)Cell(細(xì)胞)90:595-606(p53);和Boyes等(1998)Nature(自然)396:594-598(GATA-1)。HDACs還參與細(xì)胞周期調(diào)控，例如，通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制作用參與，其受補(bǔ)充HDACs的RB腫瘤抑制蛋白調(diào)控。Brehm等(1998)Nature(自然)391:597-601。因此，HDACs的抑制應(yīng)該激活腫瘤抑制基因如p53和RB的表達(dá)，并且結(jié)果促進(jìn)由這些基因誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、分化和程序性細(xì)胞死亡。如上文所述，許多基因如腫瘤抑制基因的異常轉(zhuǎn)錄沉默，直接與癌癥和其它疾病的發(fā)病機(jī)理相關(guān)。DNA中胞嘧啶殘基的甲基化和從組蛋白去除乙酰基團(tuán)，是基因沉默的兩種主要的機(jī)制。由于癌癥相關(guān)的基因的甲基化和/或組蛋白脫乙酰酶作用，這些基因的表達(dá)受到抑制或完全沉默。同時(shí)，這些基因的表達(dá)是誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯、分化和/或凋亡性細(xì)胞死亡所必需的。在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中使這些基因失活導(dǎo)致這些細(xì)胞的不受控制的增殖，其最終導(dǎo)致癌癥。通過(guò)將本發(fā)明的化合物/組合物與HDAC抑制劑結(jié)合，可以有效地重新激活誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、分化和細(xì)胞死亡所需要的基因。本發(fā)明的化合物/組合物抑制基因DNA甲基化，特別是在調(diào)控區(qū)的甲基化，因此導(dǎo)致所述基因轉(zhuǎn)錄的激活。同時(shí)，HDAC抑制劑抑制在所述基因的核小體核心中的組蛋白的脫乙酰酶，因此導(dǎo)致組蛋白乙?；膬粼黾?，其又激活所述基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)研究這兩種互補(bǔ)的機(jī)制，組合治療可以更有效地并且理想地以協(xié)同方式重建基因的轉(zhuǎn)錄。具有協(xié)同作用的組合治療應(yīng)該比單獨(dú)使用需要更少量的每種抑制劑，因此減少與抑制劑的高劑量系統(tǒng)施用相關(guān)的潛在的副作用，并且改善提高治療指數(shù)。許多抗癌劑通過(guò)引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)而實(shí)施它們的抗癌作用，所述信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)包括由這些腫瘤抑制基因編碼的蛋白。由于這些基因在癌細(xì)胞中的不充分表達(dá)，這些抗腫瘤藥劑的抗癌作用可以嚴(yán)重減小或完全消除。通過(guò)被DNA甲基化作用和組蛋白,脫乙酰酶表觀遺傳(epigenetically)沉默的這些基因的重新激活或重新表達(dá)，機(jī)體的內(nèi)在防御機(jī)制動(dòng)員起來(lái)，通過(guò)應(yīng)答由所施用的抗癌劑傳遞的信號(hào)而恢復(fù)對(duì)癌細(xì)胞的腫瘤抑制功能，從而抵抗所述疾病。機(jī)體內(nèi)在的腫瘤抑制功能的這樣的刺激應(yīng)該導(dǎo)致需要更低劑量的抗癌劑，因此導(dǎo)致所述藥劑的更高的治療指數(shù)(即，更大的功效和更低的毒性)。HDACs的抑制劑包括，但不限于，下述結(jié)構(gòu)種類(lèi)1)異羥肟酸，2)環(huán)肽，3)苯甲酰胺，和4)短鏈脂肪酸。異羥肟酸和異羥肟酸衍生物的實(shí)例，包括，但不限于，曲古抑菌素A(TSA)、N-辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、oxamflatin、辛二酸二異羥肟酸(SBHA),間-羧基-肉桂酸二異羥肟酸(CBHA)、和pyroxamide。TSA作為抗真菌抗生素分離(Tsuji等(1976)J.Antibiot(抗生素雜志)(東京)29:1-6)，并且發(fā)現(xiàn)是哺乳動(dòng)物HDAC的有力的抑制齊'J(Yoshida等(1990)J.Biol.Chem.(生物的化學(xué)雜志)265:17174-17179)。TSA-抗性細(xì)胞系具有改變種酶是TSA的重要靶點(diǎn)。其它基于異羥肟酸的HDAC抑制劑，SAHA,SBHA，和CBHA是在體外或在體內(nèi)能夠以微摩爾的濃度或更低的濃度抑制HDAC的合成化合物。Glick等(1999)CancerRes.(癌癥研究)59:4392-4399。這些基于異羥肟酸的HDAC抑制劑全都具有一種重要的結(jié)構(gòu)特征極性異羥肟酸末端，其通過(guò)疏水亞甲基間隔區(qū)(例如，長(zhǎng)度上6個(gè)碳)與附著末端疏水部分(例如，苯環(huán))的另一個(gè)極性位點(diǎn)連接。研發(fā)具有這樣的基本特征的化合物也落入可以用作HDAC的抑制劑的異羥肟酸的范圍內(nèi)。用作HDAC抑制劑的環(huán)肽是主要的環(huán)狀四肽。環(huán)肽的實(shí)例包括，但不限于，trapoxinA、apicidin和FR901228。TrapoxinA是一種含有2-氨基-8-氧代-9,10-環(huán)氧-癸?；?八0￡)部分的環(huán)狀四肽。Kijima等(1993)J.Biol.Chem.(生物的化學(xué)雜志)268:22429-22435。Apicidin是一種真菌代謝物，其表現(xiàn)出有力的、廣譜的抗原生動(dòng)物活性，并且在納摩爾濃度抑制HDAC活性。Darkin-Rattray等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))93;13143-13147。FR901228是一種從紫色色桿菌(C7zrawoZ)a"en'Mmv/o/acewm)分離的酯肽，并且已經(jīng)表現(xiàn)出在微摩爾濃度抑制HDAC活性。苯甲酰胺的實(shí)例包括但不限于MS-27-275。Saito等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))96:4592-4597。短鏈脂肪酸的實(shí)例包括但不限于丁酸(酯)(例如，丁酸，精氨酸丁酸酯和丁酸苯酯(PB))。Newmark等(1994)CancerLett.(癌癥通信)78:1-5;和Carducci等(1997)AnticancerRes.(抗癌研究)17:3972-3973。另外，已經(jīng)表現(xiàn)出在微摩爾濃度抑制HDAC的depudecin(Kwon等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))95:3356-3361)也落入本發(fā)明的組蛋白脫乙酰酶抑制劑的范圍。本發(fā)明的化合物或藥物制劑還可以與其它治療成分聯(lián)合應(yīng)用，所述其它治療成分包括但不限于，抗腫瘤藥劑、垸化劑、是類(lèi)視黃醇超家族成員的藥劑、抗生素藥劑、激素藥劑、植物來(lái)源的藥劑、生物藥劑、白介素、干擾素、細(xì)胞因子、免疫調(diào)控劑和單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，烷化劑與本發(fā)明的化合物/制劑聯(lián)合使用和/或加入到本發(fā)明的化合物/制劑中使用。垸化劑的實(shí)例包括，但不限于，二氯乙胺(氮芥，例如，苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、美法侖、烏拉莫司汀，吖丙啶(例如，塞替派)，垸酮磺酸鹽(alkylalkonesulfonate)(例如，白消安)，亞硝基脲(例如，卡莫司汀，洛莫司汀，鏈佐星)，非經(jīng)典的垸化劑(六甲蜜胺，達(dá)卡巴嗪，和丙卡巴肼),鉑化合物(卡鉑和順鉑)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，順鉑、卡鉑或環(huán)磷酰胺與本發(fā)明的化合物/制劑聯(lián)合使用和/或加入到本發(fā)明的化合物/制劑中使用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，類(lèi)視黃醇超家族成員與本發(fā)明的化合物/制劑聯(lián)合使用和/或加入到本發(fā)明的化合物/制劑中使用。類(lèi)視黃醇是一族衍生于或與維生素A(全反式視黃醇)相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)分子。類(lèi)視黃醇的實(shí)例包括，但不限于，全反式視黃醇、全反式視黃酸(維A酸)、13-順-視黃酸(異維A酸)和9-順-視黃酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，激素藥劑與本發(fā)明的化合物/制劑聯(lián)合使用和/或加入到本發(fā)明的化合物/制劑中使用。這樣的激素藥劑的實(shí)例是合成的雌激素(例如，二乙基己烯雌酚(diethylstibestrol))，抗雌激素藥劑(例如，他莫昔芬，托瑞米芬，fluoxymesterol和雷洛昔芬)，抗雄激素藥劑(比卡魯胺，尼魯米特，氟他胺)，芳香酶抑制劑(例如，氨魯米特，阿那曲唑和四唑)，酮康唑，醋酸戈舍瑞林，亮丙立德，醋酸甲地孕酮和米非司酮。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物來(lái)源的藥劑與本發(fā)明的化合物/制劑聯(lián)合使用和/或加入到本發(fā)明的化合物/制劑中使用。植物來(lái)源的藥劑的實(shí)例包括，但不限于，長(zhǎng)春花屬生物堿(例如，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春地辛，長(zhǎng)春利定和長(zhǎng)春瑞濱)，喜樹(shù)堿(20(S)-喜樹(shù)堿，9-硝基-20(S)-喜樹(shù)堿，和9-氨基-20(S)-喜樹(shù)堿)，鬼臼毒素(例如，依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26))，和紫杉垸類(lèi)(例如，紫杉醇和多西他賽)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物藥劑與本發(fā)明的化合物/制劑聯(lián)合使用和/或加入到本發(fā)明的化合物/制劑中使用，諸如免疫調(diào)控蛋白如細(xì)胞因子，針對(duì)腫瘤抗原的單克隆抗體，腫瘤抑制基因和癌癥疫苗?？梢耘c本發(fā)明的化合物/制劑聯(lián)合使用和/或加入到本發(fā)明的化合物/制劑中使用的白介素的實(shí)例包括，但不限于，白介素2(IL-2),和白介素4(IL-4),白介素12(IL-12)?？梢耘c地西他濱-甘油制劑聯(lián)合使用的干擾素的實(shí)例包括，但不限于，干擾素(X、干擾素卩(成纖維細(xì)胞干擾素)和干擾素Y(成纖維細(xì)胞干擾素)。所述細(xì)胞因子的實(shí)例包括，但不限于，紅細(xì)胞生成素(epoietin),粒細(xì)胞-CSF(非格司亭)，和粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞-CSF(沙格司亭)。除了細(xì)胞因子之外，免疫調(diào)控劑包括，但不限于，卡介苗，左旋咪唑，和奧曲肽。可以與本發(fā)明的制劑聯(lián)合使用的針對(duì)腫瘤抗原的單克隆抗體的實(shí)例包括，但不限于，HERCEPTIN(曲妥單抗(Trastruzumab))，RITUXAN(利妥昔單抗)，MYLOTARG(抗-CD33),和CAMPATH(抗-CD52)。6.本發(fā)明的化合物或藥物制劑的適應(yīng)癥按照本發(fā)明的藥物制劑可以用于治療對(duì)用地西他濱治療敏感的寬泛種類(lèi)的疾病。可以使用本發(fā)明的藥物制劑治療的優(yōu)選的適應(yīng)癥包括含有不理想的或不可控制的細(xì)胞增殖的那些。這樣的適應(yīng)癥包括良性腫瘤、各種類(lèi)型的癌癥如原發(fā)性瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移，再狹窄(例如，冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和腦損傷)，血液疾病，內(nèi)皮細(xì)胞的異常刺激(動(dòng)脈粥樣硬化)，由于手術(shù)引起的機(jī)體組織侵害，異常的傷口愈合，異常的血管發(fā)生，引起組織纖維化的疾病，重復(fù)性運(yùn)動(dòng)障礙，不是高度血管化的組織的疾病，和與器官移植相關(guān)的增生反應(yīng)。通常，良性腫瘤中的細(xì)胞保持它們的分化特征，并且不是以完全不可控制的方式分裂。良性腫瘤通常是固定的并且不轉(zhuǎn)移?？梢允褂帽景l(fā)明進(jìn)行治療的具體類(lèi)型的良性腫瘤包括血管瘤，肝細(xì)胞腺瘤，海綿狀血管瘤，病灶性結(jié)節(jié)增生，聽(tīng)力神經(jīng)瘤，纖維神經(jīng)瘤，膽管腺瘤，膽管囊腫，纖維瘤，脂肪瘤，平滑肌瘤，間皮瘤，畸胎瘤，粘液瘤，結(jié)節(jié)再生性增生，粒性結(jié)膜炎和膿性肉芽瘤。惡性腫瘤細(xì)胞變得不分化，不應(yīng)答機(jī)體的生長(zhǎng)控制信號(hào)，并且以不可控制的方式增殖。惡性腫瘤是侵入性的，并且能夠擴(kuò)散到遠(yuǎn)的位點(diǎn)(轉(zhuǎn)移)。惡性腫瘤通常分成兩類(lèi)原發(fā)性瘤和繼發(fā)性瘤。原發(fā)性瘤直接起因于發(fā)現(xiàn)它們的組織。繼發(fā)性瘤，或轉(zhuǎn)移瘤，是從機(jī)體中的別處起源但是現(xiàn)在已經(jīng)擴(kuò)散到遠(yuǎn)端器官的腫瘤。常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑是直接生長(zhǎng)到相鄰的結(jié)構(gòu)，通過(guò)血管或淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散，并且沿著組織面和體間隙(腹膜液、腦脊液、等)而轉(zhuǎn)移?？梢允褂帽景l(fā)明進(jìn)行治療的具體類(lèi)型的癌癥或惡性腫瘤，原發(fā)性的或繼發(fā)性的，包括乳腺癌，皮膚癌，骨癌，前列腺癌，肝癌，肺癌，腦癌，喉癌，膽囊癌，胰腺癌，直腸癌，甲狀旁腺癌，甲狀腺癌，腎上腺癌，神經(jīng)組織癌，頭頸癌，結(jié)腸癌，胃癌，支氣管癌，腎癌，基底細(xì)胞癌，潰瘍和乳突型的鱗狀細(xì)胞癌，轉(zhuǎn)移的皮膚癌，骨肉瘤，Ewing's肉瘤，veticulum細(xì)胞肉瘤，骨髓瘤，巨細(xì)胞瘤，小細(xì)胞肺腫瘤，膽結(jié)石，胰島細(xì)胞瘤，原發(fā)性腦瘤，急性和慢性淋巴和粒細(xì)胞瘤，毛細(xì)胞瘤，腺瘤，增生，骨髓癌，嗜鉻細(xì)胞瘤，粘膜神經(jīng)瘤(mucosalneuronms),腸神經(jīng)節(jié)瘤(ganglloneuromas),增生性角膜神經(jīng)瘤，馬方體型腫瘤(marfanoidhabitustumor)，維爾姆斯瘤，精原細(xì)胞瘤，卵巢腫瘤，平滑肌瘤(leiomyomater)，宮頸發(fā)育異常和原位癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，軟組織肉瘤，惡性類(lèi)癌瘤，局部皮膚損傷，蕈樣霉菌病，橫紋肌肉瘤，卡波西肉瘤,骨原性和其它肉瘤，惡性高鈣血癥，腎細(xì)胞瘤，真性紅細(xì)胞增多癥，腺癌，多形成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病，淋巴瘤，惡性黑素瘤，表皮樣癌，以及其它癌癥和肉瘤。血液疾病包括血液細(xì)胞的異常生長(zhǎng)，其可以導(dǎo)致血液細(xì)胞中的發(fā)育異常變化和血液惡性病如各種白血病。血液疾病的實(shí)例包括但不限于急性粒細(xì)胞白血病，急性早幼粒細(xì)胞白血病，急性成淋巴白血病、慢性骨髓性白血病，骨髓增生異常綜合征，和鐮狀細(xì)胞性貧血。急性粒細(xì)胞白血病(AML)是發(fā)生在成年人中最普通類(lèi)型的急性白血病。一些遺傳的遺傳疾病和免疫缺陷狀態(tài)與增加的AML危險(xiǎn)有關(guān)。這些包括具有導(dǎo)致隨機(jī)的染色體斷裂的DNA穩(wěn)定性缺陷的疾病，諸如布盧姆綜合征，范科尼貧血病，Li-Fraumeni家族病，共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥和X-連鎖丙球蛋白缺乏血癥。急性早幼粒細(xì)胞白血病(APML)代表一種不同的AML亞組。這種亞型特征在于包含15;17染色體易位的早幼粒細(xì)胞破壞。這種易位導(dǎo)致產(chǎn)生包括視黃酸受體和PML序列的融合轉(zhuǎn)錄物。急性淋巴白血病(ALL)是具有由各種亞型表現(xiàn)的不同臨床特征的異型疾病。在ALL中已經(jīng)表現(xiàn)出復(fù)發(fā)的細(xì)胞發(fā)生異常。最常見(jiàn)的細(xì)胞發(fā)生異常是9;22易位。導(dǎo)致的Philadelphia染色體代表患者的極低的預(yù)后。慢性骨髓性白血病(CML)是多能性干細(xì)胞的純系骨髓增殖疾病。CML特征在于特異性的染色體異常，包括染色體9和22的易位，產(chǎn)生Philadelphia染色體。電離輻射與CML發(fā)展有關(guān)。骨髓增生異常綜合征(MDS)是一種異型純系造血干細(xì)胞疾病，由于在一個(gè)或多個(gè)造血細(xì)胞譜系中存在發(fā)育異常變化，包括在粒細(xì)胞、紅細(xì)胞系和巨核細(xì)胞系中的發(fā)育異常變化，而將它們分組在一起。這些變化導(dǎo)致在所述三種譜系中的一種或多種的血球細(xì)胞減少?；加蠱DS的患者典型地發(fā)展與貧血、中性粒細(xì)胞減少癥(感染)或血小板減少癥(出血)相關(guān)的并發(fā)癥。通常，約10。/。到約70。/。的患有MDS的患者患有急性白血病。由于在外科手術(shù)過(guò)程中刺激機(jī)體組織的異常細(xì)胞增殖治療對(duì)于多種手術(shù)方法可以是可能的，包括關(guān)節(jié)手術(shù)、腸手術(shù)和疤痕疙瘩結(jié)疤。產(chǎn)生纖維化組織的疾病包括肺氣腫。可以應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行治療的反復(fù)運(yùn)動(dòng)障礙包括腕管綜合征?？梢詰?yīng)用本發(fā)明進(jìn)行治療的細(xì)胞增殖疾病的實(shí)例是骨瘤?？梢詰?yīng)用本發(fā)明進(jìn)行治療的與器官移植相關(guān)的增殖反應(yīng)包括促進(jìn)潛在的器官排斥或相關(guān)的并發(fā)癥的那些增殖反應(yīng)。具體而言，這些增殖反應(yīng)可以在心臟、肺、肝臟、腎臟和其它機(jī)體器官或器官系統(tǒng)的移植過(guò)程中發(fā)生?？梢詰?yīng)用本發(fā)明進(jìn)行治療的異常血管發(fā)生包括那些伴隨下列各項(xiàng)的異常血管發(fā)生類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，局部缺血-再灌注相關(guān)的腦水腫和損傷，皮質(zhì)局部缺血，卵巢增生和血管過(guò)多癥，(多囊卵巢綜合征)，子宮內(nèi)膜異位，銀屑病，糖尿病視網(wǎng)膜病，以及其它眼血管生成疾病如未熟兒視網(wǎng)膜病(晶狀體后纖維形成)，肌肉退化，角膜移植排斥，neuroscular青光眼和OsterWebber綜合征。與異常血管發(fā)生相關(guān)的疾病需要或誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)。例如，角膜血管發(fā)生包括三個(gè)階段前血管潛伏期，活性新血管生成，以及血管成熟和退化。仍然必須揭示各種血管生成因子的身份(identity)和機(jī)制，包括炎性反應(yīng)的因素，如白細(xì)胞，血小板，細(xì)胞因子和二十烷類(lèi)(eicosanoid)，或未鑒定的血漿組分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑可以用于治療與不需要的和異常的血管發(fā)生相關(guān)的疾病。所述方法包括給患有不需要的或異常的血管發(fā)生的患者單獨(dú)施用本發(fā)明的藥物制劑，或者與抗腫瘤藥劑組合施用，所述抗腫瘤藥劑在體內(nèi)作為抗腫瘤藥劑的活性不利地受到高水平的DNA甲基化的影響。抑制血管發(fā)生和/或生血管疾病所需要的這些藥劑的具體劑量可以取決于病況的嚴(yán)重性、施用的途徑和可以由主治醫(yī)生決定的相關(guān)因素。通常，接受的和有效的每日劑量是足以有效抑制血管發(fā)生和/或生血管疾病的量。按照這一實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物制劑可以用于治療與不理想的血管發(fā)生如視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管生成和角膜新血管生成相關(guān)的各種疾病。視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管生成的實(shí)例包括，但不限于，貝斯特病，近視，眼凹(opticpits)，施塔加特病，佩吉特病，靜脈閉塞，動(dòng)脈閉塞，鐮狀細(xì)胞性貧血，肉瘤，梅毒，彈力纖維性假黃瘤頸動(dòng)脈abostructive病(pseudoxanthomaelasticumcarotidabostructivediseases),'漫性目艮色素層炎/vitritis，分禾支桿菌感染，萊姆病，系統(tǒng)紅斑狼瘡，未熟兒視網(wǎng)膜病，伊爾斯病，糖尿病視網(wǎng)膜病，黃斑變性,Bechets病，引起視網(wǎng)膜炎或脈絡(luò)膜炎(chroiditis)的感染，推定的眼組織胞漿菌病，扁平部睫狀體炎，慢性視網(wǎng)膜分離，高粘滯性綜合征，弓形體病，外傷和激光后并發(fā)癥，與發(fā)紅相關(guān)的疾病(角的新血管生成)和由纖維血管或纖維性組織的異常增殖引起的疾病，包括所有形式的增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病。角膜新血管生成的實(shí)例包括，但不限于，流行性角膜結(jié)膜炎，維生素A缺乏癥，過(guò)度佩戴隱形眼鏡病，過(guò)敏性角膜炎，上緣角膜炎，翼狀胬肉角膜炎干燥綜合征(pterygiumkeratitissicca),斯耶格倫病，紅斑痤瘡，phylectenulosis,糖尿病視網(wǎng)膜病，未熟兒視網(wǎng)膜病，角膜移植排斥，莫倫潰瘍，Terrien's邊緣變性，邊緣性角蛋白溶解，多動(dòng)脈炎，韋格納肉樣瘤病，鞏膜炎，periphigoid射線角膜切開(kāi)術(shù)(periphigoidradialkeratotomy),新血管青光眼和晶狀體后纖維增生，梅毒，分枝桿菌感染，脂質(zhì)變性，化學(xué)燒傷，細(xì)菌性潰瘍，真菌性潰瘍，單純皰疹感染，帶狀皰疹感染，原生動(dòng)物感染和卡波西肉瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑可以用于治療與異常血管發(fā)生相關(guān)的慢性炎癥疾病。所述方法包括給患有與異常血管發(fā)生相關(guān)的慢性炎癥疾病的患者單獨(dú)施用本發(fā)明的藥物制劑，或者與抗腫瘤藥劑組合施用，所述抗腫瘤藥劑在體內(nèi)作為抗腫瘤藥劑的活性不利地受到高水平的DNA甲基化的影響。慢性炎癥依賴于連續(xù)形成毛細(xì)管芽以保持炎性細(xì)胞的流入。炎性細(xì)胞的流入和存在產(chǎn)生肉芽瘤，并且因此維持慢性炎性狀態(tài)。使用本發(fā)明的藥物制劑抑制血管發(fā)生可以防止肉芽瘤(granulosmas)的形成，由此減輕所述疾病。慢性炎癥疾病的實(shí)例包括，但不限于，炎性腸病，如局限性回腸炎和潰瘍性大腸炎，銀屑病，肉瘤和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。炎性腸病如局限性回腸炎和潰瘍性大腸炎，特征在于在胃腸道中許多位置的慢性炎癥和血管發(fā)生。例如，局限性回腸炎以慢性透壁炎癥病發(fā)生，其最普遍地影響末端回腸和結(jié)腸，但是還可以發(fā)生在從嘴到肛門(mén)和肛門(mén)周?chē)鷧^(qū)域的胃腸道的任何部分。患有局限性回腸炎的患者通?；加信c腹痛、發(fā)燒、厭食、體重減少和腹腫相關(guān)的慢性腹瀉。潰瘍性大腸炎也是一種在結(jié)腸粘膜發(fā)生的慢性的、非特異性、炎性和潰瘍性疾病，并且特征在于存在血性腹瀉。這些炎性腸病通常由貫穿整個(gè)胃腸道的慢性肉芽瘤炎癥引起，包括由炎癥細(xì)胞筒包圍的新毛細(xì)管芽。本發(fā)明的藥物制劑對(duì)血管發(fā)生的抑制應(yīng)該抑制芽形成，并且防止肉芽瘤形成。炎性腸病還表現(xiàn)出額外的腸內(nèi)表現(xiàn)(manifectations)，諸如皮膚損傷。這樣的損傷特征在于炎癥和血管發(fā)生，并且還可以在除胃腸道之外的許多位置發(fā)生。本發(fā)明的藥物制劑對(duì)血管發(fā)生的抑制應(yīng)該減少炎癥細(xì)胞的流入，并且防止損傷形成。結(jié)節(jié)病(sarcoidois)，另一種慢性炎癥疾病，特征是一種多系統(tǒng)肉芽瘤疾病。這種疾病的肉芽瘤可以在機(jī)體的任何地方形成，并且因此所述癥狀取決于肉芽瘤的位置和所述疾病是否是活性的。肉芽瘤通過(guò)提供恒定炎癥細(xì)胞供應(yīng)的生血管的毛細(xì)管芽產(chǎn)生。通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的藥物制劑抑制血管發(fā)生，這樣的肉芽瘤形成可以被抑制。銀屑病，也是一種慢性和復(fù)發(fā)性炎癥疾病，特征在于各種大小的丘疹和噬斑。使用本發(fā)明的藥物制劑的治療應(yīng)該防止維持特有的損傷必需的新血管的形成，并且為患者提供癥狀減輕。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)也是一種慢性炎性病，其特征在于外周關(guān)節(jié)的非特異性炎癥。據(jù)信在關(guān)節(jié)的滑膜襯里的血管經(jīng)歷血管發(fā)生。除了形成新的血管網(wǎng)絡(luò)之外，內(nèi)皮細(xì)胞釋放導(dǎo)致血管翳生長(zhǎng)和軟骨破壞的因子和反應(yīng)氧類(lèi)別。參與血管發(fā)生的因子可以活躍地貢獻(xiàn)于，并且?guī)椭３诸?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性發(fā)炎狀態(tài)。本發(fā)明的藥物制劑單獨(dú)或與其它抗-RA藥劑聯(lián)合使用的治療可以預(yù)防維持所述慢性炎癥必需的新血管的形成，并且對(duì)RA患者提供癥狀減輕。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑可以用于治療與異常的血紅蛋白合成相關(guān)的疾病。所述方法包括給患有與異常的血紅蛋白合成相關(guān)的疾病的患者施用本發(fā)明的藥物制劑。由于結(jié)合到DNA中的機(jī)制與DNA甲基化不足有關(guān)，含有地西他濱的制劑刺激胎兒血紅蛋白合成。與異常的血紅蛋白合成相關(guān)的疾病的實(shí)例包括，但不限于，鐮狀細(xì)胞性貧血和卩-地中海貧血。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑可以用于控制細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)。所述方法包括給患有與異常的基因表達(dá)水平相關(guān)的疾病的患者施用本發(fā)明的藥物制劑。DNA甲基化與基因表達(dá)的控制相關(guān)。具體而言，在啟動(dòng)子中或啟動(dòng)子附近的甲基化抑制轉(zhuǎn)錄，而去甲基化恢復(fù)表達(dá)。所述機(jī)制的可能的應(yīng)用的實(shí)例包括，但不限于，治療調(diào)控的生長(zhǎng)抑制，程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞分化的誘導(dǎo)。通過(guò)本發(fā)明的藥物制劑促進(jìn)的基因激活可以誘導(dǎo)治療目的的細(xì)胞分化。細(xì)胞分化通過(guò)甲基化不足的機(jī)制誘導(dǎo)。形態(tài)和功能分化的實(shí)例包括，但不限于，形成肌肉細(xì)胞、肌管、紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞的分化。盡管已經(jīng)描述和敘述了本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，但是對(duì)于普通技術(shù)人員應(yīng)該是顯而易見(jiàn)的，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行如本文所述的許多改變、改進(jìn)或改造，這些沒(méi)有一種背離本發(fā)明的精神。因此，所有這樣的改變、改進(jìn)和改造應(yīng)該視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例1.合成亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元和3'-0-封端的衍生物本發(fā)明還提供合成下述新穎的亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元(圖2A)的有效化學(xué)方法。la的4-胺官能團(tuán)可以通過(guò)轉(zhuǎn)化成各種保護(hù)基團(tuán)(R,)而被保護(hù)，諸如具有下列各項(xiàng)的氨基甲酸鹽(或酯)甲基，乙基，9-芴基甲基，9-(2-硫代)芴基甲基，9-(2,7-二溴)苑基甲基17-四苯并[a，c，g,/]苑基甲基，2-氯-3-茚基甲基，苯并[/]茚-3-基甲基，2，7-二-叔-[9-(10，10-二氧代-10,10,10，10-四氫硫代D占噸基)甲基，1,1-二氧代苯并問(wèn)噻吩-2-基甲基2，2,2-三氯乙基，2-三甲基甲硅烷乙基，2-苯基乙基，l-(l-金剛烷基)-l-甲基乙基2-氯乙基,l,l，陽(yáng)二甲基-2-鹵代乙基,1,l-二甲基-2，2-二溴甲基,1,1-二甲基-2,2，2-三氯乙基，1-甲基-l-(4-聯(lián)苯基)乙基,l-(3,5-二-叔-丁基苯基)-l-甲基乙基，2畫(huà)(2'-和4'-吡啶基)乙基2,2-雙(4'-硝基苯基)乙基N-(2-新戊酰氨基)-l，l-二甲基乙基，2-[(2-硝基苯基)二硫代]-l-苯基乙基，2-(7V,7V-二環(huán)己基酰胺基)乙基,叔丁基，1-金剛烷基，2-金剛烷基，乙烯基，烯丙基，l-異丙基烯丙基，肉桂基(cinnayl),4-硝基肉桂基，3-(3'-吡啶基)丙-2-烯基，8-喹啉基，N-羥基哌啶基，垸基二硫代(alkyldithio),苯甲基，對(duì)-甲氧基苯甲基，對(duì)-石肖基苯甲基,對(duì)-溴苯甲基，對(duì)-氯苯甲基，2，4-二氯苯甲基，4-甲基亞磺酰苯甲基，9-蒽基甲基，二苯基甲基，2-甲硫基乙基，2-甲基磺酰乙基，2-(對(duì)-甲苯磺?；?乙基，[2-(l，3-dithianyl)]甲基，4-甲基苯硫基(4-methylthiphenyl),2,4-二甲基苯硫基，2-磷鑰基乙基，l-甲基-l-(三苯基磷絲基)乙基，U-二甲基-2-氰基乙基，2-丹酰乙基，4-苯基乙酸基苯甲基，4-疊氮基苯甲基，4-疊氮基甲氧基苯甲基，間-氯-對(duì)-酰氧基苯甲基，對(duì)-(二羥基硼烷基)苯甲基，5-苯并異噁唑基甲基，2-(三氟乙基)-6-色酮基甲基，m-硝基苯基，3,5-二甲氧基苯甲基，1,-甲基-l-(3,5-二甲氧基苯基)乙基，a-甲基硝基胡椒基,鄰-硝基苯基，3,4-二甲氧基-6-硝基苯甲基，苯基(鄰-硝基苯基)乙基，2-(2-硝基苯基)乙基，6-硝基藜蘆基，4-甲氧基苯?；?，3',5'-二甲氧基苯偶姻,叔戊基S-苯甲硫基，丁炔基，對(duì)-氰基苯甲基，環(huán)己基，環(huán)戊基，環(huán)丙基甲基，對(duì)-癸基氧基苯甲基，二異丙基甲基，2,2-二甲氧基羰基乙烯基，鄰-(N,N-二甲基酰胺基)苯甲基，U-二甲基-3-(N,N-二甲基酰胺基)丙基，l，l-二甲基丙炔基，2-呋喃基甲基，2-碘乙基，異龍腦基，異丁基，異煙堿基，對(duì)-(p'-甲氧基苯基偶氮)苯甲基，l-甲基環(huán)丁基，l-甲基環(huán)己基，l-甲基-l-環(huán)丙基甲基，l-甲基-l-(對(duì)-苯基偶氮苯基)乙基，l-甲基-l-苯基乙基,l-甲基-l-(4'-吡啶基)乙基，苯基，對(duì)-(苯基偶氮)苯甲基，2，4,6-三-叔丁基苯基，4-(三甲基銨)苯甲基，2,4，6-三甲基苯甲基；具有下列各項(xiàng)的脲吩噻嗪基-(10)-羰基，N'-對(duì)-甲苯磺酰基氨基羰基,N'-苯基氨基硫代羰基；酰胺，諸如甲酰胺，乙酰胺，苯氧基乙酰胺,三氯乙酰胺，三氟乙酰胺，苯基乙酰胺，3-苯基丙酰胺(3-phenylpropamide)，戊-4-烯酰胺(pent-4-enamide)，鄰-硝基苯基乙酰胺，鄰-硝基苯氧基乙酰胺，3-(鄰-硝基苯基)丙酰胺，2-甲基-2-(鄰-硝基苯氧基)丙酰胺，3-甲基-3-硝基丁酰胺，鄰-硝基肉桂酰胺，3-(4-叔丁基-2，6-二硝基苯基)-2,2-二甲基丙酰胺，鄰-(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺，2-[(叔丁基二苯基甲硅烷氧基)甲基)甲基]苯甲酰胺，3-(3'，6'-二氧代-2'，4'，5'-三甲基環(huán)己-1',4'-二烯)-3，3-二甲基丙酰胺，鄰-羥基-反式-肉桂酰胺，乙酰乙酰胺，對(duì)-甲苯磺胺，和苯磺胺。地西他濱的4-0-甲氧基(lb)和4-S-甲硫基(lc)類(lèi)似物可以通過(guò)改進(jìn)已公布的地西他濱合成方法而獲得，所述改進(jìn)的方法是通過(guò)分離l-(2-脫氧-3，5-二-0-對(duì)-氯苯甲?；虮郊柞?D-呋喃核糖基)-4-甲氧基或甲硫基-1,3,5-三嗪-2(//)-酮的a和卩正位異構(gòu)體，并且不用甲醇氨處理而去除3,5-保護(hù)基團(tuán)。Pliml禾BSorm(1964)Collect.Czech.Chem.Commun.29:2576-2577;Piskala和Sorm(1978)NucleicAcidChemistry(核酸化學(xué))(Towsend和Tipson，Wiley,1978),第443-449頁(yè)。5'-OH的保護(hù)通過(guò)在加入二甲氧基三苯甲基氯之前將4-氨基保護(hù)的地西他濱和4-甲氧基和4-甲硫基類(lèi)似物(lb，lc)溶解在無(wú)水吡啶(5mL/毫摩爾)中而實(shí)現(xiàn)。例如，將地西他濱(1.2g)與無(wú)水吡啶共蒸餾兩次，并且溶解在20ml無(wú)水DMF中。加入六甲基二硅氮烷(2.8mL)。將溶液攪拌并且放置過(guò)夜。將溶劑在真空中蒸發(fā)，并且將殘留的殘余物溶解在甲苯中，并且蒸發(fā)兩次。將3',5'-二三甲基甲硅垸基5-氮雜-2'-脫氧胞苷(1^=0.67,4:1二氯甲院/甲醇)與無(wú)水吡啶(~10mL)共蒸餾兩次，并且溶解在無(wú)水吡啶(20mL)中。加入苯氧乙酸酐(1.5g)，并且將得到的溶液攪拌1小時(shí)。再加入0.18g苯氧乙酸酐(0.1Sg)，并且再攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物在真空中蒸發(fā)至干燥，并且與甲苯共蒸餾(3x)。將殘余物溶解在二氯甲烷(50mL)中，并且用1MNaHC03水溶液(50mL)中萃取，其用二氯甲烷(20mL)再萃取。將合并的有機(jī)相通過(guò)硫酸鈉干燥，并且在真空中還原，以產(chǎn)生粗3'，5'-二三甲基甲硅烷基-N-苯氧乙?；?-氮雜-2'-脫氧胞苷(3g;Rf=0.82,9:1二氯甲垸/甲醇)。將所述原料溶解在無(wú)水DMF(20mL)中，并且轉(zhuǎn)移到50mL塑料falcon管中，并且加入TAS-F(2.4g)(氣化的)。反應(yīng)在22。C進(jìn)行4小時(shí)(瓶子不完全封閉，以減小產(chǎn)生的壓力)。將DMF在真空中蒸發(fā)，并且將殘留的殘余物進(jìn)行柱色譜法(30g硅膠，2.5cm柱,99:1到9:1二氯甲烷/甲醇)。獲得白色固體N-苯氧乙?；?-氮雜-2'-脫氧胞苷(0.81g;Rf=0.26,9:l二氯甲烷/甲醇)。將這種化合物(0.6g)用無(wú)水吡啶共蒸餾，并且在加入二甲氧基三苯甲基氯(0.9g)之前溶解在無(wú)水吡啶(20mL)中，并且在22。C攪拌2小時(shí)。溶劑在真空中去除并且用甲苯共蒸餾(3次)。將殘留物溶解在二氯甲烷(50mL)中，并且用1MNaHCO3水溶液(50mL)萃取，其用二氯甲垸(20mL)再萃取。將合并的有機(jī)相通過(guò)硫酸鈉干燥，并且在真空中還原。殘留物進(jìn)行硅膠色譜法(二氯甲垸-100%到95:5二氯甲烷/甲醇)，其產(chǎn)生5'-二甲氧基三苯甲基-N-苯氧乙?；?-氮雜-2'-脫氧胞苷(0.35g,0.53毫摩爾，32%;Rf=0.49，9:1二氯甲烷/甲醇)。在加入0.3M在無(wú)水乙腈中的苯甲硫基四唑(0.9mL)溶液和氰基乙基四異丙基phosphorodiamidite(0.17mL)之前，將這種中間物(0.3g)溶解在無(wú)水乙腈(2mL)中。將混合物在22。C攪拌1.5小時(shí)。TLC(2:1乙酸乙酯/己烷+2%TEA)表現(xiàn)出具有R^0.27和0.36的非對(duì)映異構(gòu)體混合物。將溶劑真空去除，并且將殘留的殘留物進(jìn)行柱色譜法(20g硅膠，2.5cm柱，9:1己垸/乙酸乙酯+2%TEA(300mL),1:1己烷/乙酸乙酯+1%TEA(200mL),1:2己烷/乙酸乙酯+0%TEA(250mL)。地西他濱phosphoramidite構(gòu)建ld，其中R產(chǎn)苯氧基乙?；?0.297g，0.34mmol,76%)，其用1:2己烷/乙酸乙酯洗脫。ld的ESI-MS(C46H53N609P的計(jì)算的精確質(zhì)量是864.36)表現(xiàn)出m/z864.1禾卩966.4[M+NEt3+H+]+;31PNMR(CDC13，500MHz)表現(xiàn)出149.17和149.0ppm;NMR(CDC13,500MHz)表現(xiàn)出化學(xué)移動(dòng)(ppm)8.63和8.59(1H，雙峰，H-6),7.4-6.6(18H,多重峰，芳族DMTr/Pac),6.05(IH，三峰，H畫(huà)l'),4.79(2H，單峰，Pac的CH2)，4.59(1H,單峰，H-4')，4.25到4.20(1H，雙峰，H-3'),3.8-3.7(1H,多重峰，P-0-CH2),3.70(3H，單峰,DMTr的CH30),3.68(3H,單峰，DMTr的CH30),3.6-3.48(3H,多峰，異丙基的兩個(gè)CH's和一個(gè)P-0-CH2),3.36-3.27(2H，多峰，H-5'),2.80(1H,單峰，H-2'),2.53(1H,單峰，H-2，)，2.40(2H,多峰，CH2CN),1.1(12H，異丙基的CH3)。另夕卜，公布方法的較小改進(jìn)允許獲得3'-和5'-0-封端的衍生物(圖3A,lg，lh，li，lj，lk，ll)(Bagnall,Bell和Pearson(1978)J.ofFluorineChem.(氟化學(xué)雜志)11:93-107)，其中帽(cap)可以是垸基，酯和脂肪酸酯，二醇衍生物如乙二醇和丙二醇；并且保護(hù)的地西他濱3'-連接到控制孔玻璃支持物上(圖3B，lm，ln，lo)。AIul，Singman,Zhan和Letsinger(1991)19:1527-1532。其它的地西他濱衍生物具有用下列各項(xiàng)保護(hù)的3'-OH:酯(其包括但不限于，乙?；?、苯甲酰基和卣代苯甲?；缓椭舅?和醚(其包括但不限于對(duì)-硝基苯基乙基、甲氧基甲基、甲硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基、芐氧基甲基、對(duì)-甲氧基芐氧基甲基、對(duì)-硝基芐氧基甲基、鄰-硝基節(jié)氧基甲基、(4-甲氧基苯氧基)甲基、叔丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基、硅氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2,2，2-三氯乙氧基甲基、雙(2-氯乙氧基)甲基2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、四氫呋喃基、禾Ql-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基)，二醇衍生物如乙二醇和丙二醇，如圖4所示。2.在固體支持物上合成DpG和GpD二核苷酸和四核苷酸DpG和GpD二核苷酸和四核苷酸可以通過(guò)稍微修改增加偶聯(lián)時(shí)間(>2分鐘)的標(biāo)準(zhǔn)方法(圖5)合成。Beaucage和Caruthers(1981)Tet.Lett.22:1859-1862;McBride和Caruthers(1983)Tet.Lett.24:245-248。GpD二核苷酸2a和DpGpGpD四核苷酸3a的合成可以用lm,In或lo與相似堿性保護(hù)的5'-0-DMTr2'-脫氧鳥(niǎo)苷-3'-0-氰基乙基-N,N-二異丙基亞磷酰胺和5'-0-DMTr2'-脫氧-5-氮雜-胞苷-3'-0-氰基乙基-N,N-二異丙基亞磷酰胺(Id,le或lf)偶聯(lián)而起始，如在圖6A中所示。隨后從固體支持物(諸如控制孔的玻璃，CPG)的釋放和用堿如DBU/吡啶(或乙腈)去除氨基甲酸鹽(或酯)保護(hù)基團(tuán)，并且將甲醇氨用于去除4-0-甲氧基和4-0-甲硫基保護(hù)基團(tuán)，而產(chǎn)生具有或不具有最后DMTr基團(tuán)的需要的寡核苷酸。DpGpGpD(3b)可以類(lèi)似地獲得(圖7).例如(圖6A和6B)，安瑪西亞(Amersham)AKTAOligopilot10系統(tǒng)負(fù)載保護(hù)的地西他濱-連接的CPG固體支持物lm(其中Rf苯氧基乙?；?，在60%的0.3M苯甲硫基四唑激活劑(在乙腈中)存在下，其與2-2.5當(dāng)量的叔丁基苯氧基乙?；?，-脫氧鳥(niǎo)苷亞磷酰胺偶聯(lián)2.5分鐘。將含有保護(hù)的GpD二核苷酸的CPG固體支持物用20ml在甲醇中的50mMK2C03處理1小時(shí)20分鐘。將偶聯(lián)的產(chǎn)物用2M在無(wú)水乙腈中的叔-丁基氫過(guò)氧化物(通過(guò)將叔丁基氫過(guò)氧化物溶解在80%的叔-丁基過(guò)氧化物中而制備)氧化5分鐘。將二甲氧基三苯甲基保護(hù)基團(tuán)用在甲苯中的3%二氯乙酸去除。將CPG固體支持物用無(wú)水甲醇洗滌；通過(guò)加入2mL的1M在甲醇中的乙酸而將濾出物中和。將溶液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；將殘留物溶解在200mM乙酸三乙銨(pH6.9)中，用乙腈(500iiL50。/。水性乙腈)洗滌，并且通過(guò)注射器濾器過(guò)濾。隨后將GpD二核苷酸通過(guò)AKTAExplorer100HPLC純化，使用具有保護(hù)柱(菲羅門(mén)(Phenomenex)),50x21,2mm，10pm的GeminiC18制備柱(菲羅門(mén)(Phenomenex))，250x21.2mm，10|am,用50mM在MilliQ水中的乙酸三乙銨(pH7)(流動(dòng)相A)和80%在MilliQ水中的乙腈(流動(dòng)相B)，使用2。/。到20/25%柱體積的流動(dòng)相B。GpD二核苷酸2a的ESI-MS(-ve),其中乂+=三乙銨(中性化合物dsH24N90]oP的計(jì)算的精確質(zhì)量是557.14),表現(xiàn)出對(duì)于[M-H].m/z556.1和對(duì)于[2M-H]—的1113.1(參見(jiàn)圖30中的質(zhì)譜)。當(dāng)在60。/。0.3M的苯甲硫基四唑激活劑(在乙腈中)存在下，將所述循環(huán)用2-2.5當(dāng)量的叔-丁基苯氧基乙酰基2'-脫氧鳥(niǎo)苷或苯氧基乙?；?-氮雜-2'-脫氧胞苷亞磷酰胺重復(fù)3次，分別為2.5分鐘和10分鐘時(shí)，(圖6b和7)，獲得DpGpGpD四核苷酸3b，其中X、三乙銨(對(duì)于中性化合物C36H47N18022P3計(jì)算的精確質(zhì)量是1176.23)，表現(xiàn)出對(duì)[M-2H]2—，m/z587.2和1175,2[M-H]-(圖32)。另外，DpG二核苷酸2b和GpDpGpD3c可以通過(guò)將ls(其中Rr氨基甲酸鹽(或酯)保護(hù)基團(tuán))與亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元ld、le或lf偶聯(lián)而合成(圖8)。GpDpDpG和GpDpG(3c')可以類(lèi)似地獲得(圖9)。例如，在保護(hù)的2'-脫氧鳥(niǎo)苷-連接的CPG固體支持物ls(其中R產(chǎn)叔-丁基苯氧基乙?；?的情形中，其在60%0.3M的苯甲硫基四唑激活劑(在乙腈中)存在下與2-2.5當(dāng)量的苯氧基乙?；匚魉麨I亞磷酰胺(圖2A，ld,其中R,=苯氧基乙?；粎⒁?jiàn)圖38中的質(zhì)譜)偶聯(lián)10分鐘。將包含保護(hù)的DpG二核苷酸的CPG固體支持物用20mL在甲醇中的50mMK2C03處理1小時(shí)20分鐘。按照對(duì)于GpD二核苷酸所述，將偶聯(lián)的產(chǎn)物氧化，去除保護(hù)基團(tuán)，清洗，過(guò)濾，并且純化。DpG二核苷酸2b的ESI-MS(-ve)，其中X、三乙基銨(對(duì)于中性化合物C,8H24N90,oP計(jì)算的精確質(zhì)量是557.14),表現(xiàn)出m/z556.1[M-H]-和1113.1對(duì)于[2M-H]-(參見(jiàn)圖31中的質(zhì)譜)。DpG二核苷酸2b,其中X+^內(nèi)，通過(guò)將三乙基銨鹽重新溶解在4ml水，0.2ml2MNaC104溶液中而獲得。當(dāng)加入36mL丙酮時(shí)，所述二核苷酸沉淀。將溶液在-20'C保存幾個(gè)小時(shí)，并且在4000rpm離心20分鐘。倒掉上清，并且將固體用30mL丙酮洗滌，然后再在4000rpm離心20分鐘。將沉淀溶解在水中，并且冷凍干燥，其表現(xiàn)出m/z556.0[M-H]—(參見(jiàn)圖36中的質(zhì)譜)。當(dāng)在60。/。0.3M的苯甲硫基四唑激活劑(在乙腈中)存在下，將所述循環(huán)用2-2.5當(dāng)量的叔丁基苯氧基乙酰基2'-脫氧鳥(niǎo)苷或苯氧基乙?；?-氮雜-2'-脫氧胞苷亞磷酰胺重復(fù)2次，分別為2.5分鐘和10分鐘時(shí)，獲得GpDpG三核苷酸3c'，其中X+=三乙基銨(對(duì)于中性化合物C28H36N14016P2計(jì)算的精確質(zhì)量是886.2)，其表現(xiàn)出m/z885.16[M-H]—(參見(jiàn)質(zhì)譜圖33)。當(dāng)循環(huán)重復(fù)3次時(shí)，獲得DpGpDpG四核苷酸3c，其中X、三乙基銨(對(duì)于中性化合物C36H47N,8022P3計(jì)算的精確質(zhì)量是1176.23)，其表現(xiàn)出m/z587.4對(duì)于[M-2Hf和1175.4[M-H]—(參見(jiàn)圖34中的質(zhì)譜)。當(dāng)將在偶聯(lián)步驟中最新合成的亞磷酸三酯用在二氯乙烷/均可力丁(symcollidine)4/1(v/v)中的5。/。二硫苯乙酰(PADS)在4.3mL溶液(3,6個(gè)柱體積)，流速50cm/h(接觸時(shí)間3個(gè)柱體積)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的硫代磷酸三酯時(shí)，可以獲得2b的硫代磷酸酯衍生物。硫化作用在3分鐘內(nèi)完成，在那一時(shí)間，通過(guò)用乙腈洗滌將過(guò)量的試劑從反應(yīng)容器去除。隨后的去保護(hù)和純化，如關(guān)于2a所述，生成硫代磷酸酯DpG(Sp和Rp,圖13，2e)，其中X+二三乙基銨(對(duì)于中性化合物C,8H24N909PS計(jì)算的精確質(zhì)量是573.12)，其表現(xiàn)出m/z571.9對(duì)于[M-Hr(參見(jiàn)圖35中的質(zhì)譜)。當(dāng)所述循環(huán)用DMT六乙二醇亞磷酰胺重復(fù)一次(60%激活劑，7分鐘偶聯(lián)時(shí)間)，然后按照對(duì)于2a所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的氧化和純化，獲得HEG-DpG二核苷酸2d(圖12)，其中乂+=三乙基銨，和帽=六乙二醇磷酸酯(對(duì)于中性化合物(:3011491^980192計(jì)算的精確質(zhì)量是901.71)，其表現(xiàn)出m/z900.4[M-H]-(參見(jiàn)圖37中的質(zhì)譜)。3.通過(guò)DpG和GpD二、三和四核苷酸抑制DNA甲基化DpG和GpD二、三和四核苷酸的脫甲基活性在基于細(xì)胞的GFP(綠色熒光蛋白)測(cè)定中檢測(cè)。這一檢測(cè)，其在圖25中示意性舉例說(shuō)明，具有由CMV啟動(dòng)子調(diào)控的GFP基因，并且對(duì)所述啟動(dòng)子內(nèi)的CpG位點(diǎn)的甲基化敏感。由暴露于甲基化抑制劑導(dǎo)致的甲基化的減少引起GFP表達(dá)，并且容易計(jì)分。具體而言，將含有表觀遺傳沉默的GFP轉(zhuǎn)基因的CMV-EE210細(xì)胞系用于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP表達(dá)的重激活。CMV-EE210通過(guò)用pTR-UF/UPl/UF2質(zhì)粒(Zolotuhin等，1996)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞而制備，其包括含有源于適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的人源化GFP基因的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的pBS(+)(Stratagene,公司)。轉(zhuǎn)染后，高水平GFP表達(dá)細(xì)胞最初通過(guò)FACS分析選擇，并且用MoFlo血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Cytomation，公司)分選。地西他濱，哺乳動(dòng)物DNMT1的有效抑制劑，用作陽(yáng)性對(duì)照。為了篩選CMV-EE210的重激活，將地西他濱(以lpM)或測(cè)試化合物(以30-50pM的濃度)加入到補(bǔ)充了10%胎牛血清(Hyclone)的完全培養(yǎng)基(不含酚紅DMEM(Gibco，生命技術(shù))中。然后，將細(xì)胞在含有所述測(cè)試化合物的96孔板中接種到30%匯合(5000細(xì)胞/孔)，并且在37°C5%C02中生長(zhǎng)3天。將所述板在使用450-4卯激發(fā)濾光器(13濾光器立方體(filtercube)，萊卡迪菲爾德(Ldca,Deerfield)IL)的熒光顯微鏡下檢査。如果(10%)的存活細(xì)胞表達(dá)GFP，那么將孔計(jì)分為gl陽(yáng)性，如果30。/。的存活細(xì)胞表達(dá)GFP，那么計(jì)分g2陽(yáng)性，并且如果>75%的存活細(xì)胞表達(dá)GFP，那么計(jì)分為g3。GFP50是抑制劑的濃度(類(lèi)似于ICm))，其是在其上GFP表達(dá)水平從g3到gl/2的劑量。表1列出作為DNA甲基化抑制劑的地西他濱，DpG,GpD,GpDpG，DpGpGpD和DpGpDpG的檢測(cè)的結(jié)果。如在表1中所示，所有檢測(cè)的5種寡核苷酸類(lèi)似物能夠在低濃度有效地抑制DNA甲基化，導(dǎo)致GFP基因轉(zhuǎn)錄的重激活。表l:脫甲基活性的初步篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>4.在溶液中合成DpG和GpD二核苷酸和四核苷酸為了大規(guī)模合成這些寡核苷酸，應(yīng)用可溶的聚合物支持物是理想的。Bayer和Mutter,(1972)Nature(自然)237:512-513;Bonora(1995)Appl.Biochem.Biotechnol.(應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù))54:3-17。聚合物支持物聚(乙二醇)或PEG允許合成步驟在均質(zhì)相中進(jìn)行，并且保證通過(guò)簡(jiǎn)單的沉淀-和-過(guò)濾步驟容易地進(jìn)行中間體純化步驟。HarrisPolyethyleneglycol)Chemistry(聚(乙二醇){七學(xué)).BiotechnicalandBiomedicalApplications(生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用)，J.M.Harris(Ed.)，Plenum出版社，紐約(美國(guó))，1992,第1-14頁(yè)[書(shū)引用]。例如，3'-連接的衍生物如lt，lu，或lv(圖10)可以容易地適合在前述固相方法中所用的標(biāo)準(zhǔn)的基于亞磷酰胺的化學(xué)法，以生成DpG和GpD二和四核苷酸2a，2b，3a，3b，3c，3d。備選地，新的DpG二核苷酸2a可以在溶液中制備，其通過(guò)將衍生物4,19或11"與相似堿性保護(hù)的5'-0-01^1>2'-脫氧鳥(niǎo)苷-3'-0-氰基乙基-;\^-二異丙基亞磷酰胺和GpD在乙腈和/或二氯甲烷中進(jìn)行偶聯(lián)，然后用碘/水氧化，去保護(hù)堿性保護(hù)基團(tuán)，并且去除DMTr基團(tuán)(如在寡核苷酸合成的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)中那樣)而制備，所述GpD來(lái)自于相似地3'-保護(hù)的2'-脫氧鳥(niǎo)苷與5'-0-DMTr2'-脫氧-5-氮雜-胞苷-3'-0-氰基乙基-iV,iV-二異丙基亞磷酰胺(ld,le或lf)的偶聯(lián)。。另夕卜，末端3'-OH和5'-OH用甲基基團(tuán)封端的新的DpG(2c)二核苷酸可以通過(guò)將3'-0-甲基衍生物lg，lh或li與2'-脫氧鳥(niǎo)苷-3'-0-氰基乙基-A^V-二異丙基亞磷酰胺lw的5'-0-甲基衍生物偶聯(lián)(圖11)，然后用碘/水氧化，去保護(hù)堿性保護(hù)基團(tuán)，并且去除DMTr基團(tuán)(如在寡核苷酸合成的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)中那樣)進(jìn)行制備。二核苷酸GpD(2d)可以通過(guò)將3'-0-甲基2'脫氧鳥(niǎo)苷衍生物lx與2'-5-氮雜胞苷-3'-0-氰乙基-W7V-二異丙基亞磷酰胺lj，lk或ll的5'-0-甲基衍生物偶聯(lián)而類(lèi)似地制備(圖12)。5.合成抗胞苷脫氨酶和核酸酶的DpG和GpD寡核苷酸通常，在生物流體中的寡核苷酸經(jīng)受核酸酶的降解。Stein和Cheng(1993)Science(科學(xué))261:1004-1012;Cohen(1994)Adv.Pharmacol.(高級(jí)藥理學(xué))25:319-339。為了提高穩(wěn)定性和對(duì)核酸酶降解的抗性，還制備了硫代磷酸酯二核苷酸和四核苷酸衍生物如2e，2f，3e，3f，3g，和3h(圖13,14和15)，其中核苷酸之間非鍵合的氧被硫替代。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺流程，不同的是在氧化步驟中用雙(O，O-二異丙氧基硫膦基)二硫化物(S-tetra)替換碘。Zon禾口Stec(1991)在Eckstein,F.(ed.)，'PhosphorothioateAnalogues'inOligonucleotidesandTheirAnalogs:APracticalApproach(寡核苷酸中的'硫代磷酸酯'類(lèi)似物和它們的類(lèi)似物實(shí)用方法).IRL出版社，第87-108頁(yè)；Zon，G.(1990)在Hancock,W.S.(ed.),HighPerformanceLiquidChromatographyinBiotechnology(生物技術(shù)中的高效液相色譜).Wiley,紐約，第14章，第310-397頁(yè)[書(shū)引用];Stec，Uznanski,Wilk,Hirschbein,Fearon,和Bergot(1993)Tet.Lett.34:5317-5320;Iyer,Phillips,Egan,Regan,禾BBeaucage(1990)J.Org.Chem(有機(jī)化學(xué)雜志).55:4693-4699。對(duì)于將這些寡核苷酸用作藥物的另一種潛在的障礙是胞苷脫氨酶(CDA)的普遍存在，原因在于地西他濱的脫氨基導(dǎo)致整體的活性損失。Momparler,Cote和Eliopoulos(1997)Leukemia(白血病)11(增刊1):1-6;Chabot,Bouchard和Momparler(1983)Biochem.Pharmacol.(生物化學(xué)藥理學(xué))32:1327-1328;Laliberte,Marquez和Momparler(1992)CancerChemother.Pharmacol.(癌腫化學(xué)治療藥理學(xué))30:7-11。為了解決這一問(wèn)題，還制備包含其中4-NH2被4-NR3R4(其中R3和R4可以是烷基、烷胺和垸醇)取代的地西他濱衍生物的寡核苷酸，以生成衍生物如2g，2h，2i，2j，2k，21，2m，2n，3i，3j，3k，31，，3m，3n，3o，和3p(圖16,17,18,19,20和21)。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺流程，不同的是在去除4-甲氧基和4-甲硫基過(guò)程中用垸胺、烷二胺和羥胺替換在甲醇中的氨。由于二級(jí)和三級(jí)胺，二胺和羥胺比氨水使得離去基團(tuán)變得更難離去，所以這些衍生物更加難以脫氨基。6.基于癌癥相關(guān)基因如P15(CDKN2B)，BRCA1，和P16(CDKN2A)啟動(dòng)子區(qū)的CpG島合成富含DpG和GpD的寡核苷酸可以制備富含DpG和GpD島的寡核苷酸類(lèi)似物，其長(zhǎng)度在5到100個(gè)堿基范圍內(nèi)，其中D可以是地西他濱或地西他濱衍生物。與上述DpG和GpD二核苷酸和四核苷酸不同，這些相對(duì)更長(zhǎng)的富含DpG和GpD的寡核苷酸類(lèi)似物不但嚴(yán)格在啟動(dòng)子區(qū)的CpG島內(nèi)起作用，而且對(duì)在癌癥相關(guān)基因如P15(CDKN2B)，P16(CDKN2A)和BRAC1的啟動(dòng)子區(qū)序列內(nèi)部的片段特異。例如，基于P15，P16,和BRCA1啟動(dòng)子區(qū)序列(分別為圖27,28和29)的8-mer，10-mer,和12-mer富含DpG和GpD的寡核苷酸類(lèi)似物(圖26)可以通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)的固相寡核苷酸合成中使用亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元ld，le或lf制備?？梢孕揎棾善渲薪Y(jié)合5-氮雜-胞嘧啶的寡核苷酸的更多實(shí)例在圖27，28和29中列出。這些寡核苷酸類(lèi)似物可以如引物一樣作用，并且只在P15,P16或BRCA1啟動(dòng)子區(qū)序列的特別片段結(jié)合在正在復(fù)制的DNA中，因此有效地并且選擇性地抑制所述啟動(dòng)子區(qū)的甲基化。盡管已經(jīng)在本文中顯示并且描述了本發(fā)朋的優(yōu)選的實(shí)施方案，但是對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該顯而易見(jiàn)，所述實(shí)施方案只是通過(guò)舉例方式提供?，F(xiàn)在對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將存在許多不背離本發(fā)明的改變，變化和替換。應(yīng)該理解，本文所述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種備選方案可以用于實(shí)施本發(fā)明。意欲由下述權(quán)利要求定義本發(fā)明的范圍，并且由此涵蓋在這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)和它們的等價(jià)物。權(quán)利要求1.一種分離的或合成的寡核苷酸類(lèi)似物、其鹽或酯，其在長(zhǎng)度上具有12個(gè)或更少的堿基，并且在所述寡核苷酸類(lèi)似物序列中包含一個(gè)或多個(gè)5-氮雜-胞嘧啶作為堿基殘基。2.權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物在序列中具有多于30%,35%,或40%的鳥(niǎo)嘌呤殘基。3.權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物選自由下列各項(xiàng)組成的組5，-DpG-3，，5，-GpD-3，，5，-DpGpD-3，，5，-GpGpD-3，,5,-GpDpG-3，，5'-GpDpD-3'，5'-DpDpG-3,，5'匿DpGpG-3，，5'-GpDpD-3'，5，-DpGpA-3，，5，-DpGpDpG-3，，5，-DpGpGpD-3，，5，-GpDpGpD-3，,5'-GpDpDpG-3，，5'-DpGpDpGpA-3，，其中D是地西他濱；p是磷酸接頭;A是2'-脫氧腺苷，和G是2'-脫氧鳥(niǎo)苷。4.權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物是5'-DpG-3'或5'-GpD-3',其中D是地西他濱；p是磷酸接頭；和G是脫氧鳥(niǎo)苷。5.權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物在序列中包含具有下述通式的片段一Z-L-G—,或一G-L-Z—，其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；和L是共價(jià)連接Z和G的化學(xué)接頭。6.權(quán)利要求5的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述接頭L是糖磷酸二酯接頭。7.權(quán)利要求5的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述接頭L是核糖或2'-脫氧核糖磷酸二酯接頭。8.權(quán)利要求5的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述接頭L是核糖或2'-脫氧核糖硫代磷酸酯接頭。9.權(quán)利要求5的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述接頭L是核糖或2'-脫氧核糖bornophosphate接頭。10.權(quán)利要求5的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述接頭L是核糖或2'-脫氧核糖甲基磷酸酯接頭。11.權(quán)利要求5的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述接頭L是2'-甲氧基核糖磷酸二酯接頭。12.權(quán)利要求5的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述接頭L是2'-甲氧基乙基核糖磷酸二酯接頭。13.權(quán)利要求5的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述接頭L是2'-氟核糖磷酸二酯接頭。14.權(quán)利要求5的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述接頭L是蛋白質(zhì)核苷酸(PNA)主鏈。15.權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述鹽用選自由下列各項(xiàng)組成的組的酸形成鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、羧酸、磺酸、硫代酸或膦酸、乙酸、丙酸、羥基乙酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、甲基馬來(lái)酸、延胡索酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酸基苯甲酸、embonicacid、煙酸、異煙酸、氨基酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、乙垸-1,2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-l,5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酯、葡萄糖-6-磷酸、N-環(huán)己基氨基磺酸和抗壞血酸。16.權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述鹽是鹽酸鹽，甲磺酸鹽，EDTA,亞硫酸鹽，L-天冬氨酸鹽，馬來(lái)酸鹽，磷酸鹽，L-谷氨酸鹽，(+)-L-酒石酸鹽，檸檬酸鹽，L-乳酸鹽，琥珀酸鹽，乙酸鹽，己酸鹽，丁酸鹽，或丙酸鹽。17.權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述鹽是鈉、鈣、鋰、鉀、銨或三烷基銨鹽。18.權(quán)利要求16的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述三烷基銨鹽是三甲基銨、三乙基銨或三丙基銨鹽。19.權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物的5'-或3'-末端的羥基基團(tuán)用非羥基保護(hù)基團(tuán)取代。20.權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述非羥基保護(hù)基團(tuán)選自由下列各項(xiàng)組成的組二甲氧基tritoxyl(DMTr-O),O-甲基(OMe),乙二醇,四乙二醇，六乙二醇，和六乙二醇磷酸酯(或鹽)。21.—種分離或合成的寡核苷酸類(lèi)似物，其鹽或酯，其在序列中包含兩個(gè)或多個(gè)拷貝的具有下述通式的二核苷酸類(lèi)似物—Z-L-G—,或一G-L-Z—,其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；和L是共價(jià)連接Z和G的化學(xué)接頭。22.權(quán)利要求21的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物包含小于IO,8,6,或4個(gè)拷貝的二核苷酸類(lèi)似物一Z-L-G—，或一G-L-Z—。23.—種分離或合成的寡核苷酸類(lèi)似物，其鹽或酯，其在長(zhǎng)度上具有至少6個(gè)堿基，并且包含；在所述寡核苷酸類(lèi)似物的序列中包含一個(gè)或多個(gè)5-氮雜-胞嘧啶殘基；并且與基因片段具有至少75%的序列同源性。24.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物具有通式—Z-L-G—，或一G-L-Z—，其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；和L是共價(jià)連接Z和G的化學(xué)接頭。25.權(quán)利要求24的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物具有兩個(gè)或多個(gè)拷貝的一Z-L-G—，或一G-L-Z—。26.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述基因片段是所述基因的5'-非翻譯區(qū)。27.權(quán)利要求26的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述基因的5'-非翻譯區(qū)是基因的啟動(dòng)子。28.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物在序列中具有多于30%,35%，或40%的鳥(niǎo)嘌呤殘基。29.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述基因是哺乳動(dòng)物基因。30.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述基因是人基因。31.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述基因是編碼選自由下列各項(xiàng)組成的組的蛋白質(zhì)的人基因VHL;P16/INK4A;E-鈣黏著蛋白；hMLHl;BRCA1;LKB1;P15/INK4B;雌激素受體；06-MGMT;GST-pi;TIMP-3;DAPK1;P73;雄激素受體；視黃酸受體-卩；內(nèi)皮縮血管肽-B受體；Rb;P14ARF;RASSF1;APC;胱天蛋白酶畫(huà)8;TERT;TERC;TMS-1;SOCS-l;PITX2;MINT1;MINT2;GPR37;SDC4;MY0D1;MDR1;THBS1;PTC1;和pMDRl。32.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述基因是人腫瘤抑制基因。33.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述基因編碼人P15。34.權(quán)利要求33的寡核苷酸類(lèi)似物，其中P15基因的片段是在具有SEQIDNO:7的啟動(dòng)子區(qū)中的片段。35.權(quán)利要求34的寡核苷酸類(lèi)似物，其中P15基因的片段選自由SEQIDNOs:8-12組成的組。36.權(quán)利要求34的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物是SEQIDNO:1或2。37.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述基因編碼人P16。38.權(quán)利要求37的寡核苷酸類(lèi)似物，其中P16基因的片段是在具有SEQIDNO:13的啟動(dòng)子區(qū)中的片段。39.權(quán)利要求38的寡核苷酸類(lèi)似物，其中P16基因的片段選自由SEQIDNOs:14-18組成的組。40.權(quán)利要求38的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物是SEQIDNO:5或6。41.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述基因編碼人BRCA1。42.權(quán)利要求41的寡核苷酸類(lèi)似物，其中BRCA1基因的片段是在具有SEQIDNO:19的啟動(dòng)子區(qū)中的片段。43.權(quán)利要求42的寡核苷酸類(lèi)似物，其中P15基因的片段選自由SEQIDNOs:20-24組成的組。44.權(quán)利要求42的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物是SEQIDNO:3或4。45.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物能夠在高嚴(yán)格性條件下與所述基因的片段雜交。46.權(quán)利要求45的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述高嚴(yán)格性條件是在42°C，在5XSSPE,0.3%SDS，200昭/ml剪切的和變性的鮭精DNA，禾Q50%甲酰胺中的雜交。47.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物能夠在中等嚴(yán)格性條件下與所述基因的片段雜交。48.權(quán)利要求47的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述中等嚴(yán)格性條件是在42°C，在5XSSPE,0.3%SDS,200嗎/ml剪切的和變性的鮭精DNA，和35%甲酰胺中的雜交。49.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物能夠在低嚴(yán)格性條件下與所述基因的片段雜交。50.權(quán)利要求49的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述低嚴(yán)格性條件是在42。C，在5XSSPE,0.3%SDS,200|ig/ml剪切的和變性的鮭精DNA，和25%甲酰胺中的雜交。51.權(quán)利要求23的寡核苷酸類(lèi)似物，其中作為第一鏈的寡核苷酸類(lèi)似物與所述寡核苷酸類(lèi)似物互補(bǔ)的第二鏈寡核苷酸形成雙鏈，不同的是與5-氮雜-胞嘧啶匹配的堿基殘基是鳥(niǎo)嘌呤。52.權(quán)利要求51的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述第二鏈寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶殘基，并且至少一個(gè)胞嘧啶殘基被5-甲基-胞嘧啶取代。53.權(quán)利要求52的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述第一鏈具有5'-Z-L-G-3'片段，并且所述第二鏈包含與第一鏈中的5'-Z-L-G-3'片段匹配的3'-G-L-C'-5'片段，其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；L是共價(jià)連接Z和G或者G和C'的化學(xué)接頭；和C'是5-甲基-胞嘧啶。54.權(quán)利要求52的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述第一鏈具有5'-G-L-Z-3'片段，并且所述第二鏈包含與第一鏈中的5'-G-L-Z-3'片段匹配的3'-C'-L-G-5'片段，其中Z是5-氮雜-胞嘧啶；G是鳥(niǎo)嘌呤；L是共價(jià)連接Z和G或者G和C'的化學(xué)接頭；和C是5-甲基-胞嘧啶。55.—種寡核苷酸類(lèi)似物，其鹽或其酯，其結(jié)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶上的變構(gòu)位點(diǎn)，并且具有SEQIDNO:25，26,27,28,或29,其中在SEQIDNO:25，26,27，28,或29中的至少一個(gè)胞嘧啶殘基用5-氮雜-胞嘧啶取代。56.權(quán)利要求55的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物是SEQIDNO:30。57.—種寡核苷酸類(lèi)似物，其鹽或其酯，其是至少6個(gè)核苷酸長(zhǎng)；具有至少一個(gè)5-氮雜-胞嘧啶作為堿基殘基；并且在環(huán)境溫度下在水溶液中采取發(fā)夾構(gòu)象。58.權(quán)利要求57的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物具有下述共有的發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中N是任何核苷酸；N'是與N互補(bǔ)的核苷酸；Z是作為堿基殘基的5-氮雜-胞嘧啶；G是作為堿基殘基的鳥(niǎo)嘌呤；1,n,或m是整數(shù)；核苷酸Nn,Nm,N'n,和N'm位于發(fā)夾的干區(qū)；和N,位于發(fā)夾的環(huán)區(qū)。59.權(quán)利要求58的寡核苷酸類(lèi)似物，其中l(wèi),n,或m是大于2,3，4,或5的整數(shù)。60.權(quán)利要求58的寡核苷酸類(lèi)似物，其中1是2，3,4,5，或6。61.權(quán)利要求58的寡核苷酸類(lèi)似物，其中當(dāng)Nn,Nm,或N,具有一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶殘基時(shí)，所述胞嘧啶殘基的至少一個(gè)被5-氮雜-胞嘧啶取代。62.權(quán)利要求58的寡核苷酸類(lèi)似物，其中當(dāng)Nn,Nm,或N,具有一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶殘基時(shí)，至少一個(gè)所述胞嘧啶殘基被5-甲基-胞嘧啶取代。63.權(quán)利要求58的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中C'是5-甲基-胞苷或5-甲基-2'-脫氧胞苷。64.權(quán)利要求58的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述寡核苷酸類(lèi)似物是SEQIDNO:31，并且具有下述發(fā)夾構(gòu)象<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中D是地西他濱，A是腺苷或2'-脫氧腺苷，T是胸苷或2'-脫氧胸苷，和在核苷酸位置21的C任選地用5-甲基-2'-脫氧胞苷取代。65.權(quán)利要求57的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述環(huán)境溫度是約20-25°C。66.權(quán)利要求57的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述水溶液是水或正常的鹽水。67.權(quán)利要求57的寡核苷酸類(lèi)似物，其中所述水溶液是含有20mMHEPES(pH7)，12%甘油，1mMEDTA,4mM二硫蘇糖醇，0.1%乙基苯基聚乙二醇P-40，和3mMMgCl2的緩沖液。68.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1,21,23,55,或57的寡核苷酸類(lèi)似物，或其藥用鹽或酯，和藥用載體。69.按照權(quán)利要求68的藥物組合物，所述權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物或其藥用鹽或酯是以固體形式存在。70.按照權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述藥用載體是水溶液。71.按照權(quán)利要求70的藥物組合物，其中所述水溶液包括選自由下列各項(xiàng)組成的組的可與水混溶的非水性溶劑乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇和它們的組合。72.按照權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述藥用載體是具有少于40%的水的溶液。73.按照權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述藥用載體是具有少于5%的水的溶液。74.按照權(quán)利要求73的藥物組合物，其中所述藥用載體是包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇或它們的組合的溶液。75.按照權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述藥用載體是脂質(zhì)體。76.按照權(quán)利要求75的藥物組合物，其中所述脂質(zhì)體是陽(yáng)離子脂質(zhì)體。77.按照權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述藥物組合物是以乳劑形式存在。78.按照權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述乳劑包括陽(yáng)離子乳化劑。79.—種試劑盒，其包括包含權(quán)利要求1,21,23，55，或57的寡核苷酸類(lèi)似物、其鹽或酯的第一容器。80.權(quán)利要求79的試劑盒，其還包括包含稀釋劑的第二容器，所述稀釋劑包括水、甘油、丙二醇、聚乙二醇或它們的組合。81.權(quán)利要求80的試劑盒，其還包括描述怎樣給需要其的宿主施用所述寡核苷酸類(lèi)似物、其鹽或其酯的書(shū)面使用說(shuō)明。82.—種用于抑制細(xì)胞中的DNA甲基化的方法，其包括-將所述細(xì)胞與權(quán)利要求1,21,23，55,或57的寡核苷酸類(lèi)似物、其鹽或其酯接觸，以致所述細(xì)胞的DNA甲基化活性被抑制。83.權(quán)利要求82的方法，其中所述細(xì)胞存在于體外細(xì)胞培養(yǎng)物中。84.權(quán)利要求82的方法，其中所述細(xì)胞存在于體外組織部分中。85.權(quán)利要求82的方法，其中所述細(xì)胞存在于體內(nèi)組織中。86.權(quán)利要求82的方法，其中所述接觸步驟包括將所述細(xì)胞與生物有效量的權(quán)利要求1的寡核苷酸類(lèi)似物、其鹽或酯接觸，以致所述細(xì)胞的至少50%的DNA甲基化活性得到抑制。87.—種治療患有與異常DNA甲基化相關(guān)的疾病的患者的方法，其包括給所述患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的權(quán)利要求1,21,23,55,或57的寡核苷酸類(lèi)似物、其鹽或其酯，和藥用載體。88.按照權(quán)利要求87的方法，其中所述藥物組合物是通過(guò)口服、腸胃外、局部、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、透皮、舌下、肌內(nèi)、直腸、經(jīng)頰、鼻內(nèi)、脂質(zhì)體、通過(guò)吸入、陰道、眼內(nèi)、通過(guò)局部遞送、皮下、脂肪內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、或鞘內(nèi)施用。89.按照權(quán)利要求87的方法，其中所述藥物組合物是靜脈內(nèi)施用的。90.按照權(quán)利要求87的方法，其中所述藥物組合物是皮下施用的。91.按照權(quán)利要求87的方法，其還包括給患者施用與所述藥物組合物組合的第二治療劑。92.按照權(quán)利要求91的方法，其中所述第二治療劑選自由下列各項(xiàng)組成的組組蛋白脫乙酰酶抑制劑、抗生素藥劑、垸化劑、類(lèi)視黃醇、激素藥劑、植物來(lái)源的藥劑、生物藥劑、白介素、干擾素、細(xì)胞因子、免疫-調(diào)控劑和單克隆抗體。93.按照權(quán)利要求92的方法，其中所述組蛋白脫乙酰酶抑制劑選自由下列各項(xiàng)組成的組曲古抑菌素A、N-辛二酰苯胺異羥肟酸、oxamflatin、辛二酸二異羥肟酸、間-羧基-肉桂酸二異羥肟酸、pyroamide、trapoxinA、apicidin、酯肽、N-(2-氨基苯基)-4-[N-(P比啶-3-基甲氧基羰基)氨基甲基]苯甲酰胺，丁酸,丁酸苯酯和精氨酸丁酸酯。94.按照權(quán)利要求87的方法，其中所述與異常的DNA甲基化相關(guān)的疾病選自由血液疾病、良性腫瘤和癌癥組成的組。95.按照權(quán)利要求94的方法，其中所述血液疾病選自由急性粒細(xì)胞白血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性成淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生異常綜合征和鐮狀細(xì)胞性貧血病組成的組。96.按照權(quán)利要求94的方法，其中所述癌癥選自由下列各項(xiàng)組成的組乳腺癌，皮膚癌，骨癌，前列腺癌，肝癌，肺癌，非小細(xì)胞肺癌，腦癌,喉癌，膽囊癌，胰腺癌，直腸癌，甲狀旁腺癌，甲狀腺癌，腎上腺癌，神經(jīng)組織癌，頭頸癌，結(jié)腸癌，胃癌，支氣管癌，和腎癌，基底細(xì)胞癌，潰瘍和乳突型的鱗狀細(xì)胞癌，轉(zhuǎn)移的皮膚癌，骨肉瘤，Ewing's肉瘤，veticulum細(xì)胞肉瘤，骨髓瘤，巨細(xì)胞瘤，小細(xì)胞肺腫瘤，膽結(jié)石，胰島細(xì)胞瘤，原發(fā)性腦瘤，急性和慢性淋巴和粒細(xì)胞瘤，毛細(xì)胞瘤，腺瘤，增生，骨髓癌，嗜鉻細(xì)胞瘤，粘膜神經(jīng)瘤，腸神經(jīng)節(jié)瘤，增生性角膜神經(jīng)瘤，馬方體型腫瘤,維爾姆斯瘤，精原細(xì)胞瘤，卵巢腫瘤，平滑肌瘤，宮頸發(fā)育異常和原位癌,成神經(jīng)細(xì)胞瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，軟組織肉瘤，惡性類(lèi)癌瘤，局部皮膚損傷，覃樣霉菌病，橫紋肌肉瘤，卡波西肉瘤，骨原性肉瘤，惡性高鈣血癥,腎細(xì)胞瘤，真性紅細(xì)胞增多癥，腺癌，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病，淋巴瘤，惡性黑素瘤，和表皮癌。97.—種下式的化合物，其中R,是選自由下列各項(xiàng)組成的組苯氧基乙酰胺(Pac-NH),O-甲基(OMe),S-甲基(SMe)，S-乙基(SEt),二甲胺(NMe2)，禾H9-荷基甲基氨基甲酸酯(Fmoc-NH);R2是選自由下列各項(xiàng)組成的組二甲氧基tritoxyl(DMTr-O),羥基(OH),O-甲基(OMe)，乙二醇，四乙二醇，六乙二醇，和六乙二醇磷酸酯;R3是選自由下列各項(xiàng)組成的組氰基乙基二異丙基亞磷酰胺，O-甲基(OMe),乙二醇，四乙二醇，和固體支持物；和R4是選自由下列各項(xiàng)組成的組氫，羥基(OH)，O-甲基(OMe),乙二醇，四乙二醇，六乙二醇，和六乙二醇磷酸酯。98.權(quán)利要求97的化合物，其中所述固體支持物是控制孔的玻璃固體支持物或聚苯乙烯。99.一種制備結(jié)合5-氮雜-胞嘧啶作為堿基殘基的二核苷酸類(lèi)似物的方法，其包括將權(quán)利要求97中的化合物與附著到固體支持物上的3'-或5'-保護(hù)的核苷反應(yīng)，以生成附著到所述固體支持物上的保護(hù)的二核苷酸類(lèi)似物；和將所述保護(hù)的二核苷酸類(lèi)似物去保護(hù)，以生成二核苷酸類(lèi)似物。100.權(quán)利要求99的方法，其中所述附著到固體支持物上的核苷是附著到固體支持物上的下列各項(xiàng)3'-或5'-保護(hù)的鳥(niǎo)苷、胞苷、腺苷、胸苷、尿苷、肌苷、5-甲基-胞苷，5-氮雜-胞苷，2'-脫氧鳥(niǎo)苷，2'-脫氧胞苷，2'-脫氧腺苷，2'-脫氧胸苷，2'-脫氧尿苷，2'-脫氧肌苷，5-甲基-2'-脫氧胞苷，或5-氮雜-2'-脫氧胞苷。101.權(quán)利要求99的方法，其中所述固體支持物是控制孔的玻璃固體支持物，或聚苯乙烯固體支持物。102.—種制備結(jié)合5-氮雜-胞嘧啶作為堿基殘基的二核苷酸類(lèi)似物的方法，其包括下列步驟將權(quán)利要求97中的其中R3是固體支持物的化合物與3'-或5'-保護(hù)的核苷反應(yīng)，以生成附著到所述固體支持物上的保護(hù)的二核苷酸類(lèi)似物；和將所述保護(hù)的二核苷酸類(lèi)似物去保護(hù)，以生成二核苷酸類(lèi)似物。103.權(quán)利要求102的方法，其中所述附著到固體支持物上的核苷是附著到固體支持物上的下列各項(xiàng)3'-或5'-保護(hù)的鳥(niǎo)苷、胞苷、腺苷、胸苷、尿苷、肌苷、5-甲基-胞苷，5-氮雜-胞苷，2'-脫氧鳥(niǎo)苷，2'-脫氧胞苷，2'-脫氧腺苷，2'-脫氧胸苷，2'-脫氧尿苷，2'-脫氧肌苷，5-甲基-2'-脫氧胞苷，或5-氮雜-2'-脫氧胞苷。104.權(quán)利要求102的方法，其中所述固體支持物是控制孔的玻璃固體支持物，或聚苯乙烯固體支持物。105.—種制備結(jié)合5-氮雜-胞嘧啶作為堿基殘基的寡核苷酸類(lèi)似物的方法，其包括步驟將權(quán)利要求97中的化合物與附著到固體支持物上的3'-或5'-保護(hù)的核苷反應(yīng)，以生成附著到所述固體支持物上的保護(hù)的二核苷酸類(lèi)似物；將所述附著到固體支持物上的保護(hù)的二核苷酸類(lèi)似物與順序的核苷酸結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)，以生成保護(hù)的寡核苷酸類(lèi)似物；和將所述保護(hù)的寡核苷酸類(lèi)似物去保護(hù)，以生成寡核苷酸類(lèi)似物。106.權(quán)利要求105的方法，其中所述附著到固體支持物上的核苷是附著到固體支持物上的下列各項(xiàng)3'-或5'-保護(hù)的鳥(niǎo)苷、胞苷、腺苷、胸苷、尿苷、肌苷、5-甲基-胞苷，5-氮雜-胞苷，2'-脫氧鳥(niǎo)苷，2'-脫氧胞苷，2'-脫氧腺苷，2'-脫氧胸苷，2'-脫氧尿苷，2'-脫氧肌苷，5-甲基-2'-脫氧胞苷，或5-氮雜-2'-脫氧胞苷。107.權(quán)利要求105的方法，其中所述固體支持物是控制孔的玻璃固體支持物，或聚苯乙烯固體支持物。108.權(quán)利要求105的方法，其中所述核苷酸結(jié)構(gòu)單元選自由下列各項(xiàng)組成的組3'-或5'-保護(hù)的2'-脫氧-鳥(niǎo)苷，胞苷，腺苷，胸苷，尿苷，肌苷,和5-氮雜-胞嘧啶亞磷酰胺。109.權(quán)利要求105的方法，其中將權(quán)利要求97中的化合物與附著到固體支持物上的3'-或5'-保護(hù)的核苷反應(yīng)的步驟包括在苯甲硫基四唑存在下，將權(quán)利要求l中的化合物與附著到固體支持物上的核苷反應(yīng)的步驟。110.權(quán)利要求105的方法，其中R2是二甲氧基tritoxyl(DMTr-0);并且將所述保護(hù)的寡核苷酸類(lèi)似物去保護(hù)的步驟包括將所述保護(hù)的寡核苷酸類(lèi)似物在二氯乙酸中去保護(hù)。111.一種制備結(jié)合5-氮雜-胞嘧啶作為堿基殘基的寡核苷酸類(lèi)似物的方法，其包括下列步驟將權(quán)利要求97中的其中R3是固體支持物的化合物與3'-或5'-保護(hù)的核苷反應(yīng)，以生成附著到所述固體支持物上的保護(hù)的二核苷酸類(lèi)似物；將所述附著到固體支持物上的保護(hù)的二核苷酸類(lèi)似物與順序的核苷酸結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)，以生成保護(hù)的寡核苷酸類(lèi)似物；和將所述保護(hù)的寡核苷酸類(lèi)似物去保護(hù)，以生成寡核苷酸類(lèi)似物。112.權(quán)利要求lll的方法，其中所述附著到固體支持物上的核苷是附著到固體支持物上的下列各項(xiàng)3'-或5'-保護(hù)的鳥(niǎo)苷、胞苷、腺苷、胸苷、尿苷、肌苷、5-甲基-胞苷，5-氮雜-胞苷，2'-脫氧鳥(niǎo)苷，2'-脫氧胞苷，2'-脫氧腺苷，2'-脫氧胸苷，2'-脫氧尿苷，2'-脫氧肌苷，5-甲基-2'-脫氧胞苷，或5-氮雜-2'-脫氧胞苷113.權(quán)利要求lll的方法，其中所述固體支持物是控制孔的玻璃固體支持物，或聚苯乙烯固體支持物。114.權(quán)利要求111的方法，其中所述核苷酸結(jié)構(gòu)單元選自由下列各項(xiàng)組成的組2'-脫氧-鳥(niǎo)苷，胞苷，腺苷，胸苷，尿苷，肌苷，5-甲基胞苷和5-氮雜-胞嘧啶亞磷酰胺。全文摘要本發(fā)明提供在寡核苷酸序列中結(jié)合5-氮雜-胞嘧啶，例如，以5-氮雜-2’-脫氧胞苷(地西他濱)或5-氮雜-胞苷的形式存在的寡核苷酸類(lèi)似物。特別地，提供富含地西他濱-脫氧鳥(niǎo)苷島(DpG和GpD)的寡核苷酸類(lèi)似物，以靶向人基因組中的CpG島，特別是在對(duì)異常的過(guò)度甲基化敏感的基因的啟動(dòng)子區(qū)。這樣的類(lèi)似物可以用于調(diào)節(jié)DNA的甲基化，諸如有效抑制胞嘧啶在C-5位置的甲基化。本發(fā)明提供合成這些寡核苷酸類(lèi)似物的方法和調(diào)控核酸甲基化的方法。還提供用于合成所述寡核苷酸類(lèi)似物的亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元，用于合成、配制和施用這些化合物或組合物治療病況如癌癥和血液疾病的方法。文檔編號(hào)C07H21/04GK101282986SQ200680036470公開(kāi)日2008年10月8日申請(qǐng)日期2006年9月25日優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日發(fā)明者帕西特·皮西翁薩,桑吉維·雷德卡申請(qǐng)人:蘇伯儉股份有限公司