本發(fā)明屬于細(xì)胞檢測領(lǐng)域，具體涉及一種脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

泌尿系統(tǒng)常見腫瘤主要包括腎癌、膀胱癌和前列腺癌三種。腎癌約占成人惡性腫瘤的2％～3％，占成人腎臟惡性腫瘤的80％～90％。世界范圍內(nèi)各國或各地區(qū)的發(fā)病率各不相同，總體上發(fā)達(dá)國家發(fā)病率高于發(fā)展中國家，城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)，男性多于女性，男女患者比例約為2∶1，發(fā)病年齡可見于各年齡段，高發(fā)年齡50～70歲。膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。占我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位。前列腺癌，則為發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，是前列腺腺泡細(xì)胞異常無序生長的結(jié)果，它是男性最常見的惡性腫瘤，在西方泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率居第1位。

泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤大約95％以上來源于上皮組織。腫瘤組織代謝高，脫落腫瘤細(xì)胞的表面缺乏鈣和透明質(zhì)酸酶，彼此粘著力比正常細(xì)胞低，易于脫落。因此，可通過尿液細(xì)胞學(xué)檢查來檢測泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)生情況。尿液細(xì)胞學(xué)檢查移行細(xì)胞癌最常見于膀胱、腎盂、腎盞及前列腺和輸尿管等部位。作為近些年來新出現(xiàn)的腫瘤檢測指標(biāo)，因其能夠?qū)崟r(shí)、無創(chuàng)地監(jiān)測腫瘤患者的病情狀態(tài)，具有“液態(tài)活檢”特性并與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在早期診斷、早期治療，判斷預(yù)后和制定個(gè)體化治療方案等方面具有重要意義。

常用的富集方法有密度梯度離心法、依賴細(xì)胞大小的分離技術(shù)、免疫 磁珠富集技術(shù)和體外微管技術(shù)、微流體芯片技術(shù)(CTC-Chip)等。檢測和鑒定方法主要有免疫磁珠法、分泌蛋白檢測法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、光纖陣列掃描術(shù)(FAST)等。但現(xiàn)有技術(shù)仍存在：缺乏特異性，純度較低，可能在分離過程中丟失部分腫瘤細(xì)胞，檢測過程過于依賴細(xì)胞數(shù)量或檢測的敏感性較低的問題。因此，發(fā)展一種能夠可靠、快速、經(jīng)濟(jì)地?zé)o創(chuàng)檢測脫落腫瘤細(xì)胞尤其是泌尿系統(tǒng)癌癥患者來源的脫落腫瘤細(xì)胞的方法非常必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片，包括頂板、底板以及位于所述底板和所述頂板之間的通道板；所述通道板內(nèi)設(shè)有脫落腫瘤細(xì)胞分離腔，所述分離腔用以富集尿液中的脫落腫瘤細(xì)胞。

在某些實(shí)施方式中，所述通道板包括第一層通道板和第二層通道板；所述頂板、第一層通道板、第二層通道板和底板通過連接結(jié)構(gòu)依次連接；所述頂板開設(shè)有注液孔，所述注液孔處連通有注液管；所述第一層通道板開設(shè)有細(xì)胞富集腔；所述第二層通道板上開設(shè)有濾液分離腔；所述底板開設(shè)有濾液排出孔；所述濾液排出孔連通有排液管；所述細(xì)胞富集腔、所述濾液分離腔和所述濾液排出孔均與所述注液孔的位置相對(duì)應(yīng)。

在某些實(shí)施方式中，所述第一層通道板和第二層通道板之間設(shè)有薄片，孔徑為1-12μm。

在某些實(shí)施方式中，所述濾液分離腔處為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其橫截面積為0.5-3cm²。

在某些實(shí)施方式中，所述注液孔孔徑為1-3mm；所述濾液排出孔孔徑為1-4mm；所述細(xì)胞富集腔和濾液分離腔的孔徑為10-15mm。

在某些實(shí)施方式中，所述頂板、底板、第一層通道板和第二層通道板均為PMMA板，且其邊長為25-35mm；所述頂板、底板、第一層通道板和第二層通道板的厚度依次為2-4mm、2-4mm、0.5-2mm和0.5-2mm。

本發(fā)明還提供了一種尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片的應(yīng)用，包括以下步驟：

S10：收集供試者尿液樣本；

S20：將S10中收集的尿液樣本注入到權(quán)利要求1～5中所述的尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片中；

S30：用PBS緩沖液沖洗步驟S20中的尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片；

S40：向步驟S30中沖洗后的尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片內(nèi)注入氣體，從而排盡所述尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片內(nèi)的液體；

S50：對(duì)S40步驟所收集的尿液脫落腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原位檢測或非原位檢測。

在某些實(shí)施方式中，將供試者尿液樣本注入到尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片中時(shí)，進(jìn)樣速度為0.5-1.5mL/min。

細(xì)胞富集腔濾液分離腔細(xì)胞富集腔濾液分離腔濾液分離腔細(xì)胞富集腔本發(fā)明提供的一種尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片有益效果是：

尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片為微流體芯片，把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成于一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。這是一種可用于生命科學(xué)、化學(xué)科學(xué)信號(hào)檢測和處理方法研究的重要技術(shù)平臺(tái)。具有特異、廉價(jià)、靈敏、便攜等特點(diǎn)。該尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片可集分離、富集、檢測為一體，擁有巨大的市場化前景。

脫落腫瘤細(xì)胞在尿液中可以穩(wěn)定存在，尤其是尿液樣品可以在非創(chuàng)傷性損傷的前提下大量獲得。因此，尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片通過檢測尿 液脫落腫瘤細(xì)胞來獲取癌癥信息，實(shí)現(xiàn)了癌癥的無創(chuàng)診斷、治療監(jiān)測等臨床應(yīng)用。有效的避免了，由于單位體積尿液中的脫落腫瘤細(xì)胞含量非常低，采用一般方法單次分離得到的脫落腫瘤細(xì)胞少，根本無法滿足后續(xù)檢測的要求的問題。

綜上所述，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，利用脫落腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物為檢測物，建立了一種快速檢測方法。該尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片及其應(yīng)用在泌尿系統(tǒng)癌癥患者脫落腫瘤細(xì)胞檢測、治療監(jiān)測等方面具有較好的應(yīng)用前景。

附圖說明

應(yīng)當(dāng)理解的是，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明的爆炸圖；

圖3為本發(fā)明的流程圖。

附圖標(biāo)號(hào)說明：

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術(shù)語“長度”、“寬度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”“內(nèi)”、“外”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

在本發(fā)明中，除非有明確的限定，術(shù)語“標(biāo)志物”和“檢測技術(shù)”等術(shù)語應(yīng)做廣泛理解，例如，“標(biāo)志物”不僅局限于p53蛋白，還可以是表皮因子生長受體(EGFR)，也可以是CD20，也可以是核基質(zhì)蛋白NMP22， 也可以是癌胚抗原CEA，還可以包括膀胱癌表面抗原BTA等脫落腫瘤細(xì)胞特異性抗原等標(biāo)志物?！皺z測技術(shù)”，可以是熒光抗體檢測技術(shù)，也可以是電化學(xué)檢測技術(shù)，也可以是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，也可以是細(xì)胞收集后突變基因的PCR檢測技術(shù)，還可以是二代基因組測序技術(shù)等其他檢測技術(shù)。在本發(fā)明描述中，聚碳酸酯膜孔徑范圍可根據(jù)細(xì)胞大小進(jìn)行調(diào)節(jié)，大小可為1-12μm，同時(shí)應(yīng)當(dāng)理解的是，作為尿液脫落腫瘤細(xì)胞的過濾芯片，其材質(zhì)可為聚碳酸酯膜，但不局限于聚碳酸酯膜，還可為PDMS或其他可雕刻或鏤空為具有對(duì)應(yīng)大小孔徑的材料均為本專利所保護(hù)范圍。此外，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。

在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術(shù)語“安裝”、“相連”、“連接”、“固定”等術(shù)語應(yīng)做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或成一體；可以是機(jī)械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個(gè)元件內(nèi)部的連通或兩個(gè)元件的相互作用關(guān)系。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術(shù)語在本發(fā)明中的具體含義。

實(shí)施例

參見圖1，本發(fā)明提供了一種尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1，包括頂板11、底板12以及位于所述底板12和所述頂板11之間的通道板13；所述通道板13內(nèi)設(shè)有脫落腫瘤細(xì)胞分離腔，所述分離腔用以富集尿液中的脫落腫瘤細(xì)胞。

上述，可以理解的是，尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1為微流體芯片，把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的 生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。是生命科學(xué)、化學(xué)科學(xué)信號(hào)檢測和處理方法研究的重要技術(shù)平臺(tái)。具有特異、廉價(jià)、靈敏、便攜等特點(diǎn)。該尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1集成分離、富集、檢測為一體，擁有巨大的市場化前景。

需要理解的是，脫落腫瘤細(xì)胞在尿液中可以穩(wěn)定存在，尤其是尿液樣品可以在非創(chuàng)傷性損傷的前提下大量獲得。因此，尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1通過檢測尿液脫落腫瘤細(xì)胞來獲取癌癥信息，實(shí)現(xiàn)了癌癥的無創(chuàng)診斷、治療監(jiān)測等臨床應(yīng)用。有效的避免了，由于單位體積尿液中的脫落腫瘤細(xì)胞含量非常低，采用一般方法單次分離得到的脫落腫瘤細(xì)胞，根本無法滿足后續(xù)檢測的要求的問題。

再者，該尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1具有高度特異性的特點(diǎn)。對(duì)排出人體之外的尿液進(jìn)行收集，不會(huì)對(duì)人體造成任何影響或創(chuàng)傷，也不需要昂貴且精密的實(shí)驗(yàn)儀器(如流式細(xì)胞儀)。

綜上所述，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，利用脫落腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物，建立了一種快速檢測方法。該尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1及其應(yīng)用在泌尿系統(tǒng)癌癥患者脫落腫瘤細(xì)胞檢測、治療監(jiān)測等方面具有較好的應(yīng)用前景。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述通道板13包括第一層通道板131和第二層通道板132；所述頂板11、第一層通道板131、第二層通道板132和底板12通過連接結(jié)構(gòu)14依次連接；所述頂板11開設(shè)有注液孔111，所述注液孔111處連通有注液管15；所述第一層通道板131開設(shè)有細(xì)胞富集腔1311；所述第二層通道板132上開設(shè)有濾液分離腔1321；所述底板12開設(shè)有濾液排出孔121；所述濾液排出孔121連通有排液管16；所述細(xì)胞富集腔1311、所述濾液分離腔1321和所述濾液排出孔121均與所述注液孔111的位置相對(duì)應(yīng)。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述第一層通道板和第二層通道板之間設(shè)有薄片， 孔徑為1-12μm。

上述，薄片17的孔徑為5μm。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述濾液分離腔為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其橫截面積為0.5-3cm²。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述注液孔孔徑為1-3mm；所述濾液排出孔孔徑為1-4mm；所述細(xì)胞富集腔和濾液分離腔的孔徑為10-15mm。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述頂板、底板、第一層通道板和第二層通道板均為PMMA板，且其邊長為25-35mm；所述頂板、底板、第一層通道板和第二層通道板的厚度依次為2-4mm、2-4mm、0.5-2mm和0.5-2mm。

本發(fā)明還提供了一種尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1的應(yīng)用，包括以下步驟：

S10：收集供試者尿液樣本；

S20：將S10中收集的尿液樣本注入到尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1中；

S30：用PBS緩沖液沖洗步驟S20中的尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1；

S40：向步驟S30中沖洗后的尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1內(nèi)注入氣體，從而排盡所述尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1內(nèi)的液體；

S50：對(duì)步驟S40中所分離富集的尿液脫落腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原位檢測或非原位檢測。

上述，為能夠獲得更多的脫落腫瘤細(xì)胞，在非原位檢測過程中可多次重復(fù)進(jìn)行薄片17的沖洗，以獲取盡可能多的脫落腫瘤細(xì)胞。

可以理解的是，步驟S20中可采用微流注射泵、自動(dòng)進(jìn)樣器或手動(dòng)進(jìn)樣器將收集的供試者尿液樣品注入到所述尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1中。

需要理解的是，步驟S40中，向沖洗后的尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1內(nèi)注入氣體，從而排盡所述尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1內(nèi)的液體。該氣體可以是空氣也可以是氮?dú)饣蛘咂渌麣怏w，均能實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果。

可以理解的是，步驟S50后可對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行回收效率分析。

可以理解的是，用pH值為7.2-7.4的PBS緩沖液對(duì)芯片進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)為2～4次。

可以理解的是，在向尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1中加樣時(shí)，每個(gè)樣本重復(fù)2～3次，每次10mL。

可以理解的是，S30中用PBS緩沖液進(jìn)行沖洗3-5次，去除尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1上的雜質(zhì)。

需要理解的是，該芯片可以直接對(duì)富集的脫落腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，該種檢測方式即為原位檢測。該種檢測方式，更為簡單便捷，即脫落腫瘤細(xì)胞富集于芯片后直接進(jìn)行的檢測，簡化了檢測流程，縮短了檢測時(shí)間。

需要理解的是，將尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片上獲得的脫落腫瘤細(xì)胞從薄片上沖洗下來，再進(jìn)行檢測的過程為非原位檢測。

在本發(fā)明實(shí)施例中，將供試者尿液樣本注入到尿液脫落腫瘤細(xì)胞檢測芯片1中時(shí)，進(jìn)樣速度為1.2mL/min。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。