本發(fā)明涉及發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及植物乳桿菌sg5在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應用。

背景技術(shù)：

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，簡稱gaba)是哺乳動物神經(jīng)中樞的一種抑制性遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)血壓、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活力、營養(yǎng)神經(jīng)細胞、增加生長激素分泌、健肝利腎、促進乙醇代謝(醒酒)等多種功效。2009年衛(wèi)生部已正式批準gaba為新資源食品，富集gaba的原料可應用于生產(chǎn)功能性食品，通過飲食來降低和預防高血壓。gaba的獲取方法有化學合成法和生物法?；瘜W合成法成本較高，產(chǎn)品中易殘留化學物質(zhì)，不屬于天然產(chǎn)物，應用有條件限制。生物法主要從植物體和微生物發(fā)酵液中獲取，相對于植物富集法的成本高、產(chǎn)率低和局限性大的缺點，微生物發(fā)酵法更有優(yōu)越性，它不受空間、環(huán)境和資源的限制，具有成本低、無化學殘留和產(chǎn)量高等顯著優(yōu)點，是富集γ-氨基丁酸的理想途徑。

現(xiàn)有技術(shù)分離得到的產(chǎn)γ-氨基丁酸的微生物多為真菌，真菌生長較為緩慢，不能滿足生產(chǎn)需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供植物乳桿菌sg5在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

植物乳桿菌sg5在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應用，該植物乳桿菌sg5保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址是廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年3月16日，保藏編號為gdmccno：60020。

本發(fā)明通過篩選獲得一株可產(chǎn)γ-氨基丁酸的植物乳桿菌sg5，在mrs培養(yǎng)基上菌落較小、圓形、中間隆起，表面濕潤光滑，不透明，乳白色，邊緣整齊；革蘭氏陽性菌，成對或鏈狀。菌株形態(tài)呈兩端鈍圓的短桿狀，長短不一，無芽孢，細胞大小為(0.5～1)μm×(2～3)μm，植物乳桿菌sg5為兼性厭氧菌，api50鑒定結(jié)果與植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)的id為99.9％。

本發(fā)明植物乳桿菌sg5可在mrs培養(yǎng)基上生長，其中培養(yǎng)基的最佳配方為20g/l酵母膏、20g/l葡萄糖、10g/l丁二酸鈉、5mg/mll-谷氨酸、1mg/l磷酸吡哆醛及1mg/mlca²⁺。

所述植物乳桿菌sg5的16srdna序列如seqidno：1所示。

γ-氨基丁酸作為新型功能因子，具有降低血壓的作用，因此可將該植物乳桿菌sg5擴大培養(yǎng)用于發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸。

具體地，所述植物乳桿菌sg5在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應用，是將植物乳桿菌sg5接種于液體培養(yǎng)基中30～37℃下培養(yǎng)16～48h即可。

更優(yōu)選地，所述液體培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有20g/l酵母膏、20g/l葡萄糖、10g/l丁二酸鈉、5mg/mll-谷氨酸、1mg/l磷酸吡哆醛及1mg/mlca²⁺。

最優(yōu)選地，所述應用是將植物乳桿菌sg5接種于液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48h，ph值為6.8，所述植物乳桿菌sg5的接種量為2％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了植物乳桿菌sg5在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應用，該植物乳桿菌sg5保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址是廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年3月16日，保藏編號為gdmccno：60020；利用該菌進行發(fā)酵gaba的含量可達59μg/ml，gaba具有降血壓、促進生長激素分泌和降低膽固醇等多種有益的保健功能，為開發(fā)新的富含γ-氨基丁酸的保健食品提供依據(jù)，將所述植物乳桿菌sg5應用于富含gaba的食品、保健品的開發(fā)，具有廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1為基于16srdna基因序列建立的乳桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖2為發(fā)酵液超高效液相色譜-質(zhì)譜圖；其中，a—gaba標準品的峰圖；b—gaba標準品分子質(zhì)量圖譜；c—發(fā)酵液樣品超高效液相色譜圖；d—發(fā)酵液樣品的分子質(zhì)量圖譜。

圖3為sg5在mrs培養(yǎng)基(a)及乳酸菌分離培養(yǎng)基(含溴甲酚綠)平板(b)上的菌落形態(tài)圖。

圖4為菌株sg5革蘭氏染色的細胞形態(tài)。

圖5為sg5菌體投射電鏡圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1菌株的分離、篩選與鑒定

菌株分離：選取新鮮完整的桑葉先用自來水沖洗干凈，在無菌超凈臺內(nèi)用無菌水再沖洗及用無菌濾紙吸干水分，剪碎；將剪碎的桑葉置于mrsg液體培養(yǎng)基(mrs培養(yǎng)基中加入2％v/v，1mg/ml的谷氨酸鈉)中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，待桑葉碎片周圍長出菌體，挑取菌體在mrs固體培養(yǎng)基上多次劃線分離純化；將純化后的菌株于斜面培養(yǎng)基(mrs)培養(yǎng)，挑單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基tyg中30℃培養(yǎng)48h后做薄層定性，初步鑒定分離可知所得菌株可產(chǎn)γ-氨基丁酸。

陰性對照：為了檢查桑葉表面除菌是否徹底，取最后一次無菌水沖洗液涂布在mrs固體培養(yǎng)基上作對照，另將無菌水清洗后的桑葉材料在mrs固體培養(yǎng)基上作對照，于相同的條件下培養(yǎng)。

經(jīng)過多次重復，對照的平板培養(yǎng)基均無任何菌落長出，證明桑葉表面除菌徹底，分離到的菌是桑葉內(nèi)細菌，而不是植株表面的附生菌。

菌株的篩選：以功能活性物質(zhì)—γ-氨基丁酸為指標，采用響應面分析法優(yōu)化菌株發(fā)酵條件。將-80℃保存的分離所得菌株于mrs液體培養(yǎng)基中30℃，120r/min培養(yǎng)16h，活化兩次，接種于tyg發(fā)酵培養(yǎng)基中富集gaba。根據(jù)單因素實驗結(jié)果對4個主要因素(底物濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間)進行響應面優(yōu)化實驗，建立實驗模型，若實驗模型顯著，利用響應面優(yōu)化試驗方法，最終設(shè)計三因素三水平的響應面實驗，以底物濃度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間3個因素為自變量，gaba產(chǎn)量為響應值，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。用berthelot比色法或hplc法對發(fā)酵液中富集的gaba定量分析，最終確定高產(chǎn)gaba菌株(簡稱為sg)。

菌株分子鑒定：對篩選得到的高產(chǎn)gaba菌株進行分子鑒定，按以下步驟進行：提取菌株的基因組dna，利用細菌16srdna的通用引物，以基因組dna為模板進行pcr擴增。然后利用膠回收試劑盒回收純化pcr產(chǎn)物，之后進行克隆、轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆的菌落，經(jīng)擴大培養(yǎng)后委托廣州華大基因技術(shù)有限公司進行測序。

測序可知菌株的16srdna序列長度為1371bp，其序列如seqidno：1所示，將測序結(jié)果與genbank中的16srdna序列進行同源性比對，然后用軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與lactobacillusplantarum(植物乳桿菌)的同源性達99％，因此將該高產(chǎn)gaba的菌株屬于乳桿菌屬(lactobacillus)，為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)。

菌株菌落形態(tài)鑒定：在mrs培養(yǎng)基上菌落較小、圓形、中間隆起，表面濕潤光滑，不透明，乳白色，邊緣整齊；在乳酸菌分離培養(yǎng)基(含溴甲酚綠)平板，30℃培養(yǎng)48h，出現(xiàn)圓形乳白或黃色菌落，周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步確定為乳酸菌(如圖3所示)。菌體形態(tài)經(jīng)革蘭氏染色后用顯微鏡于100倍的油鏡下觀察并拍照。如圖4所示，可知其為革蘭氏陽性菌，成對或鏈狀。菌株細胞經(jīng)透射電鏡(tem,tenai12,holland)觀察，見圖5，形態(tài)呈兩端鈍圓的短桿狀，長短不一，無芽孢，細胞大小為(0.5～1)μm×(2～3)μm。

菌落生理生化鑒定：參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第九版)、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和法國生物梅里埃api鑒定系統(tǒng)對植物乳桿菌進行鑒定，其結(jié)果如表1所示：

表1菌株sg-5的api50chl檢測結(jié)果

注：“﹣”表示陰性，“﹢”表示陽性。

由表1結(jié)果再次驗證，植物乳桿菌sg5api的id與lactobacillusplantarum(植物乳桿菌)為99％，將其命名為該植物乳桿菌sg5，該植物乳桿菌sg5保藏在廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏地址是廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年3月16日，保藏編號為gdmccno：60020。

實施例2菌株的培養(yǎng)

植物乳桿菌sg5可在mrs培養(yǎng)基上生長，mrs培養(yǎng)基(1000ml)由20g酵母膏、20g葡萄糖、10g丁二酸鈉、5mg/mll-谷氨酸(0.5％v/v)、1mg磷酸吡哆醛(生長因子)及1mg/mlca²⁺和余量的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)ph值6.8～7.0，于121℃高壓滅菌20min。

1、植物乳桿菌sg5的活化：在超凈工作臺中無菌操作。用接種環(huán)挑取植物乳桿菌sg5，在mrs固體培養(yǎng)基上用接種環(huán)劃線，在30℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)2d。

2、植物乳桿菌sg5發(fā)酵樣品的制備：將分離得到的植物乳桿菌sg5接種于mrs液體培養(yǎng)基中，作3個重復，置于150r/min，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16～18h取出，作為種子液；將種子液按2％的接種量接種到裝有50mltyg液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于150r/min30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，得發(fā)酵液(經(jīng)優(yōu)化得植物乳桿菌sg5的最適生長溫度為30℃，最適生長環(huán)境的ph值為6.8)。

3、用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法對發(fā)酵液樣品中g(shù)aba進行定性及定量的檢測：gaba標準品購至sigma公司，乳酸菌發(fā)酵液樣品的超高效液相色譜-質(zhì)譜分析圖與標準品gaba相比較見圖2。

由圖2可以看出標準品gaba的出峰時間在0.4～0.6min，其相對分子質(zhì)量為104.0707；檢測發(fā)酵液樣品gaba相對分子質(zhì)量為104.1072，與標準品gaba的相對分子質(zhì)量十分接近，發(fā)酵液樣品的出峰時間較標樣的略寬些，還有一個小的雜峰出現(xiàn)，有可能是受到其他基質(zhì)的干擾。該結(jié)果證實了發(fā)酵液中含有g(shù)aba。

4、高效液相色譜法(hplc)測定發(fā)酵液gaba含量

將sg5的發(fā)酵液沸水浴10min后，以12000r/min離心10min，用微量進樣器吸取上清液用高效液相色譜法(hplc)法分別測定初篩的五個樣品發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的濃度(優(yōu)化得植物乳桿菌sg5產(chǎn)γ-氨基丁酸的最佳液體發(fā)酵時間為48h，gaba的含量可達59μg/ml)。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學

<120>植物乳桿菌sg5在產(chǎn)γ-氨基丁酸中的應用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1371

<212>dna

<213>植物乳桿菌sg5的16srdna序列

<400>1

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