本發(fā)明屬于酶的固定化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酶是一類高效專一的生物催化劑，因其具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、低污染、催化效率高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品、輕工、化工、環(huán)保、能源、生物工程等領(lǐng)域有越來越重要的地位。但游離酶由于蛋白結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，極易受外界環(huán)境條件的影響而失去催化活性，且回收難、分散性差、難以連續(xù)使用，致使其在實(shí)際應(yīng)用中受到很大限制，固定化酶技術(shù)的出現(xiàn)克服了上述游離酶的缺點(diǎn)，而且在實(shí)際應(yīng)用中保留了酶原有的催化特性，甚至對(duì)酶的穩(wěn)定性、分散性及酶的催化活性有顯著提高。因此，通過設(shè)計(jì)和制備高效穩(wěn)定的固定化酶催化劑，提高酶在實(shí)際應(yīng)用過程中的活性、穩(wěn)定性和可操作性，是生物技術(shù)領(lǐng)域重要的研究內(nèi)容之一，受到學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)固定化酶一般將酶分子固定化在常規(guī)載體材料上，但由于常規(guī)載體材料對(duì)酶的底物存在較大的傳質(zhì)阻力，傳統(tǒng)固定化的表現(xiàn)活性較低。納米技術(shù)為酶固定化這一生物技術(shù)傳統(tǒng)領(lǐng)域注入了新的活力。高比表面積、較小的傳質(zhì)阻力和豐富的功能性可使得納米固定化酶催化劑具有高活性和穩(wěn)定性。

申請(qǐng)?zhí)?01610236689.7的中國專利公開了一種酶-金屬離子納米復(fù)合物及其制備方法，該方法通過控制水溶液中金屬離子和酶的濃度形成水溶液中可溶的500nm~1200nm的納米復(fù)合物，經(jīng)干燥即得酶-金屬離子納米復(fù)合物。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，納米復(fù)合物中酶的穩(wěn)定性得到顯著提高，但酶活基本沒有變化，且固定化周期長。

申請(qǐng)?zhí)?01210390877.7的中國專利公開了一種納米介質(zhì)材料的制備方法，以及以該納米介質(zhì)材料為載體的固定化酶，該制備方法是常溫下，以可進(jìn)行溶膠-凝膠反應(yīng)的金屬氧化物前驅(qū)體為原料與鹽酸、水發(fā)生縮聚反應(yīng)的預(yù)水解凝膠，通過加堿調(diào)ph后加模板劑，室溫干燥至恒重即得納米介質(zhì)材料，然后以該納米介質(zhì)材料為載體實(shí)現(xiàn)酶的固定化。

上述及現(xiàn)有的納米固定化酶催化劑的主要形式是在納米載體表面或者內(nèi)部結(jié)合酶分子，所制備的納米固定化酶仍然會(huì)給酶催化過程帶來一定的底物傳質(zhì)阻力，影響酶的表觀活性。采用常溫水相表面活性劑-酶-金屬離子快速共沉淀固定化酶，相比有機(jī)相共沉淀固定化制備的納米復(fù)合體而言，水相體系減少對(duì)酶的傷害，使得酶保留更高的催化活性，相比傳統(tǒng)的合成材料后固定化酶，共沉淀明顯提高酶的蛋白固載量，該表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑兼具酶的生物催化活性和表面活性劑的物理催化活性。因此，采用簡(jiǎn)便、低成本、綠色、條件溫和的方法制備納米固定化酶的研究十分重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑的制備方法與應(yīng)用，該方法采用水相溶液混合法制備，操作簡(jiǎn)單、周期短、條件溫和、成本低廉、酶穩(wěn)定性高、酶活收率高、載體酶分子結(jié)合強(qiáng)度高，兼?zhèn)渖锖臀锢泶呋钚浴?/p>

為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，表面活性劑改性游離酶

配制0.01-1mmol/ml表面活性劑水溶液，室溫下，邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率滴加游離酶水溶液至澄清，得混合液；

步驟2，制備表面活性劑-酶的納米復(fù)合催化劑

將混合液邊攪拌邊滴加速率加至0.01-1mmol金屬離子鹽溶液，室溫下攪拌反應(yīng)30-60min后得表面活性劑-酶的納米復(fù)合催化劑水溶液；

步驟3，將表面活性劑-酶的納米復(fù)合催化劑水溶液離心，并用去離子水沖洗1-3次，洗去未吸附的游離酶，真空冷凍干燥至恒重即可。

作為改進(jìn)的是，所述表面活性劑為脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、甘氨脫氧膽酸納和鵝脫氧膽酸鈉中任一種。

作為改進(jìn)的是，所述金屬離子為co²⁺、ca²⁺、zn²⁺、mn²⁺、ba²⁺、cu²⁺、ni²⁺、sn²⁺、mg²⁺中任一種。

作為改進(jìn)的是，所述游離酶為南極假絲酵母脂肪酶a、南極假絲酵母脂肪酶b、褶皺假絲酵母脂肪酶、豬胰脂肪酶、疏棉狀嗜熱絲抱菌脂肪酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中一種或多種組合，所述游離酶水溶液中游離酶與水的質(zhì)量比為0.1~1:50。

作為改進(jìn)的是，步驟1和步驟2中攪拌速度為100~150rpm。

作為改進(jìn)的是，步驟1中所述游離酶水溶液的添加量為0.005~1ml/ml。

作為改進(jìn)的是，步驟3中離心5~15min，離心時(shí)轉(zhuǎn)速為4000~8000rpm，真空冷凍干燥的真空度為1.3~13pa，溫度為（-85）~（-10）℃。

基于上述所得表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑在水油兩相生物催化中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備方法操作簡(jiǎn)單、周期短、成本低廉、反應(yīng)條件溫和、載體酶分子結(jié)合強(qiáng)度高。本發(fā)明中表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑以沉淀的形式生成，提高了納米復(fù)合催化劑中酶的穩(wěn)定性和活性，同時(shí)兼具生物和物理催化活性，尤其適合用于水相催化、有機(jī)相催化、兩相催化反應(yīng)領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑的掃描電鏡圖；

圖2為實(shí)施例4甘氨脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑的掃描電鏡圖；

圖3為實(shí)施例1脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑與天然游離酶的相對(duì)酶活對(duì)比圖；

圖4位實(shí)施例1中脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑與假絲酵母脂肪酶水解葵花籽油生成的脂肪酸含量。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到，另外，蛋白酶活性的測(cè)定方法：以2%(w/v)酪蛋白（0.05mol/ltris-hcl緩沖液，ph8.0）為底物，將酶和底物分別于反應(yīng)前都置于40℃保溫10min，取0.2ml底物加入到0.2ml適度稀釋的酶液上清中，置于40℃水浴中反應(yīng)10min后，加入0.4ml終止反應(yīng)液（三氯乙酸18g/l）,室溫下靜置15min，12000rpm離心20min，取上清置于紫外分光光度計(jì)中測(cè)定280nm處吸光值，以反應(yīng)零時(shí)加入終止反應(yīng)液的樣品為空白對(duì)照。每單位（u）蛋白酶活定義為,在40℃條件下，1mg酶蛋白每分鐘催化2%（w/v）酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為一個(gè)酶活單位（u/mg）。

實(shí)施例1

一種脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，表面活性劑改性游離酶

配制0.1mmol/ml脫氧膽酸水溶液10ml，室溫下，以120rpm速度邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率滴加20mg/ml假絲酵母脂肪酶水溶液2ml，攪拌至澄清，得混合液；

步驟2，制備表面活性劑-酶的納米復(fù)合催化劑

將混合液邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率加至0.2mmol六水合氯化鈷水溶液，室溫下以120rpm的速度攪拌反應(yīng)30min后得脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液；

步驟3，將脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水沖洗2次，洗去未吸附的游離酶，真空冷凍干燥至恒重即可。

本實(shí)施例制備的脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑在電鏡下的掃描圖如圖1所示，從圖中可以看出，該催化劑為500nm左右的球狀體。通過bardford法測(cè)離心后的上清液中的剩余蛋白濃度的方式，測(cè)得該催化劑的酶蛋白負(fù)載量為1.6%，另外，本實(shí)施例納米復(fù)合催化劑中酶的相對(duì)活力較游離酶提高3.8倍，比表面積為29.78m²/g，平均孔徑為18.16nm。

實(shí)施例2

一種脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，表面活性劑改性游離酶

配制0.1mmol/ml脫氧膽酸水溶液10ml，室溫下，以120rpm速度邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率加20mg/ml木瓜蛋白酶水溶液2ml，攪拌至澄清，得混合液；

步驟2，制備表面活性劑-酶的納米復(fù)合催化劑

將混合液邊攪拌邊滴加至0.2mmol四水合氯化錳水溶液，室溫下以120rpm的速度攪拌反應(yīng)30min后得脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液；

步驟3，將脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水沖洗2次，洗去未吸附的游離酶，真空冷凍干燥至恒重即可。

本實(shí)施例制備的脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑，通過bardford法測(cè)離心后上清液中剩余蛋白濃度的方式，測(cè)的該催化劑的酶蛋白負(fù)載量為0.15%，另外，本實(shí)施例納米復(fù)合催化劑中酶的相對(duì)活力較游離酶提高1.6倍，比表面積為32.56m²/g，平均孔徑為8.64nm。

實(shí)施例3

一種脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-ba²⁺納米復(fù)合催化劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，表面活性劑改性游離酶

配制0.1mmol/ml脫氧膽酸水溶液10ml，室溫下，以120rpm速度邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率滴加20mg/ml木瓜蛋白酶水溶液2ml，攪拌至澄清，得混合液；

步驟2，制備表面活性劑-酶的納米復(fù)合催化劑

將混合液邊攪拌邊滴加至0.2mmol二水合氯化鋇水溶液，室溫下以120rpm的速度攪拌反應(yīng)30min后得脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-ba²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液；

步驟3，將脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-ba²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水沖洗2次，洗去未吸附的游離酶，真空冷凍干燥至恒重即可。

本實(shí)施例制備的脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-ba²⁺納米復(fù)合催化劑，通過bardford法測(cè)上清液中的剩余蛋白濃度的方式，測(cè)的該催化劑的酶蛋白負(fù)載量為0.8%，另外，本實(shí)施例納米復(fù)合催化劑中酶的相對(duì)活力較游離酶提高1.5倍，比表面積為31.21m²/g，平均孔徑為9.89nm。

實(shí)施例4

一種甘氨脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，表面活性劑改性游離酶

配制0.1mmol/ml甘氨脫氧膽酸鈉水溶液10ml，室溫下，以120rpm速度邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率滴加20mg/ml木瓜蛋白酶水溶液2ml，攪拌至澄清，得混合液；

步驟2，制備表面活性劑-酶的納米復(fù)合催化劑

將混合液邊攪拌邊滴加至0.2mmol四水合氯化錳水溶液，室溫下以120rpm的速度攪拌反應(yīng)30min后得脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液；

步驟3，將脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水沖洗2次，洗去未吸附的游離酶，真空冷凍干燥至恒重即可。

本實(shí)施例制備的甘氨脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑，通過bardford法測(cè)離心后上清液中剩余蛋白濃度的方式，測(cè)的該催化劑的酶蛋白負(fù)載量為0.13%，另外，本實(shí)施例納米復(fù)合催化劑中酶的相對(duì)活力較游離酶提高1.8倍，比表面積為29.78m²/g，,平均孔徑為8.16nm。

實(shí)施例5

用實(shí)施例1所得脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑與假絲酵母脂肪酶在油水兩相中水解葵花籽油的催化應(yīng)用，包括以下步驟：

第一步，取100ml的錐形瓶，加入40mlph7.0的磷酸緩沖液、2ml的葵花籽油、100μl的游離crl或者含有相等蛋白含量的crl-msnc；

第二步，將步驟1中得到的混合物，水浴45°c，以120rpm的速率攪拌反應(yīng)；

第三步，攪拌反應(yīng)180min后，用0.02mol/l的naoh溶液滴定反應(yīng)生成的脂肪酸，其中使用酚酞作為指示劑。

通過滴定消耗的naoh溶液的含量來計(jì)算出葵花籽油水解生成的脂肪酸總量，測(cè)得脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑可以催化水解葵花籽油生成0.88mmol的脂肪酸，是假絲酵母脂肪酶催化生成脂肪酸量的4倍，驗(yàn)證了本發(fā)明制備得到的表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑在油水兩相中有更優(yōu)越的催化效率。

通過實(shí)施例1-4可以看出，本發(fā)明的制備方法條件溫和，綠色環(huán)保，簡(jiǎn)單快速，固定化酶的酶活較高，載體與酶分子結(jié)合強(qiáng)度高，不同的表面活性劑-金屬離子對(duì)不同的酶有不同的作用效果，脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑中酶的相對(duì)活力較游離酶提高3.8倍，脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑中酶的相對(duì)活力較游離酶提高1.6倍，脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-ba²⁺納米復(fù)合催化劑中酶的相對(duì)活力較游離酶提高1.5倍，甘氨脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑中酶的相對(duì)活力較游離酶提高1.8倍，通過實(shí)施例5可以看出，本發(fā)明制備得到的表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑在油水兩相生物催化中有更優(yōu)越的催化效率，有著廣泛的應(yīng)用前景。