本發(fā)明屬于細胞分選用器械及其細胞分選方法，特別是針對循環(huán)血中腫瘤細胞的分選器械及分選方法，具體涉及為一種循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置及分選檢測方法。

背景技術(shù)：

腫瘤轉(zhuǎn)移是造成腫瘤患者死亡的重要原因之一，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者循環(huán)血中腫瘤細胞(CTC)與患者轉(zhuǎn)移和預后密切相關(guān)。對CTC的分選有助于腫瘤轉(zhuǎn)移風險的預測和判斷、為疾病提供重要的預后信息及個體化治療。故從循環(huán)血中去除血細胞，分離純度高的CTC已成為診斷腫瘤、判斷預后的關(guān)鍵。但由于CTC在外周血中數(shù)目極少，而且入血呈現(xiàn)不連續(xù)性，并有很強的異質(zhì)性，CTC分選具有一定挑戰(zhàn)。

現(xiàn)有的CTC分選、檢測方法主要基于腫瘤細胞與其他血細胞在物理性質(zhì)(密度和大小)、特異性抗原表達等方面的差異進行?；谔禺愋钥乖磉_的免疫細胞化學技術(shù)的CellSearch分選富集系統(tǒng)，針對腫瘤細胞表面上皮細胞粘附分子(epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)進行CTC分選，該系統(tǒng)已被美國FDA批準用于檢測乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌CTC。但由于EpCAM局限于上皮來源腫瘤細胞，此外腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，EpCAM和CK表達下調(diào)，也會造成捕獲率下降。因此以上缺陷限制了CellSearch系統(tǒng)CTC的檢測能力。此外該系統(tǒng)價格昂貴，難以在臨床上廣泛使用?；谖锢硇再|(zhì)分選富集具有操作簡便，成本低的特點，但靈敏度相對不足，進行存在特異度、敏感度差，操作繁瑣等問題。

免疫磁珠分選技術(shù)是一種新的細胞分離技術(shù)，是基于細胞表面抗原能與磁珠表面包被具有免疫原性的抗體特異性結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞吸附聚集，無該種表面抗原的細胞由于不能與磁珠特異性結(jié)合而不具有磁性，從而將細胞分離。除此之外，免疫磁珠體積小，在細胞培養(yǎng)中能生物降解而無需進行專門的去除，并不影響細胞活性。而且現(xiàn)有的微流控芯片技術(shù)可以初步實現(xiàn)細胞的分選。如果能將微流控芯片技術(shù)及免疫磁珠分選技術(shù)合理聯(lián)合定能為檢測CTC提供一種更為高效的方法。

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的CTC分選純化技術(shù)成本高，靈敏度低，特異性差等問題，將微流控芯片技術(shù)與免疫磁珠分選技術(shù)進行聯(lián)合，提供一種循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置及分選檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的CTC分選純化技術(shù)成本高，靈敏度低，特異性差等問題，本發(fā)明將微流控芯片技術(shù)與免疫磁珠分選技術(shù)進行聯(lián)合提供一種循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置及其循環(huán)血腫瘤細的檢測方法。

一種循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置，包括分選結(jié)構(gòu)、純化結(jié)構(gòu)及控制結(jié)構(gòu)；其特征在于，所述控制結(jié)構(gòu)伸出導線連接分選結(jié)構(gòu)及純化結(jié)構(gòu)；控制結(jié)構(gòu)控制分選結(jié)構(gòu)及純化結(jié)構(gòu)，所述分選結(jié)構(gòu)包括微流控芯片，雙噴氣壓泵、氮氣罐、顯微鏡，各部分連接構(gòu)建自動化氣壓泵壓力驅(qū)動微流控芯片系統(tǒng)；所述微流控芯片內(nèi)包含一到數(shù)列陣列通道；所述陣列通道包括兩側(cè)微陣列柱形成的小細胞過道，及兩側(cè)微柱陣列中間的大細胞過道，小細胞過道匯集一個出口，大細胞過道匯集一個出口；所述純化結(jié)構(gòu)包括純化芯片，永磁鐵，供永磁鐵運動的兩個帶軌道的步進電機，永磁鐵設置于純化芯片下方，兩個步進電機垂直設置，且一個步進電機設置在另一個步進電機上；永磁鐵設置于一個步進電機上，控制結(jié)構(gòu)控制步進電機的運動；微流控芯片通過管狀結(jié)構(gòu)連接純化芯片，控制結(jié)構(gòu)包括電源，控制單元，電路板。本裝置的小細胞過道通過的是白細胞等小細胞，大細胞過道通過的是腫瘤細胞及少量白細胞。本裝置可以實現(xiàn)微陣列芯片及免疫磁珠技術(shù)的結(jié)合，將通過微陣列的大細胞過道的循環(huán)血細胞移入純化芯片，并通過在純化芯片內(nèi)加入免疫磁珠，兩步進電機帶動永磁鐵運動，達到充分混合的目的，最后通過固定永磁鐵將白細胞吸附于底部，在上清液中得到純化的腫瘤細胞。

進一步，所述分選結(jié)構(gòu)還包括支撐件，支撐件支撐微流控芯片。用于支撐微流控芯片到一定高度，支撐件支撐微流控芯片可以更好的穩(wěn)定微流控芯片。

進一步，陣列通道兩側(cè)微陣列柱可以為任意形狀的微陣列柱，如平行四邊形，正方形，三角形等；其中優(yōu)選的微陣列柱為正三角形微陣列柱，正三角形微陣列柱之間形成小細胞過道，及微陣列柱中間為大細胞過道。

進一步，正三角形微柱的邊長為25um，柱子水平的間距為30um，垂直間距為20um，陣列的前斜角為3.2°。

進一步，微流控芯片與純化芯片水平高度相同。

進一步，一個步進電機上設置永磁鐵，永磁鐵通過設置在軌道上的滑塊設置在步進電機軌道上；而設置永磁鐵的步進電機通過另一個步進電機軌道上的支撐塊設置在另一步進電機軌道上。

進一步，所述純化芯片包括三層結(jié)構(gòu)，為底板層，凹槽層及入口出口設置層；底板層位于最下方，凹槽層位于中間，入口出口設置層設置在最上方，凹槽層的凹槽圍成反應室；入口出口層上對應反應室的位置設置入口與出口。

進一步，所述純化芯片可設置任意適合大小，其中優(yōu)選大小50mm×40mm，入口出口設置層上入口出口的優(yōu)選孔徑為1.5mm，反應室的容積可設置任意合理的范圍，其中優(yōu)選反應室尺寸11mm×7mm×3mm或者20mm×10mm×3mm。

進一步，所述微流控芯片包括底層與芯片層，芯片層上設置一到數(shù)個列陣列通道及出入口。

進一步，所述微流控芯片長70-80mm，寬20-30mm。

進一步，所述單個陣列通道長68mm，寬3.5mm，高50um。

進一步，所述永磁鐵形狀為圓柱形，其設置于純化芯片反應室的下方。

進一步，所述單個陣列通道設置兩個入口，兩個出口；兩入口一個為分選細胞入口，另一個為緩沖液入口；兩個出口一個為需純化細胞出口，及一個廢液出口，廢液出口連通小細胞過道，需純化細胞出口連通大細胞過道。

進一步，各陣列通道的分選細胞入口相通，緩沖液入口相通，廢液出口相桶，各需純化出口相通，但不同名稱的出入口并不相通；最終在微流控芯片表層匯成兩個入口一個為總分選細胞入口，另一個為總緩沖液入口，兩個出口分別為總廢液出口及總需純化細胞出口。

進一步，所述總需純化細胞出口通過管狀結(jié)構(gòu)連接純化芯片上的入口。

進一步，所述分選細胞為含腫瘤細胞的血液；所述需純化細胞為腫瘤細胞及白細胞。

進一步，所述微流控芯片采用PDMS材料及軟光刻技術(shù)制備。

進一步，所述純化芯片由PMMA材料制成。

進一步，所述管狀結(jié)構(gòu)為軟管6。

本發(fā)明還公開了上述循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置的制備方法：

分選結(jié)構(gòu)的制備：

1)微流控芯片的制備：設計正三角形微陣列柱結(jié)構(gòu)，采用PDMS材料及軟光刻技術(shù)進行芯片制作；按照設計的圖形制作掩膜；

2)將雙噴氣壓泵、氮氣罐、制作好的DLD芯片，控制結(jié)構(gòu)和顯微鏡連接起來，構(gòu)建自動化的氣壓泵壓力驅(qū)動微流控芯片系統(tǒng)。

純化結(jié)構(gòu)的制備：

1)純化芯片的制備：選擇聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料，通過注塑成型方法制作而成的。應用激光雕刻機對芯片的反應室，入口及出口進行激光刻蝕。將三層制備好的單層芯片通過熱壓法鍵和。

2)將步進電機，支撐結(jié)構(gòu)，純化芯片及控制結(jié)構(gòu)組裝。

最后，將分選結(jié)構(gòu)、純化結(jié)構(gòu)與控制結(jié)構(gòu)連接，并通過管狀結(jié)構(gòu)將微流控芯片與純化芯片連接。

本發(fā)明還公開了一種分選檢測循環(huán)血腫瘤細胞的方法，具體包括：

1)將帶腫瘤細胞的外周血及緩沖液引入微流控芯片內(nèi)；

2)打開控制結(jié)構(gòu)的開關(guān)，分選細胞通過大細胞過道與小細胞過道進行分選；

3)通過大細胞過道的需純化細胞通過微流控芯片上的總需純化細胞出口經(jīng)管狀結(jié)構(gòu)進入純化芯片入口，經(jīng)過小細胞過道的細胞被廢棄；

4)在純化芯片的反應室內(nèi)加入免疫磁珠；

5)啟動純化裝置的步進電機，帶動永磁鐵運動，使免疫磁珠與白細胞充分混合一定時間，并有效結(jié)合，使其下部在永磁鐵的吸引作用下位于反應室下方，上清液中的細胞即為腫瘤細胞；

6)將上清液取出放入培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)并進行鑒定。

7)通過免疫抗原抗體反應進行檢測，最后在熒光顯微鏡下觀察細胞的不同顯色情況，進而將CTC與白細胞鑒定。

進一步，所述緩沖液為PBS緩沖液。

進一步，將帶腫瘤細胞的外周血通過微流控芯片上的分選細胞入口進入芯片，所述PBS緩沖液通過緩沖液入口進入芯片內(nèi)，由氣壓泵控制液體的流速。

進一步，所述管狀結(jié)構(gòu)為設置于微流控芯片需純化細胞出口及純化芯片入口之間的軟管結(jié)構(gòu)，軟管結(jié)構(gòu)為用于運輸?shù)墓艿澜Y(jié)構(gòu)。

進一步，所述的免疫磁珠為CD45免疫磁珠。

進一步，所述培養(yǎng)基為鼠尾膠原蛋白培養(yǎng)基。

進一步，免疫磁珠與白細胞充分混合20min，免疫磁珠與白細胞混合比例為10:1。

進一步，步驟7中免疫抗原抗體反應中使用的試劑是EpCAM抗體、CK抗體、CD45抗體及DAPI標記細胞核。CTC表達EpCAM+/CK+/CD45-/DAPI+,白細胞表達EpCAM-/CK-/CD45+/DAPI+。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置可以很好的實現(xiàn)腫瘤細胞的分選與純化，合理的將微流控芯片技術(shù)，免疫磁珠技術(shù)及細胞免疫熒光反應組合。為有效檢測分選處腫瘤細胞提供了更為有效的方式。另外裝置具備用時短(總分選時間約為30min)，cellsearch為4h，價格低(500VS5000RMB)，樣本需求量小(3-4mlVS7.5ml)，裝置小、便捷等優(yōu)勢。

附圖說明

圖1為本發(fā)明整體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明整體上視結(jié)構(gòu)透視圖；

圖3為本發(fā)明純化結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明微流控芯片與純化芯片連接示意圖；

圖5為本發(fā)明純化芯片構(gòu)示意圖；

圖6為本發(fā)明微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7為本發(fā)明正三角形陣列局部放大結(jié)構(gòu)示意圖；

圖中，11、微流控芯片；111、底層；112、芯片層；12、陣列通道；13、正三角形微陣列柱；14、小細胞過道；15、大細胞過道；16、總分選細胞入口；17、總緩沖液入口；18、總廢液出口；19、總需純化細胞出口；21、純化芯片；211、底板層；212、凹槽層；213、入口出口設置層；214、反應室；215、純化芯片入口；216、純化芯片出口；22、永磁鐵；23、步進電機；24、滑塊；25、支撐塊；3、控制結(jié)構(gòu)；4、支撐件；5、支撐桿；6、軟管。

具體實施方式

實施例1一種循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置

一種循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置，包括分選結(jié)構(gòu)、純化結(jié)構(gòu)及控制結(jié)構(gòu)3；其中，控制結(jié)構(gòu)3伸出導線連接分選結(jié)構(gòu)及純化結(jié)構(gòu)；控制結(jié)構(gòu)3控制分選結(jié)構(gòu)及純化結(jié)構(gòu)；

分選結(jié)構(gòu)包括微流控芯片11，雙噴氣壓泵、氮氣罐、顯微鏡，各部分連接構(gòu)建自動化氣壓泵壓力驅(qū)動微流控芯片11系統(tǒng)；芯片總體大小25.4*76.2mm。其包括底層111與芯片層112，芯片層112上設置一到4個列陣列通道12及兩個出口及兩個入口，單個陣列通道12長68mm，寬3.5mm，高50um，陣列通道12兩側(cè)設置正三角形微陣列柱13，正三角形微陣列柱13之間形成小細胞過道14，及正三角形微陣列柱13中間為大細胞過道15；正三角形微柱的邊長為25um，柱子水平的間距為30um，垂直間距為20um，陣列的前斜角為3.2°。小細胞過道14匯集廢液出口，大細胞過道15匯集需純化細胞出口；陣列通道12還包括兩個入口，一個為分選細胞入口，另一個為緩沖液入口；各陣列通道12的分選細胞入口相通最終匯聚到芯片層112表層的總分選細胞入口16，緩沖液入口相通最終匯聚到芯片層112表層的總緩沖液細胞入口，廢液出口相桶最終匯聚到芯片層112表層的總廢液出口18，各需純化出口相通最終匯聚到芯片層112表層的總需純化細胞出口19。分選結(jié)構(gòu)還包括一個支撐件4，支撐件4支撐微流控芯片11。用于支撐微流控芯片11到一定高度。微流控芯片11采用PDMS材料及軟光刻技術(shù)制備。

純化結(jié)構(gòu)包括純化芯片21，永磁鐵22，供永磁鐵22運動的兩個帶軌道的步進電機23，永磁鐵22設置于純化芯片21下方，兩個步進電機23垂直設置，一個步進電機23上設置永磁鐵22，永磁鐵22通過設置在軌道上的滑塊24設置在步進電機23軌道上；而設置永磁鐵22的步進電機23通過另一個步進電機23軌道上的支撐塊25設置在另一步進電機23軌道上?？刂平Y(jié)構(gòu)3控制步進電機23的運動；純化芯片21包括三層結(jié)構(gòu)，為底板層211，凹槽層212及入口出口設置層213；底板層211位于最下方，凹槽層212位于中間，入口出口設置層213設置在最上方，凹槽層212的凹槽圍成反應室214；入口出口設置層213上對應反應室214的位置設置純化芯片入口215與純化芯片出口216。純化芯片大小50mm×40mm，入口出口設置層213上入口出口的孔徑為1.5mm，反應室尺寸11mm×7mm×3mm或者20mm×10mm×3mm。純化芯片21由PMMA材料制成。純化芯片21下設置支撐桿5使純化芯片21與微流控芯片11水平高度相同。

總需純化細胞出口19通過軟管6連接純化芯片入口215，控制結(jié)構(gòu)3包括電源，控制單元，電路板。永磁鐵22形狀為圓柱形，其設置于純化芯片21反應室214的下方。

本裝置可以實現(xiàn)微陣列芯片及免疫磁珠技術(shù)的結(jié)合，將通過微陣列的大細胞過道15的循環(huán)血細胞移入純化芯片21，并通過在純化芯片21內(nèi)加入免疫磁珠，兩步進電機23帶動永磁鐵22運動，達到充分混合的目的，最后通過固定永磁鐵22將白細胞吸附于底部，將上清液中得到純化的腫瘤細胞。

實施例2一種循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置的制備方法

一種循環(huán)血腫瘤細胞的聯(lián)合分選純化裝置的制備方法

分選結(jié)構(gòu)的制備：

1)微流控芯片11的制備：設計正三角形微陣列柱13結(jié)構(gòu)，采用PDMS材料及軟光刻技術(shù)進行芯片制作；按照設計的圖形制作掩膜；芯片制作選擇聚二甲基硅演烷(PDMS)材料；將PDMS與固化劑按照1:10比例混勻、真空排泡，倒入模板中抽真空排氣泡，放入烤箱80℃烘烤1小時，取出后按芯片設計大小切割打孔。取清潔干凈的玻片并用氮氣吹干凈，與切割好的PDMS一起進行等離子清洗、鍵合，置于烤箱80℃烘烤30分鐘。

2)將雙噴氣壓泵、氮氣罐、制作好的DLD芯片，控制結(jié)構(gòu)3和顯微鏡連接起來，構(gòu)建自動化的氣壓泵壓力驅(qū)動微流控芯片11系統(tǒng)。

純化結(jié)構(gòu)的制備：

1)純化芯片21的制備：選擇聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料，通過注塑成型方法制作而成的。應用激光雕刻機對芯片的反應室214，入口及出口進行激光刻蝕。將三層制備好的單層芯片通過熱壓法鍵和，熱壓鍵合工藝的參數(shù)主要有鍵合壓力、鍵合溫度和鍵合時間，鍵和壓力應在0.5～1.5MPa，鍵和溫度在90℃左右，鍵和時間為10min。

2)將步進電機23，支撐結(jié)構(gòu)，純化芯片21及控制結(jié)構(gòu)3組裝。

最后，將分選結(jié)構(gòu)、純化結(jié)構(gòu)與控制結(jié)構(gòu)連接，并通過軟管將微流控芯片的總需純化細胞出口與純化芯片入口連接。

實施例3一種循環(huán)血腫瘤細胞的分選方法

利用實施例1中的循環(huán)腫瘤細胞的聯(lián)合檢測裝置分析帶腫瘤細胞的血樣，具體為：

首先取健康人外周血加入示蹤的腫瘤細胞構(gòu)成樣本，濃度分別為101/ml，102/ml，103/ml，104/ml，105/ml為計算整體裝置的分選率和分選純度。

將血樣通過DLD芯片的總分選細胞入口16，同時將PBS加入芯片的總緩沖液入口17，通過控制結(jié)構(gòu)3控制氣壓泵進而達到控制液體的流速的目的，壓力泵為OB1PressureController(ELVEFLOW，F(xiàn)rance)。血樣流速為1ml/min，在收集口處，幾乎全部的紅細胞及90％的白細胞都從總廢液出口18流出，而示蹤的腫瘤細胞(CTC)及約10％的白細胞由總需純化細胞出口19導入純化芯片21的入口，進而流入反應室214。

后通過純化芯片21的出口加入CD45免疫磁珠，接通控制結(jié)構(gòu)3上電源及電路板上的開關(guān)，永磁鐵22會在反應室214的底部拖動CD45磁珠與白細胞充分混合，混合時間為20min，CD45磁珠與白細胞混合比例10:1，之后將永磁鐵22放在反應室214底部，從出口吸出上清液，即包含CTC及極少量的白細胞(約占總白細胞的1％)。

再將上清液放在由鼠尾膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，進行下一步的鑒定。

實施例4一種循環(huán)血腫瘤細胞的分選結(jié)果的鑒定使用

1分選率的鑒定實驗

實驗材料：實施例3分選純化后的細胞

實驗方法：通過免疫抗原抗體反應進行檢測，使用的試劑是EpCAM抗體、CK抗體、CD45抗體及DAPI標記細胞核。CTC表達EpCAM+/CK+/CD45-/DAPI+,白細胞表達EpCAM-/CK-/CD45+/DAPI+，在熒光顯微鏡下觀察細胞的不同顯色情況，進而將CTC與白細胞鑒定。

實驗結(jié)果：通過細胞實驗，我們得出裝置的總體分選率分別為77.8％，91.7％，89.2％，91.2％and 89.5％，對應的濃度為101/ml，102/ml，103/ml，104/ml，105/ml?？梢娧b置的分選率接近90％，分選效果很好。

2細胞活性鑒定實驗

實驗材料：實施例3分選純化后的細胞及未經(jīng)處理的培養(yǎng)箱中的細胞(對照組)

實驗方法：分別向?qū)嶒灲M、對照組中加入Hochest、PI兩種試劑，進而在熒光顯微鏡下將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)別開來。正常細胞為低藍色(Hoechst+)，凋亡細胞為高藍色(Hoechst++)，壞死細胞為高紅色(PI++)。

實驗結(jié)果：對細胞活性進行了Hochest/PI檢測，細胞活性可達90％，與正常培養(yǎng)，未經(jīng)分選的細胞無差異。因此得出，該裝置對細胞活性無影響。

2臨床效果鑒定實驗

實驗材料：肺腺癌14例(III、IV期)、乳腺癌8例(I-IV期)、結(jié)腸癌4例(III、IV期)、骨髓瘤2例(IV期)、胸腺瘤1例(IV期)、膀胱癌1例(III期)

實驗方法：取臨床患者的循環(huán)血，分別采用實施例3的方法及臨床分選的金標準Cellsearchsystem進行腫瘤細胞的分選純化。

實驗結(jié)果：與CTC的分選金標準Cellsearchsystem進一步對比，得出在分選性能上，與之無明顯差異。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明。應當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進，這些改進也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。