本發(fā)明涉及生物芯片制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種微滴式數(shù)字PCR生物芯片。
背景技術(shù)：
：熒光定量PCR(FluorescenceQuantitativePolymeraseChainReaction，qPCR)已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵的常規(guī)技術(shù)，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展。但是，PCR擴(kuò)增過(guò)程中影響其擴(kuò)增效率的因素很多，很難保證實(shí)際樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品以及不同樣品之間的擴(kuò)增效率相同，由此導(dǎo)致其定量分析所依賴的基礎(chǔ)—循環(huán)閾值(Ct值)不是恒定不變的。因此qPCR的定量只是相對(duì)定量，其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學(xué)定量分析的要求。另外，由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)酶催化反應(yīng)的抑制作用，目前基于qPCR技術(shù)的基因變異檢測(cè)方法對(duì)體細(xì)胞中低豐度的基因變異常常無(wú)能為力的。數(shù)字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一種基于單分子PCR方法來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量方法，是一種絕對(duì)定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統(tǒng)定量PCR不同，數(shù)字PCR通過(guò)直接計(jì)數(shù)的方法，可以實(shí)現(xiàn)起始DNA模板的絕對(duì)定量。另外，數(shù)字PCR還是一種可以在大量的野生型DNA背景中鑒定出微量突變體的方法。由于數(shù)字PCR技術(shù)可以將模板DNA分子事先分隔開來(lái)單獨(dú)進(jìn)行擴(kuò)增，這就避免了高豐度等位基因核酸對(duì)變異核酸的擴(kuò)增抑制，因此提高了微量變異核酸的檢出效率。乳滴數(shù)字PCR技術(shù)能夠檢測(cè)低至0.001％的突變片段，而測(cè)序及常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)少于1％的突變是無(wú)能為力的，因此微滴式數(shù)字PCR技術(shù)可將突變檢測(cè)靈敏度提高1000倍。傳統(tǒng)的數(shù)字PCR技術(shù)的一般操作流程比較復(fù)雜，通常是首先通過(guò)手工逐級(jí)稀釋并分配樣品至微孔板中，然后將微孔板置于熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)儀器讀取每個(gè)微孔中的熒光信號(hào)，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的比例，結(jié)合分析軟件可計(jì)算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)。這種方式操作繁瑣、通量小、效率低，而且較少的液滴分解數(shù)目也限制了其精度和可測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍，應(yīng)用方面有很大的局限。近年來(lái)，微流控技術(shù)的發(fā)展為數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展注入了新的活力。由于微流控技術(shù)在微流體操控方面的優(yōu)勢(shì)，使得我們可以將樣品分解為納升甚至皮升級(jí)，獲得更多的樣品分解數(shù)目，從而大大提高數(shù)字PCR技術(shù)的檢測(cè)靈敏度、可信度和動(dòng)態(tài)范圍度。另外，微流控技術(shù)自動(dòng)化、易集成、通量高的優(yōu)勢(shì)，也可極大地提高數(shù)字PCR技術(shù)的檢測(cè)效率。借助微流控技術(shù)在微流體操控方面的優(yōu)勢(shì)，最近國(guó)際上已有多個(gè)研究小組和公司開發(fā)了基于微流控技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。比較典型的包括Fluidigm公司推出的基于微室型的BioMarkTM系統(tǒng)和Bio-Rad公司推出的基于液滴型的QX100TM系統(tǒng)。微液滴技術(shù)是指利用不互溶相形成油包水或水包油的相對(duì)穩(wěn)定的獨(dú)立微體積液滴。乳化方式有多種，其中基于微流控芯片的液滴生成技術(shù)最近幾年得到快速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于生物界和材料界，是一種非常重要的技術(shù)。其原理主要是通過(guò)兩相液流之間一定角度戶型擠壓作用下，其中一相連續(xù)液流斷裂形成液滴。目前常用的液滴制備方式有正交結(jié)構(gòu)(T-junction)和流式聚焦(Flow-focusing)等。這些方法整體設(shè)備的系統(tǒng)比較復(fù)雜，對(duì)流體控制系統(tǒng)的要求比較高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種微滴式數(shù)字PCR生物芯片，該微滴式數(shù)字PCR生物芯片可以用于快速制備大量大小均一的液滴，液滴平鋪于芯片上，檢測(cè)時(shí)只需對(duì)芯片整體進(jìn)行成像檢測(cè)即可，不需要像流式細(xì)胞儀那樣對(duì)液滴進(jìn)行單顆的檢測(cè)。微滴式數(shù)字PCR生物芯片，包括由上片和下片貼合形成的芯片本體，所述芯片本體內(nèi)部設(shè)有進(jìn)樣腔、液滴存儲(chǔ)腔以及排油腔，芯片本體表面設(shè)有分別與進(jìn)樣腔和排油腔連通的進(jìn)樣孔和排油孔，所述進(jìn)樣腔和液滴存儲(chǔ)腔之間、液滴存儲(chǔ)腔與排油腔之間分別設(shè)有多個(gè)液滴形成孔道和排油孔道，所述液滴形成孔道和排油孔道的高度均小于液滴存儲(chǔ)腔的高度，使得液滴形成孔道與液滴存儲(chǔ)腔的連接處具有形成液滴的臺(tái)階結(jié)構(gòu)。使用時(shí)，先通過(guò)進(jìn)樣孔將油相注入到芯片內(nèi)部，待芯片內(nèi)部注滿油相，排除空氣后，通過(guò)進(jìn)樣孔注入水相，在一定的壓力下，水相從進(jìn)樣腔進(jìn)入液滴形成孔道，然后從液滴形成孔道出來(lái)進(jìn)入到液滴存儲(chǔ)腔時(shí)，由于液滴形成孔道的高度較液滴存儲(chǔ)腔小，在液滴形成孔道與液滴存儲(chǔ)腔交界處形成臺(tái)階，在水相由較為狹窄的液滴形成孔道進(jìn)入到較為寬闊的液滴存儲(chǔ)腔時(shí)，水相在部分進(jìn)入液滴存儲(chǔ)腔時(shí)，由于表面張力作用流動(dòng)加速，而與液滴形成孔道內(nèi)的水相發(fā)生斷裂，形成液滴，該方法稱為階梯乳化方法。階梯乳化方法可以利用單一的驅(qū)動(dòng)源，連續(xù)生成液滴，液滴的大小主要由表面張力和微結(jié)構(gòu)的構(gòu)型決定，受流速的影響較小。液滴產(chǎn)生進(jìn)入液滴存儲(chǔ)腔后，相應(yīng)體積的油相就通過(guò)排油孔道排到排油腔，最終經(jīng)與排油腔連通的排油孔排出。排油孔道足夠小，使得液滴不能夠從排油孔道排出。所產(chǎn)生的大量液滴最后平鋪在液滴存儲(chǔ)腔。液滴制備完成后，可以直接將該芯片放置到相應(yīng)的PCR反應(yīng)儀器中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，直接將該芯片放置于芯片分析儀器中進(jìn)行熒光信號(hào)的成像和讀取。優(yōu)選的，所述液滴存儲(chǔ)腔為U型結(jié)構(gòu)，所述進(jìn)樣腔為直線型結(jié)構(gòu)，設(shè)于U型結(jié)構(gòu)的兩臂之間，且與兩臂之間設(shè)有多個(gè)平行布置的液滴形成孔道；所述排油腔設(shè)于所述U型結(jié)構(gòu)的外周。這樣設(shè)計(jì)使得長(zhǎng)條形的進(jìn)樣腔伸入液滴存儲(chǔ)腔內(nèi)部，在進(jìn)樣腔的頂部和長(zhǎng)長(zhǎng)的兩側(cè)可以設(shè)置大量液滴形成孔道，提高液滴制備的通量，同時(shí)，也使得液滴存儲(chǔ)腔的各個(gè)邊界不會(huì)離液滴形成孔道太遠(yuǎn)，避免產(chǎn)生的液滴遷移過(guò)遠(yuǎn)的距離而發(fā)生破壞和損失。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述進(jìn)樣孔靠近U型結(jié)構(gòu)開口的端部為進(jìn)樣端，進(jìn)樣端與進(jìn)樣孔之間設(shè)有狹長(zhǎng)的銜接段。更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述液滴形成孔道的排布密度從所述進(jìn)樣端起始密度逐漸增大。這種形成一定梯度的排列，可以使各處生產(chǎn)液滴的速度接近。此設(shè)計(jì)可避免通道均勻分布所造成的離進(jìn)樣端較近的通道壓力過(guò)大，水相流速過(guò)快，產(chǎn)生液滴過(guò)多。優(yōu)選的，所述液滴形成孔道連接液滴存儲(chǔ)腔的端部設(shè)有圓弧倒角。此處設(shè)置倒角也是為了利于液滴的生成和移動(dòng)。更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述圓弧倒角在液滴形成方向上的長(zhǎng)度為1～100μm。所述圓弧倒角在液滴形成方向上的長(zhǎng)度大小會(huì)影響生成液滴的大小，在一定范圍內(nèi)，液滴大小隨著這個(gè)長(zhǎng)度增加而增大。優(yōu)選的，所述液滴形成孔道的橫截面為矩形，寬度為10～200μm，高度為1～100μm，液滴存儲(chǔ)腔高度為10～200μm。液滴的大小與液滴形成孔道的大小有直接關(guān)系，液滴形成孔道的寬度與高度越大產(chǎn)生的液滴就越大，所以液滴形成孔道的大小需要在合適的范圍內(nèi)。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述液滴形成通道靠近液滴存儲(chǔ)腔一端寬度變大形成喇叭口狀。喇叭口狀有利于液滴的生成和移動(dòng)。優(yōu)選的，所述進(jìn)樣孔入口設(shè)有硅膠材質(zhì)的密封接口塞，所述密封接口塞設(shè)有連通進(jìn)樣腔的通孔。硅膠材質(zhì)具有良好的彈性，使用具有彈性的密封接口塞可以保證加油相和水相時(shí)，移液管可以與密封塞緊密配合，確保加樣時(shí)芯片流道內(nèi)的密閉性，使流速和壓力都能穩(wěn)定實(shí)施，促使液滴形成的均勻一致。優(yōu)選的，所述的芯片本體上設(shè)有多個(gè)反應(yīng)區(qū)，每個(gè)反應(yīng)區(qū)內(nèi)部均設(shè)有進(jìn)樣腔、液滴存儲(chǔ)腔以及排油腔，芯片本體表面設(shè)有分別與進(jìn)樣腔和排油腔連通的進(jìn)樣孔和排油孔，所述進(jìn)樣腔和液滴存儲(chǔ)腔之間、液滴存儲(chǔ)腔與排油腔之間分別設(shè)有多個(gè)液滴形成孔道和排油孔道，所述液滴形成孔道和排油孔道的高度均小于液滴存儲(chǔ)腔的高度。在一塊芯片上集成多個(gè)反應(yīng)區(qū)可以增加反應(yīng)的通量，方便進(jìn)行多個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR生物芯片通過(guò)液滴形成孔道的高度較液滴存儲(chǔ)腔小，從而在兩者之間形成臺(tái)階，在水相由較為狹窄的液滴形成孔道進(jìn)入到較為寬闊的液滴存儲(chǔ)腔時(shí)，水相在部分進(jìn)入液滴存儲(chǔ)腔時(shí)，由于表面張力作用流動(dòng)加速，而與液滴形成孔道內(nèi)的水相發(fā)生斷裂，形成液滴。所生成的液滴能夠穩(wěn)定均勻的平鋪在芯片的液滴存儲(chǔ)腔，無(wú)需對(duì)液滴進(jìn)行轉(zhuǎn)移就可以直接在芯片上對(duì)液滴進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)分析，大大減少了操作步驟，簡(jiǎn)化操作系統(tǒng)；并且所制備的液滴大小均一，制備液滴的速度快、通量高，大大縮短了液滴制備的時(shí)間。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR生物芯片的剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為上片位于芯片內(nèi)部一面的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本發(fā)明微滴式數(shù)字PCR生物芯片按圖1中A-A方向的剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為圖2中B局部放大圖；圖5為液滴形成孔道與液滴存儲(chǔ)腔的局部結(jié)構(gòu)示意圖；圖6為實(shí)施例3中液滴圖；圖7為實(shí)施例3中液滴熒光信號(hào)檢測(cè)圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1如圖1～5所示，一種微滴式數(shù)字PCR生物芯片，包括由上片1和下片2貼合形成的芯片本體，所述芯片本體內(nèi)部在上片1上設(shè)有進(jìn)樣腔3、液滴存儲(chǔ)腔4以及排油腔5。液滴存儲(chǔ)腔4為U型結(jié)構(gòu)，進(jìn)樣腔3為直線型結(jié)構(gòu)，設(shè)于U型結(jié)構(gòu)兩臂之間，且與兩臂之間設(shè)有多個(gè)平行布置的液滴形成孔道6；排油腔5設(shè)于所述U型結(jié)構(gòu)的外周。液滴存儲(chǔ)腔4與排油腔5之間設(shè)有多個(gè)排油孔道7。液滴形成孔道6和排油孔道7的高度均小于液滴存儲(chǔ)腔4的高度，使得液滴形成孔道6與液滴存儲(chǔ)腔4的連接處具有形成液滴的臺(tái)階結(jié)構(gòu)。液滴存儲(chǔ)腔4為U型結(jié)構(gòu)使得長(zhǎng)條形的進(jìn)樣腔3伸入液滴存儲(chǔ)腔4內(nèi)部，在進(jìn)樣腔3的頂部和長(zhǎng)長(zhǎng)的兩側(cè)可以設(shè)置大量液滴形成孔道6，增加液滴制備的速度，同時(shí)，也使得液滴存儲(chǔ)腔4的各個(gè)邊界不會(huì)離液滴形成孔道6太遠(yuǎn)，避免產(chǎn)生的液滴遷移過(guò)遠(yuǎn)的距離而發(fā)生破壞和損失。芯片本體表面設(shè)有分別與進(jìn)樣腔3和排油腔5連通的進(jìn)樣孔8和排油孔9。進(jìn)樣孔8靠近U型結(jié)構(gòu)開口的端部為進(jìn)樣端，進(jìn)樣端與進(jìn)樣孔8之間設(shè)有狹長(zhǎng)的銜接段10。液滴形成孔道6的排布密度從進(jìn)樣端起始密度逐漸增大。這種形成一定梯度的排列，可以使各處生產(chǎn)液滴的速度接近。如果是均勻排布的話，離進(jìn)樣端較近的液滴形成孔道6由于壓力較大，水相流速較快，產(chǎn)生液滴會(huì)較多。液滴形成孔道6連接液滴存儲(chǔ)腔4的端部設(shè)有圓弧倒角11。圓弧倒角11在液滴形成方向上的長(zhǎng)度為1～100μm。圓弧倒角11在液滴形成方向上的長(zhǎng)度大小會(huì)影響生成液滴的大小，在一定范圍內(nèi)，液滴大小隨著這個(gè)長(zhǎng)度增加而增大。液滴形成孔道6的橫截面為矩形，寬度為10～200μm，高度為1～100μm，液滴存儲(chǔ)腔高度為10～200μm。液滴形成孔道6靠近液滴存儲(chǔ)腔4一端寬度變大形成喇叭口狀。液滴的大小與液滴形成孔道6的大小有直接關(guān)系，液滴形成孔道6越大產(chǎn)生的液滴就越大，所以液滴形成孔道6的大小需要在合適的范圍內(nèi)。喇叭口狀有利于液滴的生成和移動(dòng)。進(jìn)樣孔8入口密封有硅膠材質(zhì)的密封塞。硅膠材質(zhì)具有良好的彈性，使用具有彈性的密封塞可以保證加油相和水相時(shí)，移液管可以與密封塞緊密配合，確保芯片流道內(nèi)的密閉性，使流速和壓力都能穩(wěn)定實(shí)施，促使液滴形成的均勻一致。本發(fā)明芯片還在進(jìn)樣腔3內(nèi)刻有一系列大小已知的圓作為刻度，可以在顯微鏡下觀察時(shí)，方便判斷所制備的液滴大小。使用時(shí)，先將油相通過(guò)進(jìn)樣孔注入到芯片內(nèi)部，待芯片內(nèi)部注滿油相，排除空氣后，通過(guò)進(jìn)樣孔8注入水相，在一定的壓力下，水相從進(jìn)樣腔3進(jìn)入液滴形成孔道6，然后在液滴形成孔道6出來(lái)進(jìn)入到液滴存儲(chǔ)腔4時(shí)，由于液滴形成孔道6的高度較液滴存儲(chǔ)腔4小，在液滴形成孔道6與液滴存儲(chǔ)腔4交界處形成臺(tái)階，在水相由較為狹窄的液滴形成孔道6進(jìn)入到較為寬闊的液滴存儲(chǔ)腔4時(shí)，水相在部分進(jìn)入液滴存儲(chǔ)腔4時(shí)，由于表面張力作用流動(dòng)加速，而與液滴形成孔道6內(nèi)的水相發(fā)生斷裂，形成液滴。液滴產(chǎn)生進(jìn)入液滴存儲(chǔ)腔4后，相應(yīng)體積的油相就通過(guò)排油孔道7排到排油腔5，最終經(jīng)與排油腔5連通的排油孔9排出。排油孔道7高度小于液滴存儲(chǔ)腔4的高度，使得液滴不容易從排油孔道7排出。所產(chǎn)生的大量液滴最后平鋪在液滴存儲(chǔ)腔4內(nèi)，液滴為油包水結(jié)構(gòu)，而外層的油相，相互之間為融合狀態(tài)，相當(dāng)于在油相內(nèi)存在一顆顆相互獨(dú)立的水相的液滴。液滴制備完成后，可以直接將該芯片放置到相應(yīng)的PCR反應(yīng)儀器中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后，直接將該芯片放置于芯片分析儀器中進(jìn)行熒光信號(hào)的成像和讀取。實(shí)施例2所述的芯片本體上設(shè)有多個(gè)反應(yīng)區(qū)，每個(gè)反應(yīng)區(qū)內(nèi)部均設(shè)有進(jìn)樣腔3、液滴存儲(chǔ)腔4以及排油腔5，芯片本體表面設(shè)有分別與進(jìn)樣腔3和排油腔5連通的進(jìn)樣孔8和排油孔9，進(jìn)樣腔3和液滴存儲(chǔ)腔4之間、液滴存儲(chǔ)腔4與排油腔5之間分別設(shè)有多個(gè)液滴形成孔道6和排油孔道7，液滴形成孔道6和排油孔道7的高度均小于液滴存儲(chǔ)腔4的高度。其余結(jié)構(gòu)同實(shí)施例1。實(shí)施例3使用實(shí)施例1中的微滴式數(shù)字PCR生物芯片、使用70％礦物油+30％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100作為油相組合物(礦物油和正十四烷的比例是指占主體成分的質(zhì)量比例，而EM90和TritonX-100的比例為各自質(zhì)量與主體成分的比值。)進(jìn)行液滴制備實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體流程如下：(1)配制油相。(2)配制水相即PCR反應(yīng)體系。模板來(lái)自非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞株H1975，同時(shí)有T790M和L858R兩種突變。引物序列為：F：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’；R：5’-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGAC-3’探針序列為：5’-FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ-3’，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，NFQ為熒光淬滅基團(tuán)。水相配方：2×PCR反應(yīng)緩沖液(包括Taq酶、dNTP、鎂離子)7.5uLBSA(1％)1.5uL上游引物F(10μM)0.3uL下游引物R(10μM)0.3uL探針(5μM)0.3uL模板(5ng/μL)1.0uL去離子水4.1uL總體積15uL(3)將油相平鋪在微滴式數(shù)字PCR生物芯片內(nèi)。(4)采用階梯乳化的方式用注射泵將水相加入到油相中同時(shí)形成液滴。(5)生成好的微滴按如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：96℃預(yù)變性10min；98℃變性30s，62℃退火延伸1min，共39個(gè)循環(huán)；62℃延伸1min，25℃保溫。(6)擴(kuò)增結(jié)束，顯微鏡觀察液滴形態(tài)。若液滴均一穩(wěn)定，閱讀儀檢測(cè)熒光信號(hào)。結(jié)果：PCR擴(kuò)增后，液滴大小均一，液滴直徑在80μm左右，基本沒有破碎和融合液滴(圖6)，儀器可檢測(cè)到較強(qiáng)熒光信號(hào)(圖7)。SEQUENCELISTING<110>杭州用達(dá)生物科技有限公司<120>一種微滴式數(shù)字PCR生物芯片<130><160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>1gcctgctgggcatctg16<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2tctttgtgttcccggacatagac23<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>3atgagctgcatgatgag17當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3