技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蜜蜂西奈湖病毒基因組擴(kuò)增引物和擴(kuò)增方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：

西奈湖病毒(lakesinaivirus，lsv)，屬+ssrna病毒，基因組長(zhǎng)約5600bp，目前發(fā)現(xiàn)有7株，lsv1-7。2008年首次發(fā)現(xiàn)于美國(guó)南達(dá)科他(southdakota)的靠近西奈湖(lakesinai)的一個(gè)流動(dòng)養(yǎng)蜂場(chǎng)，隨后研究表明該病毒與蜜蜂群體崩潰失調(diào)病(ccd)的發(fā)生有關(guān)。其中l(wèi)sv2毒性最強(qiáng)，其基因組全長(zhǎng)約5910bp，編碼衣殼蛋白57.3kda，包括3個(gè)開(kāi)放閱讀框，病毒粒子直徑約27nm。lsv可以通過(guò)媒介，食物或糞便傳播，分布于蜜蜂的腸道、胸部、腹部及頭部。但具體病理特征還不清楚。為了研究其病理特征，其純病毒粒子的獲得是關(guān)鍵，但是一般情況下，蜜蜂常攜帶多種病毒或其他病原，因此獲得lsv病毒基因組全長(zhǎng)，構(gòu)建病毒復(fù)制體系是關(guān)鍵。因此，基因組信息的獲得對(duì)于西奈湖病毒研究具有重要意義。目前其基因組信息的獲得是高通量測(cè)序，再拼接，成本高，對(duì)信息生物學(xué)技術(shù)分析要求高，并且得不到序列進(jìn)行后續(xù)研究，只能獲得信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種高靈敏度的蜜蜂西奈湖病毒基因組擴(kuò)增引物和擴(kuò)增方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供蜜蜂西奈湖病毒基因組擴(kuò)增引物，其特征在于，包括六對(duì)擴(kuò)增引物：

引物對(duì)1：lsv-1f：5'-gggaagtttatgcctcctac-3'；

lsv-1r：5'-gatgatcgagaagagctgg-3'；

引物對(duì)2：orf1-f-78：5'-atgaaggttgtcttcttggtttcg-3'；

orf1-r-2615：5'-ttacgcaccttcgtttgggaggt-3'；

引物對(duì)3：rdrp-f-1852：5'-atgatatcaagtcttgtgacgc-3'；

rdrp-r-3720：5'-ttacgcgtaaagaacagacctaaact-3'；

引物對(duì)4：lsv-3630：5'-ttcctcttaccgctatcttaag-3'；

lsv-3903：5'-gcctattaatagacgaaggctg-3'；

引物對(duì)5：cap-f-3738：5'-gtgaatccaccaactacgactac-3'；

cap-r-5300：5'-ttacttagcgtcaaagaagatgt-3'；

引物對(duì)6：lsv-5154f：5'-atctccatgttgccgggtgtagg-3'；

lsv-5909r：5'-gctgtcgcaacaaccaacagcgtt-3'。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種蜜蜂西奈湖病毒基因組的擴(kuò)增方法，其特征在于，分別以上述引物lsv-1f/lsv-1r、orf1-f-78/orf1-r-2615、rdrp-f-1852/rdrp-r-3720、lsv-3630/lsv-3903、cap-f-3738/cap-r-5300和lsv-5154f/lsv-5909r作為擴(kuò)增引物的上下游引物，以蜜蜂西奈湖病毒的rna為模板進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)序，然后再拼接比對(duì)，得到蜜蜂西奈湖病毒基因組全長(zhǎng)序列。

優(yōu)選，所述的rt-pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為：含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，rna模板2μl，其余由雙蒸水補(bǔ)足至20μl。

優(yōu)選，所述的rt-pcr擴(kuò)增，其反應(yīng)條件為：以引物對(duì)lsv-1f/lsv-1r作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)orf1-f-78/orf1-r-2615作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)rdrp-f-1852/rdrp-r-3720作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)lsv-3630/lsv-3903作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)cap-f-3738/cap-r-5300作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)lsv-5154f/lsv-5909r作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，61℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供蜜蜂西奈湖病毒基因組擴(kuò)增引物在擴(kuò)增得到蜜蜂西奈湖病毒基因組序列中的應(yīng)用。

本發(fā)明針對(duì)蜜蜂西奈湖病毒主要致病基因型，根據(jù)基因組所包含的三個(gè)開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)了分段擴(kuò)增策略，并根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物，能有效的擴(kuò)增出蜜蜂西奈湖病毒的全基因組序列。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于蜜蜂及相關(guān)蜂產(chǎn)品、檢驗(yàn)檢疫等具有蜜蜂西奈湖病毒檢測(cè)需求及相應(yīng)的科研領(lǐng)域。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

以下實(shí)施例所使用的蜜蜂西奈湖病毒基因組擴(kuò)增引物，具體如下：

引物對(duì)1：lsv-1f：5'-gggaagtttatgcctcctac-3'；

lsv-1r：5'-gatgatcgagaagagctgg-3'；

引物對(duì)2：orf1-f-78：5'-atgaaggttgtcttcttggtttcg-3'；

orf1-r-2615：5'-ttacgcaccttcgtttgggaggt-3'；

引物對(duì)3：rdrp-f-1852：5'-atgatatcaagtcttgtgacgc-3'；

rdrp-r-3720：5'-ttacgcgtaaagaacagacctaaact-3'；

引物對(duì)4：lsv-3630：5'-ttcctcttaccgctatcttaag-3'；

lsv-3903：5'-gcctattaatagacgaaggctg-3'；

引物對(duì)5：cap-f-3738：5'-gtgaatccaccaactacgactac-3'；

cap-r-5300：5'-ttacttagcgtcaaagaagatgt-3'；

引物對(duì)6：lsv-5154f：5'-atctccatgttgccgggtgtagg-3'；

lsv-5909r：5'-gctgtcgcaacaaccaacagcgtt-3'。

實(shí)施例1：樣本中病毒基因組的擴(kuò)增效果

(1)病毒樣本處理及核酸提?。喝∶鄯湮髂魏《娟?yáng)性樣本，通過(guò)pbs溶液(ph7.4，depc處理)沖洗待處理樣品后，在樣品中加入rna提取液，并按rna提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提樣本中病毒rna共60μl。

(2)基因組分段擴(kuò)增法(即分6段擴(kuò)增，所使用的引物配組如下：lsv-1f/lsv-1r、orf1-f-78/orf1-r-2615、rdrp-f-1852/rdrp-r-3720、lsv-3630/lsv-3903、cap-f-3738/cap-r-5300和lsv-5154f/lsv-5909r，每次rt-pcr反應(yīng)選擇一對(duì)引物)：采用20μl的一步法rt-pcr反應(yīng)體系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，上游引物和下游引物(10μmol/l)各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，樣本rna模版2μl，其余由ddh2o補(bǔ)足。

反應(yīng)條件為：以引物對(duì)lsv-1f/lsv-1r作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)orf1-f-78/orf1-r-2615作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)rdrp-f-1852/rdrp-r-3720作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)lsv-3630/lsv-3903作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)cap-f-3738/cap-r-5300作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min；以引物對(duì)lsv-5154f/lsv-5909r作為引物的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃30s，61℃30s，72℃30s，共30次循環(huán)；72℃最后延伸5min。

(3)電泳、pcr產(chǎn)物序列測(cè)定：取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，1.0％的瓊脂糖凝膠(含0.05‰goldview核酸染料)進(jìn)行電泳，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。按引物對(duì)：lsv-1f/lsv-1r、orf1-f-78/orf1-r-2615、rdrp-f-1852/rdrp-r-3720、lsv-3630/lsv-3903、cap-f-3738/cap-r-5300和lsv-5154f/lsv-5909r，每次rt-pcr的順序，擴(kuò)增條帶依次為500bp、2538bp、1869bp、275bp、1563bp、756bp。

(4)基因組序列拼接與比對(duì)：拼接各段序列，獲得基因組全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度為5909bp。將基因組序列提交genebank進(jìn)行blast分析，結(jié)果表明，所得lsv基因組序列(其核苷酸序列如seqidno.1所示)與genbank登錄號(hào)為：hq888865.2(美國(guó))的lsv2基因組序列達(dá)到94％的相似度。

序列表

<110>廣東省生物資源應(yīng)用研究所

<120>一種蜜蜂西奈湖病毒基因組擴(kuò)增引物和擴(kuò)增方法及其應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>5909

<212>dna

<213>蜜蜂西奈湖病毒

<400>1

gggaagtttatgcctcctacttcctagcatcgattcgtgtggttactggtaattggccgc60

aggtcatcccacacaccatgaaggttgtcttcttggtttcgtttgctgtgttcctcatct120

gtcaggccccacccgtctcgtactggttggaggatctgttagatgagtacaacacgatgt180

gcagttatgagtatgctgctgctgaggcttataacaattttgttcacaagcatcgcgtgg240

ccgcctatgctgccggtgtccgtgttctgcggtaccgtgcaccgtggtattgttttgcgt300

cgcgaagcgttcccgttgtccacccgttttcctggcttatgggtcagtatgacgctacga360

ttgaccgcgttggcacgttgatgcagcgacttgagatcgcgaatgtttcaatttctgacg420

gccttcgcaccgttgccgatactgctctcaaggcttacttttactatcagatcatctggt480

tccagctcttctcgatcatcatgctggtcggtttcttttctgctgtcatttgctctagtc540

gtgtgcgtgttgtccgcatacgcaacagggtacgtggttacagcgtctctgaactgcgct600

ctgattttgaggagagtatgtccgccatattggcccccttatctcgcgggcactcttgtt660

tgaatttccagcgtcgtgtggtcgaatcgtgggccatcgaccaattgcttcgatattttc720

gttgtttccggtctgttgcgtcgtcgcagggcaggtgggcggaagttggtcatcgtctcc780

accgctgctcacctgtcgtcatggatggcgcattcgtgcctgagtatgatcaacgtttca840

gtgcctgccgtcggcacccctccgtttgtccggataggtttgatatccctgccgcgattc900

tcagccatgttgattattacatgactcctgatcagttggccgcgactgtgaccggaccca960

catttatcgtcaatcacgattattcatccactgataccttgtccgttgccgaggtatcct1020

tacggtcggctggtgggttgattaccgccagcgttcgtgatgggcctacttttggccctc1080

atccgtattaccactggtccgacgagggtgttgttgttgcttcttccggtgcgtttcaat1140

actttagaattggacgtctgttcgataccaccctctactatgcatttccaacctctggaa1200

catatgctcgggatgatccttcagctcttcgccgttctaccagcggcgacctccattact1260

attctccgcacgaaaagcgctttgtcagttatacagctgatgatactcattaccatgtct1320

ttggcgttgccgttccgcgttcgttggccgactactgcgctgccactttttgcagagcag1380

ttcgtgatgataagttttatgacagtctgcgttcttactaccagaataggtgtcgggcca1440

tagggtttaccgacgcccgcgacacactgatgctcgacttcatcatccatctgtgcgacg1500

acgctagcttgcgtactttcggcttttcccggttgtcttccgctccttcgtcctggtcgg1560

cttattgcttgtcatggatcctggtcaaggttaatcatatgatgccgctggcccttactt1620

catacgtcctgaatgtgttgcaccggtttttcggcgctaagtctgcgccgtggaactggg1680

caacggttcacctgccaacttatgatatggtgacatcgccatttcggctgaggctgtttg1740

ggcgcaatcctacagtctttaacctcgagcgatttcgtgctgaggccacggttgttggtt1800

cccccaatcgtggccagcctgccgagggtgcctgccaagacgatcacgaacatgatatca1860

agtcttgtgacgcgagtgttgcgtcctgtccctcttccacacccctacctggtgactcct1920

ctacgtcgggatcagtcttattattcgacgacactgccgaccgagttcatgaggatgact1980

cgtccgcgagatcgacgccgtgtcgaggttctcgattacgtgctaacaagagctacccag2040

ggcgcaagtcccgtcgacctgcggaccataactccggcagtgacaaccaaatcgacgttc2100

ctcatcccaagagaaccactcaccccctgtgccccgacccgactgcctcgtgcggacctc2160

atttcttcatgtcagtgtgtgagtcaaatgagtcagtacctactctcttccatgcacact2220

cggtgggaggtgaagatatcacccatgttgttgatccggctctgggagcgtctatatcgc2280

aacggtttagcgcttcgcagttacgcctccttggctggtctatcgacggaattttcaata2340

ctttatctggcgccgccacctcgtcattcgtcgagtcgacgttgttgtgcttatcacgat2400

ttatgcgtgaagtaccgccaactcagcccgttacagaagctcgccgcagtcttctattct2460

gtcgccctcgagagagatttaagggatacgacacctttgacattggattcatgggtatcg2520

cggtaccctcaggcaagacaaagggagttgaggcttgccttcgcgaggttgcaaggcagc2580

actctcgtgcagacctcccaaacgaaggtgcgtaatttcattaaggttgagcccatggcc2640

aagtgttctgatccacgaaacatttcacctcgaagcgatgcgaccctttcgacccttggc2700

ccttatttttccgccatcgagcataatgctgccggtttgccctttctaattaagggatgt2760

gacatggcggctcgtgccgccaagatgcgtgacctccttggttggcctcactattacgag2820

atcgattactctcgttttgatttgtcgataagtgctgaggtcatatctcagtttgagcat2880

gcttggatctcgttggtctacgcccctgatatgcacccgctgttctggcagacgctggtc2940

gccacgttggtcacttcggggtttagtgagtatggcattacctataccctccccggatcg3000

cgttgtagcggcgaccctcatacgtctgttggcaacggcatcctcaatgcgttcctcaca3060

tggcttgtcacgtttgataagggttgctcttattattgtgaaggtgacgacgggattatt3120

ggctgtgcccagcctatttgcgatgagattgagattatacctgacttgggctttatgctc3180

aagattgatcactatgagcatgtcgacgattgttcgttttgcggtatgtacttgttggat3240

gatcgtggatcgctccgcatgtactctgacccggtgcgcacactgtctaagatacacgtg3300

tgctgcgccgatggtctacccaacaatttgatcgtggccaaggctttgagccttctcaat3360

ctgaatccatgcactcccgtcgtcacagccttttgtctccacatactgcgcgtagttcgg3420

tccgtgttgcttaatccgcgaaaccgcaacagacttgctgctgccgttaagcgtgttgct3480

ccgtgggcggtttattttccgtttaattatgagccgttccattctgaaccaaccccagcg3540

atgcgcgccgccttctcggcgcgcacaggtatatctcctgccttgcagatattgtacgag3600

cagtatctcctcaatttaaaatatgtcccttcctcttaccgctatcttaagcgtgatctt3660

gacatagacggtgtccataccgcgttgttgggtgagtttaggtctgttctttacgcgtaa3720

ccaatagaaattatcacgtgaatccaccaactacgactacaaccactacgcgcaccattc3780

gcgccccaaaagttcaactggcgcccaattctgccactcggcgtcggcgtaatcgtcgac3840

gccgtcgacctgccgctactattgctgggcctttgtccatccagccttcgtctattaata3900

ggcgtatggtgtctagggttaccagaaggtccgccgttatcaccgcggccggtctagcgt3960

ggctgcgtcagtatctcaaccctatgggtcccgacacgaccagcgttacgggctaccccg4020

atggttctgctgttactacgtgtatcgcggactattctaacacgtttaatgtgtctttcc4080

cgcccagggaggccctttattgcactgggtcctcctcttcggaaaagcctacccttgtcg4140

acgctgacaattatgccaagatagacaagtggtccacctacgacatcacactatgcgtgc4200

tcgcactacccatgttgcgtaacgttgtgatgcttcgtctctacccgcacacccctactg4260

ctttcgcccttaccgagcagactcccaattttcctcaacgttttccgaactggagtgttt4320

actccgctgatggtactcggttcaacaacggcgatgagcctggttaccttcagtcctatg4380

tttacttgccgaacgttgacaagcatctttctgctgcccggggataccgcttactgtccc4440

gcggcatcaccggtatcttcagtgctcctgctcttgagactcagggattcgttacagctt4500

gccagtatttggctgaggggtctatacaatctcagtccattaagtctgacgctgttcggt4560

ccgtcactgttaatagtgatggtactgttaagaacgttgagtctagctcacaaacagttt4620

cgtcgatgcctcgatatgtgttcccgctagatggagataattgtgctccgtcatccctca4680

ccgaaacttaccatcaggcctatcaatccaaggctactgatggattttacatgcctgtgt4740

tatcatcatcgagggataatcccttccacccaccacagcctagggccattgcagtttatg4800

gctctttcctggcccggggttgcctcgaccctgtttcggaagcccacgaggctgatggcc4860

caactcatgacatttaccgtttgaatgttgccgatgatgtggcaccattgttcaatactg4920

gcgttgtatggtttgagggcatctcacctaaattttctctcaaacttaagactcgaactg4980

tattgcaatatattcctacctccggctctgtcttggctaactttaccagacacgagccta5040

cttacgatcagatagcacttgatgctgctgatcgtctgcgtaacctgatgcctcacgctt5100

accctgccgcatacaacgattggggatggcttggtgatctgcttgattctgccatctcca5160

tgttgccgggtgtaggtactgtgtataacattgccaaaccacttatcaagcctgcgtgga5220

actggcttggaaataaggtgtctgacttctttggaaacccggtggctcgtgatggcgaca5280

tcttctttgacgctaagtaatcggaggcgcaatctctcggcgctagaaatttaacgattt5340

cgatatgccaagtatcttgacgttgtatttcgtctttattgtagtgtggttactggtaat5400

cagtcgcagactgctccacgctatgcgccccagaggttcgtacagttcgatgctcgccac5460

cgaatgcttgcgagtccaacttgagctcgctcgcaaagtggccaattatcttggtgtcga5520

tcacgtttatgtgttcgataccaccgggttctttgacagtgcttctgtccatgtcacctc5580

ccacggtttgcgttaccgcacccgtgaggggcatgtcgctgtgctgtctcagtcagcgca5640

gttgatactgccacgcgctgaccctaatgtgttccagcagatcgccagatgccgactcat5700

caatgctgcctatggcctctgcttggacaccccccagtcagaccgctcggacgctgttga5760

tgtgtccgaccgcggtcgagacgaggttgacggttgattattgcaatcaccgttggccag5820

gctggtaagcctccttaaagtttccccgcaaggtcctgcgtcgatggttgtcgcagggga5880

cgtttaacgctgttggttgttgcgacagc5909