本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種基于肝癌循環(huán)腫瘤細胞生物凝膠懸滴培養(yǎng)法建立肝癌異種移植瘤模型的方法。

背景技術(shù)：

腫瘤細胞可以從病灶脫落入血形成腫瘤細胞在150年前就已經(jīng)被揭示出來，但是該領(lǐng)域在過去的一百多年間幾乎沒有重大的發(fā)現(xiàn)，原因是ctc在血液中十分稀有，如何富集和鑒定外周血中的腫瘤細胞一度成為極大的技術(shù)瓶頸。在相當長的一段時間內(nèi)，ctc的研究都停滯于通過pcr或流式手段檢測全血中特異性的腫瘤分子表達，從而反應(yīng)外周血循環(huán)腫瘤細胞數(shù)。但這種方法可靠性極低，僅以肝癌為例，在患者外周血中檢測afpmrna表達量曾成為定義hcc-ctc豐度的指標，但在實際應(yīng)用中，大量肝炎、肝硬化乃至肝移植圍手術(shù)期的患者外周血中均檢測到高峰度的afpmrna，其特異性令人難以滿意。隨著新型激光技術(shù)與納米磁粒子技術(shù)的進步，這一問題近年來以得到解決。2004年美國食品和藥品管理局(foodanddrugsadmistration,fda)批準了cellsearch系統(tǒng)用于檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血ctc，成為第一個獲準進入臨床運用的ctc檢測方法。這一系統(tǒng)通過epcam磁珠在外周血中捕獲ctc并進行染色，通過細胞熒光對dapi+/ck+/cd45-的細胞進行計數(shù)。此后基于微流控芯片技術(shù)、免疫磁珠分選技術(shù)的ctc檢測手段逐漸涌現(xiàn)，ctc與多種腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的聯(lián)系被逐步揭示。

目前現(xiàn)有的技術(shù)依然無法滿足ctc研究和臨床診斷的需要。從腫瘤患者體內(nèi)可以富集的ctc數(shù)目極少，一般10ml血中只能捕獲數(shù)十個ctc，必須通過培養(yǎng)擴增才可以進行功能研究。雖然目前有報道可以通過濾膜技術(shù)大量富集ctc移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)建立pdx模型(patient‐derivedxenograft)，并且通過這一模型研究人員在乳腺癌、前列腺癌與結(jié)腸癌中開展了大量功能實驗，特別是耐藥研究。但是從目前報道來看，這種方法需要患者大量的外周血用于ctc分離，同時建模成功率不高，同時價格昂貴。既然如此，能否給予特定的生產(chǎn)環(huán)境，讓ctc在體外充分生長后，繼而移植裸鼠體內(nèi)建立患者的個體化pdx模型，從而減少建模所需血量，并提高pdx建模成功率，是本發(fā)明研究的重點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于溫敏型生物凝膠懸滴培養(yǎng)肝癌循環(huán)腫瘤體系的構(gòu)建異種移植瘤的方法，具體是通過該培養(yǎng)體系，可以體外對肝癌患者的循環(huán)腫瘤細胞進行擴增，并形成多細胞克隆，挑取該克隆接種裸鼠可以在皮下、肝內(nèi)和肺部形成腫瘤，建成異種移植瘤模型；本發(fā)明還提供溫敏型生物凝膠培養(yǎng)上清的制備方案與配方。

本發(fā)明以溫敏型凝膠以羥丁基殼聚糖和泊洛沙姆(poloxamer)為骨架，添加了腫瘤細胞所在的細胞外基質(zhì)(ecm)所含有的iv型膠原、透明質(zhì)酸與硫酸氨基葡糖多聚糖等組分，充分模擬腫瘤在體內(nèi)的生長環(huán)境，使肝癌ctc可以在凝膠中生長，并通過分泌iv型膠原酶溶解部分機制，形成顯微鏡下可見的克隆環(huán)，方便鏡下挑取克隆。為了促進該體系中的ctc能夠進一步擴增，本發(fā)明分離了5例肝癌患者腫瘤相關(guān)成纖維細胞(taf)，以人包皮成纖維細胞(hff)為對照，進行表達譜芯片分析，篩選出肝癌taf中特異性高表達的20種生長因子或細胞因子(圖1)。之后按照yamanaka篩選ips關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的策略，逐一剔除來觀察ctc表型，最后篩選到5種細胞因子的組合，包括egf、fgf、kgf等，共同加入后會有部分ctc出現(xiàn)顯著的表型變化，發(fā)生顯著擴增。

本發(fā)明的第一方面，提供一種用于肝癌ctc溫敏型生物凝膠懸滴培養(yǎng)法的試劑，包括溫敏型生物凝膠和懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)上清，所述的溫敏型生物凝膠，由體積比為8:1:1的a液、b液和c液組成(混合時是將a液、b液和c液三種液體按比例逐一混合，并用無菌鉑金棒攪拌均勻，全過程在冰上操作)；

所述的a液，包括生物凝膠的骨架溶液和基質(zhì)溶液，7ml骨架溶液與1ml基質(zhì)溶液在冰上混合，并用無菌鉑金棒攪拌均勻，4℃保存，即得a液；

所述的生物凝膠的骨架溶液：使用親水鏈聚氧乙烯占60％以上的泊洛沙姆，配置體積分數(shù)為20-45％的泊洛沙姆溶液；配置體積分數(shù)為0.2-0.7％的羥丁基殼聚糖溶液；兩種液體在冰上冰浴15min后，將兩者按體積比1：1充分混合，獲得所述的生物凝膠的骨架溶液；

所述的生物凝膠的基質(zhì)溶液：將0.5-0.8mgiv型膠原、0.01-0.1mg分子量為10000-50000的透明質(zhì)酸和0.01-0.1mg硫酸氨基葡糖多聚糖于1ml超純水中4℃下過夜溶解，獲得生物凝膠的基質(zhì)溶液；

所述的b液組分為10倍濃度的dm/f12培養(yǎng)基，每1mlb液中加入1000-5000iu的rh-egf，作用為調(diào)節(jié)生物凝膠內(nèi)的營養(yǎng)成分和離子濃度；

所述的c液組分為ph＝2.5-3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液(0.025-0.05mol)，作用為調(diào)節(jié)生物凝膠內(nèi)的ph值。

所述的懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)上清(原則上現(xiàn)配現(xiàn)用)，具體配置為：dm/f12培養(yǎng)基中加入8-10％的gibco10099-141胎牛血清，每100ml培養(yǎng)基加入l-谷氨酰胺200mm-500mm；每100ml培養(yǎng)基按如下配方加入細胞因子或生長因子：rh-egf100-2000iu、rh-fgf-1100-2000iu、rh-tgf-α0.1-5μg、rh-igf-10.1-1μg和rh-kgf0.1-1μg。

本發(fā)明的第二方面，提供上述的用于肝癌ctc溫敏型生物凝膠懸滴培養(yǎng)法的試劑在建立肝癌異種移植瘤模型中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三方面，提供一種肝癌ctc溫敏型生物凝膠懸滴培養(yǎng)法，包括以下步驟：

(a)取肝癌患者10ml外周血，ficoll密度梯度離心法分離患者外周血有核細胞；

(b)使用stemcellcd45陰選試劑盒去除白細胞，20μl磷酸鹽緩沖液(pbs)重懸；

(c)上述的溫敏型生物凝膠的a液、b液和c液按比例逐一混合，并用無菌鉑金棒攪拌均勻，加入細胞，全過程在冰上操作(具體為800μla液在冰上先與100μlb液混合，無菌鉑金棒攪拌均勻后，加入100μlc液，再次攪拌均勻，加入20μl細胞懸液，全過程在冰上操作)；

(d)24孔培養(yǎng)板在37℃預(yù)熱30min，細胞凝膠混合液50μl/滴加至預(yù)熱培養(yǎng)板上，使凝膠迅速轉(zhuǎn)化為果凍狀；

(e)37℃、5％co2細胞培養(yǎng)箱中孵育2h，加入37℃預(yù)熱的上述的懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)上清1ml；

(f)連續(xù)培養(yǎng)7天形成克隆環(huán)。

本發(fā)明的第四方面，提供一種基于溫敏型生物凝膠懸滴培養(yǎng)肝癌循環(huán)腫瘤體系的構(gòu)建異種移植瘤的方法，包括以下步驟：

(a)取肝癌患者10ml外周血，ficoll密度梯度離心法分離患者外周血有核細胞；

(b)使用stemcellcd45陰選試劑盒去除白細胞，20μl磷酸鹽緩沖液(pbs)重懸；

(c)上述的溫敏型生物凝膠的a液、b液和c液按比例逐一混合，并用無菌鉑金棒攪拌均勻，加入細胞，全過程在冰上操作(具體為800μla液在冰上先與100μlb液混合，無菌鉑金棒攪拌均勻后，加入100μlc液，再次攪拌均勻，加入20μl細胞懸液，全過程在冰上操作)；

(d)24孔培養(yǎng)板在37℃預(yù)熱30min，細胞凝膠混合液50μl/滴加至預(yù)熱培養(yǎng)板上，使凝膠迅速轉(zhuǎn)化為果凍狀；

(e)37℃、5％co2細胞培養(yǎng)箱中孵育2h，加入37℃預(yù)熱的上述的懸滴培養(yǎng)法培養(yǎng)上清1ml；

(f)連續(xù)培養(yǎng)7天形成克隆環(huán)，4x物鏡下挑取mc克隆，緩沖液稀釋后接種裸鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)建成肝癌異種移植瘤模型；所述的mc克隆是在培養(yǎng)7天后可以形成50個以上細胞構(gòu)成的細胞團的克隆。

優(yōu)選的，所述的步驟f中將挑取的克隆懸浮于100μlhbss緩沖液中，注射于裸鼠皮下，建成ctc裸鼠皮下成瘤pdx模型。

優(yōu)選的，所述的步驟f中將挑取的克隆懸浮于20μlhbss緩沖液中，直接注射于裸鼠肝包膜下(或開腹暴露小部分肝臟后注入肝包膜下)，建成ctc裸鼠肝包膜下成瘤pdx模型。

優(yōu)選的，所述的步驟f中將挑取的克隆懸浮于100μlhbss緩沖液中，取細胞懸液于裸鼠的尾靜脈回輸，建成ctc裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移pdx模型。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明經(jīng)實驗證明，肝癌循環(huán)腫瘤細胞在本發(fā)明的溫敏型生物凝膠體系中，可以進行進一步擴增生長，并增強其在免疫缺陷鼠中的成瘤能力。

2、該體系培養(yǎng)出的mc型克隆，在裸鼠中具有良好的肝包膜下成瘤能力(＞90％)，裸鼠皮下成瘤能力(≈60％)，和一定能力的肺部成瘤能力(≈20％)。

3、本發(fā)明為建立肝癌異種移植瘤動物模型，對肝癌的個體化治療提供模式動物。

4、本發(fā)明制備方法簡單，工藝成熟，成本較低。

附圖說明

圖1是5例肝癌患者腫瘤相關(guān)成纖維細胞與3例人包皮成纖維細胞表達譜分析，數(shù)據(jù)分析調(diào)用r語言中的deseq函數(shù)包，參數(shù)設(shè)置為padj＜0.01，log2(foldchange)＞2。截取高表達基因top20生成熱圖。

圖2是懸滴法培養(yǎng)肝癌ctc7天后，兩種不同形態(tài)ctc克?。簃c與oc。mc型表現(xiàn)出很強的增殖能力，在培養(yǎng)7天后可以形成50個以上細胞構(gòu)成的細胞團，部分增殖能力較強的克隆細胞數(shù)可達10⁴數(shù)量級(圖2.a)；oc型增殖能力差，一般在培養(yǎng)的第3天就停止生長，細胞數(shù)通常在20個以內(nèi)(圖2.b)外周一圈折光度不同的圓環(huán)命名為“克隆環(huán)”(白色箭頭所示)，是由肝癌ctc在生長過程中分解基質(zhì)膠中的ecm成分所形成。

圖3是6個mc型克隆分別接種裸鼠肝包膜下3周形成的腫瘤。

圖4是6個oc型克隆分別接種裸鼠肝包膜下3周，無法形成腫瘤。

圖5是一例mc型克隆接種肝包膜下后形成腫瘤的he染色檢測。左邊是正常的肝組織，右側(cè)是肝癌組織。

圖6是兩例mc型克隆裸鼠尾靜脈注射后成功形成肺部轉(zhuǎn)移。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

除非另有描述，本發(fā)明的實施將采用分子生物學、微生物學、重組dna和免疫學的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻中有完整的描述：例如，sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989)；《dna克隆》第i和ii卷(d.n.glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(m.j.gait編輯，1984)；《核酸雜交》(b.d.hames和s.j.higgins編輯.1984)；《蛋白質(zhì)純化：原理和實踐》第2版(springer-verlag，n.y.)，以及《實驗免疫學手冊》i-iv卷(d.c.weir和c.c.blackwell編輯1986)?；蛘撸砂凑赵噭┥a(chǎn)商所提供的說明書進行。

除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1：一例肝癌患者術(shù)前ctc培養(yǎng)結(jié)果

1.實驗方法：

(1)抽取該患者10ml術(shù)前外周血，與hbss緩沖液1:1混合，置于50ml離心管中。在另一50ml離心管中加入10mlficoll密度梯度液，將稀釋后的外周血輕輕加至密度梯度液上，使其形成明顯的分層。2000rpm室溫離心20min，此時液體分為4層，用3ml巴氏滴管吸取有核細胞層，加入10mlhbss緩沖液中，1000rpm離心5min收集細胞并充分去除上清，加入1mlhbss(含有2％血清)重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至5ml無菌流式管中。

(2)加入stemcellcd45陰選磁珠20μl，輕柔混勻后室溫孵育15min，將其放入磁場中，靜置30min，輕柔吸取全部上清，轉(zhuǎn)移至新的5ml無菌流式管中，重復(fù)上述步驟一次。1000rpm離心5min收集細胞，充分去除上清，20μl磷酸鹽緩沖液(pbs)重懸。

(3)800μl生物凝膠a與100μlb液和100μlc液，按已經(jīng)闡明的步驟混合后，加入20μl細胞懸液，全過程在冰上操作。

(4)24孔培養(yǎng)板在37℃預(yù)熱30min，細胞凝膠混合液按50μl/滴加至預(yù)熱培養(yǎng)板上，使凝膠迅速轉(zhuǎn)化為果凍狀。之后培養(yǎng)板在37℃、5％co2細胞培養(yǎng)箱中孵育2h，使凝膠充分凝固。

(5)2h后，沿培養(yǎng)板孔壁緩慢加入37℃預(yù)熱的培養(yǎng)上清1ml。

(6)連續(xù)培養(yǎng)7天后，10x物鏡下進行克隆環(huán)拍照。

2.實驗結(jié)果：

實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)有活性的循環(huán)腫瘤細胞在培養(yǎng)48h后，會開始出現(xiàn)顯著增殖，并部分消化周圍3d基質(zhì)在鏡下形成折射度不同的“克隆環(huán)”(圖2.a，b中白色箭頭所示)。進一步的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，這些克隆分為典型的兩種形態(tài)，我們分別將其命名為“multi-cellarclone(mc)”與“oligo-cellarclone(oc)”。mc型表現(xiàn)出很強的增殖能力，在培養(yǎng)7天后可以形成50個以上細胞構(gòu)成的細胞團，部分增殖能力較強的克隆細胞數(shù)可達10⁴數(shù)量級(圖2.a)；oc型增殖能力差，一般在培養(yǎng)的第3天就停止生長，細胞數(shù)通常在20個以內(nèi)(圖2.b)。

實施例2：7例肝癌患者外周血mc與oc型克隆裸鼠皮下成瘤能力檢測

1.實驗方法：

(1)抽取該患者10ml術(shù)前外周血，與hbss緩沖液1:1混合，置于50ml離心管中。在另一50ml離心管中加入10mlficoll密度梯度液，將稀釋后的外周血輕輕加至密度梯度液上，使其形成明顯的分層。2000rpm室溫離心20min，此時液體分為4層，用3ml巴氏滴管吸取有核細胞層，加入10mlhbss緩沖液中，1000rpm離心5min收集細胞并充分去除上清，加入1mlhbss(含有2％血清)重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至5ml無菌流式管中。

(2)加入stemcellcd45陰選磁珠20μl，輕柔混勻后室溫孵育15min，將其放入磁場中，靜置30min，輕柔吸取全部上清，轉(zhuǎn)移至新的5ml無菌流式管中，重復(fù)上述步驟一次。1000rpm離心5min收集細胞，充分去除上清，20μl磷酸鹽緩沖液(pbs)重懸。

(3)800μl生物凝膠a與100μlb液和100μlc液，按已經(jīng)闡明的步驟混合后，加入20μl細胞懸液，全過程在冰上操作。

(4)24孔培養(yǎng)板在37℃預(yù)熱30min，細胞凝膠混合液按50μl/滴加至預(yù)熱培養(yǎng)板上，使凝膠迅速轉(zhuǎn)化為果凍狀。之后培養(yǎng)板在37℃、5％co2細胞培養(yǎng)箱中孵育2h，使凝膠充分凝固。

(5)2h后，沿培養(yǎng)板孔壁緩慢加入37℃預(yù)熱的培養(yǎng)上清1ml。

(6)連續(xù)培養(yǎng)7天后，4x物鏡下分別挑取兩種克隆，稀釋于100μlhbss緩沖液，注射于6周齡裸鼠背部皮下。3周后麻醉處死裸鼠，檢查腫瘤生長情況。

2.實驗結(jié)果：

挑取的45個mc型克隆中有28個成功生長出腫瘤，成瘤率62.2％，挑取的70個oc型克隆中無一成瘤。結(jié)果如表1所示。

表1是來自7例肝癌患者外周血的mc與oc克隆裸鼠皮下種植結(jié)果

實施例3：ctc裸鼠肝包膜下成瘤pdx模型建立

1.實驗方法：

(1)ctc培養(yǎng)體系中挑取細胞克隆后懸浮于20μlhbss緩沖液中備用；裸鼠異氟烷吸入式麻醉后上腹部剪開0.4～0.5cm切口，暴露小部分肝臟，胰島素注射器將20μl細胞懸液注入肝包膜下，縫合。2周后開腹觀察成瘤狀況。

(2)將腫瘤組織包埋蠟塊，he染色檢測：二甲苯(ⅰ)5-10min，二甲苯(ⅱ)5-10min，95％乙醇(ⅰ)1-3min，95％乙醇(ⅱ)1-3min，80％乙醇1min，蒸餾水1min，蘇木精液染色5-15min，流水稍洗去蘇木精液1-3s，1％鹽酸乙醇1-3s，稍水洗10-30s，促藍液返藍10-30s，流水沖洗10-15min，蒸餾水過洗1-2s，0.5％曙紅液染色1-3min，蒸餾水稍洗1-2s，80％乙醇稍洗1-2s，95％乙醇(ⅰ)3-5min，95％乙醇(ⅱ)3-5min，無水乙醇5-10min，無水乙醇5-10min，二甲苯(ⅰ)3-5min，二甲苯(ⅱ)2-5min，二甲苯(ⅲ)3-5min，中性樹膠封固，顯微鏡檢測。

2.實驗結(jié)果：

6例mc型克隆種植裸鼠肝包膜下，全部形成腫瘤(圖3)；6例oc型克隆種植裸鼠肝包膜下，無一形成腫瘤(圖4)。he檢測mc形成的肝內(nèi)腫瘤，可見典型的肝癌病理形態(tài)(圖5)。

實施例4：ctc裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移pdx模型建立

1.實驗方法：

ctc培養(yǎng)體系中挑取細胞克隆后懸浮于100μlhbss緩沖液中備用；小鼠固定后，將取細胞懸液尾靜脈回輸，3周后處死小鼠，觀察肺部成瘤情況。

2.實驗結(jié)果：

mc和oc進行裸鼠尾靜脈回輸肺轉(zhuǎn)移(10對)。mc全部20％；oc無一成瘤。典型的mc克隆肺部成瘤結(jié)果如圖6所示。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。