本發(fā)明涉及生物細(xì)胞代謝淬滅裝置及其細(xì)胞代謝淬滅方法，涉及微生物、動物、植物、醫(yī)藥和化工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

生物技術(shù)領(lǐng)域在過去的幾十年里得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，開辟了一個新紀(jì)元，以基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)為重要組成模塊的組學(xué)研究分析技術(shù)正發(fā)揮重要作用。與轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組相同的是，代謝組學(xué)也是依賴生物背景的，每一種代謝物的濃度高低都取決于細(xì)胞、組織或機(jī)體的生理生化狀態(tài)。然而，不同于mRNA和蛋白質(zhì)，建立基因和代謝物之間的聯(lián)系對于本領(lǐng)域目前水平來說是極其困難甚至是不可能的。一個基因能轉(zhuǎn)錄形成多個mRNA，一段mRNA能夠翻譯形成多種蛋白質(zhì)，一種酶蛋白能夠催化形成多種代謝產(chǎn)物，盡管酶具有高度選擇性，但是酶可以催化多個底物。研究表明，mRNA水平的變化其實不一定與蛋白水平的變化一致，而且翻譯得到的蛋白也并不均具有酶學(xué)活性，所以在轉(zhuǎn)錄組或蛋白組研究中觀察到的差異變化不一定與實際的表型變化相對應(yīng)。因此，通過代謝組學(xué)方法定性或定量測定生物系統(tǒng)合成的代謝物成為了一種解析生物代謝過程的重要手段。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后的新興組學(xué)研究領(lǐng)域，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。通過代謝組學(xué)方法對生物體細(xì)胞胞內(nèi)代謝物進(jìn)行定性或定量分析，需要周密而精確的實驗設(shè)計和操作，尤其是代謝物樣品預(yù)處理操作(細(xì)胞代謝淬滅和代謝物提取過程等)。細(xì)胞代謝是指細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)維持生命和增殖并降解基質(zhì)的一系列化學(xué)反應(yīng)過程，其反應(yīng)過程極快，能夠在毫秒間實現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化?！叭绾螌?xì)胞進(jìn)行及時、徹底代謝淬滅”以及“如何從細(xì)胞中準(zhǔn)確、完整提取胞內(nèi)代謝物”成為代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵。細(xì)胞代謝淬滅過程是細(xì)胞代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵第一步，其決定整個實驗的成功與否。在代謝組學(xué)研究中常由于細(xì)胞代謝淬滅不完全，細(xì)胞酶活性不能得到及時抑制，而導(dǎo)致目標(biāo)代謝物轉(zhuǎn)化或分解，使得實驗結(jié)果出現(xiàn)較大偏差?！叭绾螌?xì)胞進(jìn)行及時、徹底代謝淬滅”以及“如何從細(xì)胞中準(zhǔn)確、完整提取胞內(nèi)代謝物”成為代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)難題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明以細(xì)胞代謝組學(xué)研究為主體，解決現(xiàn)有技術(shù)中對細(xì)胞進(jìn)行及時、徹底地代謝淬滅這一技術(shù)難題，提供了一種細(xì)胞代謝淬滅裝置。該細(xì)胞代謝淬滅裝置能夠在取樣時間點(diǎn)，瞬時抽取細(xì)胞培養(yǎng)液并按一定比例使細(xì)胞培養(yǎng)液與低溫細(xì)胞淬滅溶液得到充分混合效果，瞬間使細(xì)胞降至低溫，抑制酶活力，使其生理代謝活動停止。

本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是：在細(xì)胞活動中，響應(yīng)外界環(huán)境擾動的代謝反應(yīng)會在幾毫秒間完成，胞內(nèi)代謝物會在瞬間轉(zhuǎn)化為一種或多種其他代謝物，如果細(xì)胞淬滅過程中低溫淬滅溶液與細(xì)胞培養(yǎng)液混合時間過長，會使細(xì)胞緩慢經(jīng)歷降溫過程，這段時間內(nèi)細(xì)胞會啟動相應(yīng)的應(yīng)激代謝反應(yīng)，直至溫度降至預(yù)設(shè)的低溫條件時，目標(biāo)代謝物可能已轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)或降解，失去對目標(biāo)代謝物的定量分析的意義。因此，為了使低溫淬滅溶液瞬間與細(xì)胞培養(yǎng)液混合，使細(xì)胞溫度迅速從培養(yǎng)溫度(通常20～50℃)降至低溫(–20～–30℃)，使細(xì)胞代謝活動停止，代謝物的分析數(shù)據(jù)才能準(zhǔn)確表征細(xì)胞代謝狀態(tài)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種細(xì)胞代謝淬滅系統(tǒng)，包括：

細(xì)胞供給裝置，用于微生物、動物或植物細(xì)胞的培養(yǎng)和發(fā)酵；

液液混合裝置，將細(xì)胞培養(yǎng)液和低溫淬滅溶液均勻混合；

細(xì)胞收集裝置，用于細(xì)胞混合液的低溫淬滅；及

電磁反饋控制裝置，控制細(xì)胞培養(yǎng)液和低溫淬滅溶液的比例，控制細(xì)胞代謝淬滅反應(yīng)。

細(xì)胞供給裝置、液液混合裝置、細(xì)胞收集裝置通過導(dǎo)流管、連接管連接，由電磁反饋控制裝置來控制整個系統(tǒng)中細(xì)胞培養(yǎng)液的導(dǎo)流，使終點(diǎn)淬滅溶液濃度可控，有利于準(zhǔn)確控制細(xì)胞培養(yǎng)液和低溫淬滅溶液的體積比。

優(yōu)選的，細(xì)胞供給裝置為搖瓶體系、發(fā)酵罐體系等生物反應(yīng)器中任一種。

液液混合裝置由三段導(dǎo)流管和混合室連接而成，三段導(dǎo)流管分別為細(xì)胞培養(yǎng)液段的導(dǎo)流管I、低溫淬滅溶液段的導(dǎo)流管II以及細(xì)胞收集段的導(dǎo)流管III；導(dǎo)流管I和導(dǎo)流管II中各包含一個文丘里管流體壓縮噴射結(jié)構(gòu)；導(dǎo)流管III中含有文丘里管流體壓縮結(jié)構(gòu)。

由于細(xì)胞培養(yǎng)液的溫度一般在20～50℃之間，而低溫淬滅溶液的溫度一般為–30～–40℃，如果細(xì)胞培養(yǎng)液與低溫淬滅溶液混合不均勻，會造成細(xì)胞培養(yǎng)液中的水分來不及與淬滅溶劑互溶，在低溫條件下迅速結(jié)冰，不利于混合，而造成混合后淬滅溶劑的濃度過高，影響代謝物分析結(jié)果。本發(fā)明中，通過將導(dǎo)流管I和II段設(shè)計成文丘里管結(jié)構(gòu)，在導(dǎo)流管I段利用這種文丘里管結(jié)構(gòu)將流體(細(xì)胞培養(yǎng)液)壓縮形成高速流體，在混合室中噴射形成小液滴，與另一股流體(低溫培養(yǎng)液)經(jīng)壓縮噴射形成的小液滴均勻混合，在氣壓差推動力作用下進(jìn)入導(dǎo)流管III，導(dǎo)流管III中含有文丘里管流體壓縮結(jié)構(gòu)將混合液壓縮為正常流體，最終以均質(zhì)形態(tài)流入細(xì)胞收集瓶，實現(xiàn)了導(dǎo)流過程中低溫淬滅溶液與細(xì)胞培養(yǎng)液的充分均勻混合。同時，這種文丘里管結(jié)構(gòu)的設(shè)計內(nèi)部無死角，便于清洗，避免了引入其他混合器而帶來的復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)，不會造成細(xì)胞殘留或試劑殘留影響下次實驗。

本發(fā)明細(xì)胞收集裝置包括細(xì)胞收集瓶、恒低溫系統(tǒng)、緩沖瓶以及真空泵，細(xì)胞收集瓶設(shè)在恒低溫系統(tǒng)內(nèi)部，細(xì)胞收集瓶、緩沖瓶以及真空泵通過連接管連接。

本發(fā)明對細(xì)胞收集瓶進(jìn)行密閉處理，通過緩沖瓶連接真空泵，利用真空泵抽取細(xì)胞收集瓶和導(dǎo)流管中的空氣產(chǎn)生低壓，使導(dǎo)流管I、II和導(dǎo)流管III的兩端形成氣壓差，而致使細(xì)胞培養(yǎng)液和低溫淬滅溶液在壓力差作用下迅速通過導(dǎo)流管混合流入細(xì)胞收集瓶。這種設(shè)計只需幾毫秒就能將細(xì)胞培養(yǎng)液和低溫淬滅溶液進(jìn)行混合，使培養(yǎng)液中細(xì)胞溫度能夠在最短時間內(nèi)降至低溫(–20～–30℃)，最大程度地抑制細(xì)胞活性，使細(xì)胞代謝停滯在取樣時刻，從而保證后續(xù)的代謝組學(xué)研究的數(shù)據(jù)真實、可靠。

本發(fā)明電磁反饋控制裝置由電路①，電路②和電路③組成；電路①包括電磁繼電器、低壓電源、電路開關(guān)Ⅰ以及金屬觸點(diǎn)A、B；電路②包括高壓電源、電磁閥、電路開關(guān)Ⅱ以及金屬觸點(diǎn)C、D；電路③包括高壓電源、真空泵及金屬觸點(diǎn)E、F。電磁繼電器包括電磁鐵、線圈、銜鐵和金屬觸片。

進(jìn)一步的，所述低溫淬滅溶液由水、淬滅溶劑和強(qiáng)電解質(zhì)形成導(dǎo)電溶液，有利于連接低溫淬滅溶液貯瓶底部的金屬觸點(diǎn)A和B，利用金屬觸點(diǎn)A和B連接產(chǎn)生的電信號來控制細(xì)胞培養(yǎng)液的導(dǎo)流與否。

本發(fā)明另一個目的是請求保護(hù)采用上述系統(tǒng)進(jìn)行快速細(xì)胞代謝淬滅的方法，該方法為：接通電路①、③，開啟真空泵，使細(xì)胞培養(yǎng)液和低溫淬滅溶液同時流入細(xì)胞收集瓶，當(dāng)?shù)蜏卮銣缛芤罕怀楦珊?，自動斷開電路①、③，接通電路②，真空泵停止工作，停止抽取細(xì)胞培養(yǎng)液；細(xì)胞收集瓶中的細(xì)胞混合液在低溫環(huán)境中淬滅結(jié)束后，取出細(xì)胞收集瓶，離心，收集淬滅后的細(xì)胞。

更為具體地，包括以下步驟：

S1.配制低溫淬滅溶液，將其裝入低溫淬滅溶液貯瓶，閉合電路開關(guān)Ⅰ，金屬觸點(diǎn)A、B接通，接通電路①；

S2.電磁繼電器使金屬觸片連接觸點(diǎn)E和F，接通電路③，開啟真空泵；

S3.細(xì)胞培養(yǎng)液和低溫淬滅溶液分別同時流入導(dǎo)流管Ⅰ和導(dǎo)流管Ⅱ中，在混合室中混合，經(jīng)導(dǎo)流管Ⅲ進(jìn)入細(xì)胞收集瓶中；

S4.當(dāng)?shù)蜏卮銣缛芤罕怀楦珊?，金屬觸點(diǎn)A、B斷開，電路①斷開，電磁繼電器上金屬觸片離開觸點(diǎn)E和F，連接觸點(diǎn)C和D，斷開電路③，接通電路②，電磁閥閉合阻止細(xì)胞培養(yǎng)液流動，真空泵停止工作；

S5.細(xì)胞收集瓶中的細(xì)胞混合液在低溫環(huán)境中淬滅，淬滅結(jié)束后，取出細(xì)胞收集瓶，離心，收集淬滅后的細(xì)胞。

本發(fā)明還請求保護(hù)由上述方法收集到的細(xì)胞在胞內(nèi)代謝物提取中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果是：本發(fā)明的生物細(xì)胞代謝淬滅系統(tǒng)通過對各部分裝置的特殊設(shè)計，可以在幾毫秒內(nèi)抽取細(xì)胞培養(yǎng)液，適合生物細(xì)胞快速取樣及細(xì)胞代謝淬滅操作，適用于各類淬滅溶劑。在液液混合裝置、細(xì)胞收集裝置和電磁反饋控制裝置共同作用下，細(xì)胞培養(yǎng)液與低溫細(xì)胞淬滅溶液得到充分混合，且細(xì)胞可瞬間降至低溫，有效抑制酶活力、代謝淬滅完全，引入電磁反饋控制裝置和真空泵使終點(diǎn)的淬滅溶劑濃度準(zhǔn)確可控，實現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液與低溫細(xì)胞淬滅溶液體積比的精確控制，使胞內(nèi)代謝物數(shù)據(jù)真實可靠，此外，該系統(tǒng)還就有設(shè)備簡單、組裝方便等特點(diǎn)，該系統(tǒng)中各裝置之間相輔相成，實現(xiàn)對細(xì)胞進(jìn)行及時、徹底代謝淬滅。采用上述系統(tǒng)進(jìn)行代謝淬滅的方法，簡單易行，準(zhǔn)確率高，為微生物、動物以及植物細(xì)胞的胞內(nèi)代謝物研究提供技術(shù)支持。

附圖說明

圖1為本實施例細(xì)胞代謝淬滅裝置示意圖；

圖2為液液混合裝置示意圖；

圖3為觸點(diǎn)A、B示意圖；

圖4為電路①結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為電路②結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6為電路③結(jié)構(gòu)示意圖。

其中：1、細(xì)胞供給裝置，2、取樣管，3、止水夾，4、空氣濾膜，5、電磁閥，6、導(dǎo)流管I，7、導(dǎo)流管II，8、導(dǎo)流管III，9、混合室，10、低溫淬滅溶液貯瓶，11、細(xì)胞收集瓶，12、恒低溫系統(tǒng)，13、連接管I，14、連接管II，15、緩沖瓶，16、真空泵，17、電磁繼電器，18、電路開關(guān)I，19、電路開關(guān)II。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不以任何形式受限于實施例內(nèi)容。實施例中所述試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

實施例1

細(xì)胞代謝淬滅操作要求細(xì)胞培養(yǎng)液體積與低溫淬滅溶液體積控制一定比例，使得混合后溶劑濃度在一定范圍內(nèi)，該濃度條件下低溫溶劑不僅要能夠抑制胞內(nèi)酶活性，淬滅細(xì)胞代謝，而且不能對細(xì)胞膜造成大的損傷，避免胞內(nèi)代謝物在淬滅過程中的外泄。如果細(xì)胞培養(yǎng)液與低溫淬滅溶液比例不合適，混合后淬滅溶劑濃度過高或過低，會造成細(xì)胞膜穿孔損傷(胞內(nèi)代謝物外泄)或代謝淬滅不完全(酶活力沒有完全抑制)。

本發(fā)明中，根據(jù)胞內(nèi)代謝物分析實驗所需淬滅的細(xì)胞量，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度C1，計算本次實驗所需細(xì)胞培養(yǎng)液的體積V1。按所選淬滅溶劑的最適淬滅濃度C2(混合后最終溶劑濃度，可參考現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)報道)，計算出所需低溫淬滅溶液的體積V2，量取所需體積的淬滅溶液進(jìn)行低溫預(yù)冷處理。確定好低溫淬滅溶劑的體積V2后，實驗過程中只需控制細(xì)胞培養(yǎng)液的取樣體積V1就可以實現(xiàn)低溫淬滅溶劑和細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比的精確控制(V2/V1)，本發(fā)明中引入了電磁繼電器控制電路①、②和③，在細(xì)胞代謝淬滅過程中實現(xiàn)了體積比的精確控制。具體操作步驟如下：

1.配制低溫淬滅溶液(由水、淬滅溶劑和強(qiáng)電解質(zhì)形成導(dǎo)電溶液)，本實施例中低溫淬滅溶液為水、甲醇和NaCl配制形成的溶液(－40℃，60％(v/v)甲醇水溶液，其中含0.9％(w/v)NaCl溶液)。

2.準(zhǔn)確量取50mL低溫淬滅溶液，裝入低溫淬滅溶液貯瓶10中，瓶口連接導(dǎo)流管Ⅱ7，并使導(dǎo)流管Ⅱ7插入瓶底；細(xì)胞培養(yǎng)液段導(dǎo)流管Ⅰ6經(jīng)電磁閥5與發(fā)酵罐取樣管2連接。取樣管2頂端設(shè)有止水夾3和空氣濾膜4，細(xì)胞淬滅實驗過程中止水夾3始終夾緊，待實驗結(jié)束后打開，使取樣管2內(nèi)截留的細(xì)胞培養(yǎng)液回流到細(xì)胞供給裝置1(本實施例中為發(fā)酵罐)中，空氣濾膜4的設(shè)計確保了進(jìn)入取樣管2的空氣為無菌空氣，防止雜菌進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。閉合電源開關(guān)II19連通控制電路②，確保電磁閥5處于打開狀態(tài)(電路②斷開時，電磁閥5為關(guān)閉狀態(tài))，此時導(dǎo)流管Ⅰ6與發(fā)酵罐取樣管2連通。細(xì)胞收集瓶11和低溫淬滅溶液貯瓶10均設(shè)在封閉的恒低溫系統(tǒng)12內(nèi)部(維持其中液體溫度在-30～-40℃范圍內(nèi))，細(xì)胞收集瓶11瓶口同時連接導(dǎo)流管Ⅲ8和連接管I 13，以實現(xiàn)與低溫淬滅溶液貯瓶10和真空泵16的連接狀態(tài)，在真空泵16和細(xì)胞收集瓶11之間還設(shè)有緩沖瓶15，緩沖瓶15可以防止真空泵16中液體倒吸流入細(xì)胞收集瓶11中。在低溫淬滅溶液貯瓶10底部設(shè)有突起的金屬觸點(diǎn)A、B，通過金屬觸點(diǎn)A、B將電路①與低溫淬滅溶液貯瓶10相連。

3.閉合電路開關(guān)Ⅰ18(電路開關(guān)Ⅰ18初始狀態(tài)為打開)，電路①接通，電磁繼電器17產(chǎn)生磁力將銜鐵吸住，金屬觸片在磁力作用下與金屬觸點(diǎn)E和F連接(金屬觸片初始位置與金屬觸點(diǎn)C和D連接)，連通電路③，開啟真空泵16開關(guān)，細(xì)胞收集瓶11、緩沖瓶15、導(dǎo)流管III 8和混合室9中形成真空，發(fā)酵罐中細(xì)胞培養(yǎng)液與低溫淬滅溶液在氣壓差推動下快速進(jìn)入導(dǎo)流管I 6和II 7中，經(jīng)過文丘里管結(jié)構(gòu)，兩股流體都以分散的小液滴的形態(tài)從導(dǎo)流管中噴射出來進(jìn)入混合室9得到均勻混合，混合后被抽入連接細(xì)胞收集瓶11的導(dǎo)流管Ⅲ8中，導(dǎo)流管Ⅲ8中含有的文丘里管流體壓縮結(jié)構(gòu)，其功能是為了使分散的液滴壓縮至正常流體，最后進(jìn)入恒低溫系統(tǒng)12內(nèi)的細(xì)胞收集瓶11中。本實施例中，低溫淬滅溶液與細(xì)胞培養(yǎng)液混合后，淬滅溶劑甲醇的濃度會降低，混合后終濃度為50％(v/v)。

4.低溫淬滅溶液抽干后，低溫淬滅溶液貯瓶10底部的金屬觸點(diǎn)A和B露出液面，A和B之間連接斷開，由于溶液中無導(dǎo)電介質(zhì)(低溫淬滅溶液)存在，閉合電路①斷開，電磁繼電器17線圈不再形成磁場，失去了對電磁繼電器17上金屬觸片的吸力，金屬觸片在彈簧作用下離開觸點(diǎn)E和F，連接觸點(diǎn)C和D，斷開電路③，接通電路②，電路②連通時電磁閥5“閉合”，阻止細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)沿導(dǎo)流管Ⅰ6流入混合室9中。與此同時，觸點(diǎn)E和F與金屬觸片分離也斷開了真空泵16的電源開關(guān)，真空泵停止工作，致使整個取樣過程終止，由于細(xì)胞收集瓶11中仍然保留一定的真空度，會繼續(xù)保證混合室9內(nèi)剩余混合液能夠繼續(xù)流入細(xì)胞收集瓶11中，至完全反應(yīng)結(jié)束。停止細(xì)胞代謝淬滅操作。

當(dāng)?shù)蜏卮銣缛芤撼槿⊥戤吅螅c低溫淬滅溶液連接的導(dǎo)流管II 7低端連通空氣，此時，理論上細(xì)胞收集瓶11中就不會再有液體流入，因為空氣會優(yōu)先進(jìn)入導(dǎo)流管II 7中而阻斷細(xì)胞培養(yǎng)液從導(dǎo)流管I 6的流入，從而達(dá)到按比例混合的效果。然而，在實際模擬實驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)導(dǎo)流管II 7進(jìn)入的空氣無法及時平衡混合室9、導(dǎo)流管III 8以及細(xì)胞收集瓶11內(nèi)的負(fù)壓，導(dǎo)致仍然有細(xì)胞培養(yǎng)液會繼續(xù)流向細(xì)胞收集瓶中。雖然只有少量細(xì)胞培養(yǎng)液會流入細(xì)胞收集瓶11中，但會導(dǎo)致終點(diǎn)的淬滅溶劑濃度不可控，給重復(fù)實驗帶來困難，影響胞內(nèi)代謝物數(shù)據(jù)的真實可靠性。本發(fā)明裝置中引入由電磁繼電器控制電路①、②和③，通過電路的斷開和閉合控制電磁閥5和真空泵16的開關(guān)，從而控制細(xì)胞培養(yǎng)液的取樣量，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)液和低溫淬滅溶液的體積比的準(zhǔn)確控制。

5.細(xì)胞收集瓶11在恒低溫系統(tǒng)12中，系統(tǒng)維持在－40℃左右，而細(xì)胞收集瓶11中的混合液由低溫淬滅溶液(－40℃)和細(xì)胞培養(yǎng)液(30℃)組成，混合后的溫度保持在－20～－30℃之間，混合液進(jìn)入細(xì)胞收集瓶11后，混合液仍會維持在低溫環(huán)境中。

6.細(xì)胞混合液在低溫條件下淬滅3min后，取出細(xì)胞收集瓶11，在－20℃，12000rpm條件下離心5min，收集淬滅后的細(xì)胞。

7.為了洗除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基成分，減小其對胞內(nèi)代謝物定量的干擾，用5mL，－40℃，50％(v/v)甲醇水溶液重懸離心得到的細(xì)胞，在－20℃，12000rpm條件下離心5min，收集細(xì)胞，－80℃超低溫保存，用于胞內(nèi)代謝物的提取。