本發(fā)明涉及聚合酶鏈式反應檢測技術領域，特別是涉及一種聚合酶鏈式反應檢測裝置及方法。

背景技術：

聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,pcr)是一種體外擴增特定核酸的分子生物學技術，具有特異性強、靈敏度高、高效快捷、操作簡單等突出優(yōu)點。數字pcr是將含有引物、模板、熒光探針及聚合酶等組份的pcr反應體系分成眾多微小的、獨立的反應單元。經過pcr擴增反應后，對每個反應單元的熒光信號進行檢測，有目標dna片段的微滴在擴增后會發(fā)出較強熒光，即陽性微滴；無目標dna片段的微滴在擴增后只有微弱的本底熒光，即陰性微滴；將陽性微滴記為1，陰性微滴則記為0，再根據泊松分布原理，計算得出目標dna的起始拷貝數或濃度。

傳統技術中數字pcr是通過熒光法對陽性微滴和陰性微滴進行分析檢測。但是其中陰性微滴的熒光非常弱，通過熒光法檢測分析時經常出現漏檢或錯檢的情況。此外，通過熒光法檢測分析微滴時對其特征參數識別度不高，且存在熒光染料泄露、管路較難清洗及易受環(huán)境干擾等問題，易將一些異常的強熒光信號干擾誤判為陽性微滴，造成陽性微滴的錯檢。因此，基于熒光法檢測的數字pcr的準確性和靈敏度都較低。

技術實現要素：

基于此，有必要提供一種準確性和靈敏度高的聚合酶鏈式反應檢測裝置及方法。

一種聚合酶鏈式反應檢測裝置，用于檢測樣品微滴，包括樣品傳送機構、激發(fā)光光源機構、光學檢測機構、阻抗檢測機構及控制機構；

所述樣品傳送機構具有用于傳送所述樣品微滴的傳送微通道以及僅供單排所述樣品微滴通過的檢測微通道，所述檢測微通道設于所述傳送微通道的一端且與所述傳送微通道連通，所述樣品傳送機構在檢測微通道段設有光學檢測窗口；

所述激發(fā)光光源機構具有用于激發(fā)所述樣品微滴產生熒光信號的激發(fā)光光源；

所述光學檢測機構具有用于收集和轉換所述樣品微滴中熒光信號的熒光探測器；

所述阻抗檢測機構包括激勵電源、電極及阻抗分析儀，所述電極至少有兩個，分別為第一電極和第二電極，所述激勵電源、所述第一電極、所述第二電極與所述阻抗分析儀相連接形成回路，所述第一電極與所述第二電極設在所述檢測微通道的表面并均與所述檢測微通道交叉接觸，所述第一電極與所述第二電極之間形成能夠容納至少一個所述樣品微滴的檢測區(qū)域，所述阻抗分析儀用于收集所述樣品微滴通過所述檢測區(qū)域產生的阻抗信號；

所述控制機構用于分析所述熒光探測器收集的熒光信號及所述阻抗分析儀收集的阻抗信號；

所述樣品微滴經所述傳送微通道依次逐個進入到所述檢測微通道，所述光學檢測機構和所述阻抗檢測機構對所述檢測微通道中的同一個所述樣品微滴分別進行熒光信號和阻抗信號收集，其中，所述激發(fā)光光源通過所述光學檢測窗口照射所述檢測微通道中的所述樣品微滴，激發(fā)所述樣品微滴產生熒光信號，所述熒光探測器通過所述光學檢測窗口收集所述熒光信號并將收集到的所述熒光信號轉換為數字信號傳輸到所述控制機構；所述阻抗分析儀收集所述樣品微滴通過所述檢測區(qū)域產生的阻抗信號并將收集到的所述阻抗信號傳輸到所述控制機構，所述控制機構同步分析所述熒光信號和所述阻抗信號得到所述樣品微滴的有效數據。

在其中一個實施例中，所述樣品傳送機構還包括稀釋微通道，所述稀釋微通道有兩個，分別為第一稀釋微通道和第二稀釋微通道，所述第一稀釋微通道和所述第二稀釋微通道分別設所述傳送微通道的兩側，所述第一稀釋微通道、所述第二稀釋微通道和所述傳送微通道在其與所述檢測微通道連通的一端處交叉連通，且所述第一稀釋微通道和所述第二稀釋微通道與所述檢測微通道相連通。

在其中一個實施例中，所述第一稀釋微通道和所述第二稀釋微通道的另一端設有用于供所述樣品微滴稀釋液進入的第一進液微通道和第二進液微通道，所述傳送微通道的另一端設有用于供所述樣品微滴進入的進樣微通道，所述第一稀釋微通道與第一進液微通道、所述第二稀釋微通道與第二進液微通道及所述傳送微通道與所述進樣微通道的連接處分別設有用于封閉的密封圈和夾具。

在其中一個實施例中，所述第一電極與所述第二電極平行設置。

在其中一個實施例中，所述第一電極與所述第二電極分別設在所述光學檢測窗口的兩側。

在其中一個實施例中，所述第一電極與所述第二電極垂直于所述檢測微通道中所述樣品微滴的流動方向。

在其中一個實施例中，所述第一電極與所述第二電極寬度均為10μm-20μm。

在其中一個實施例中，所述檢測區(qū)域的長度為1.5-2個所述樣品微滴的粒徑。

在其中一個實施例中，所述第一電極與所述第二電極的端部均位于所述樣品傳送機構的外部且外接于pcb板上。

本發(fā)明中聚合酶鏈式反應檢測裝置通過使用光學檢測機構和阻抗檢測機構共同檢測樣品微滴，將阻抗檢測法和熒光檢測法結合使用，從多個維度對樣品微滴進行檢測分析。本發(fā)明同時檢測每個樣品微滴的熒光信號和阻抗信號，對于熒光量很低的陰性微滴，通過阻抗信號能夠準確區(qū)分是否是樣品微滴；對于熒光量較高的陽性微滴，通過阻抗信號識別出微滴大小，并判斷是否真的是陽性微滴，降低陽性微滴的錯檢率。利用阻抗數據對熒光數據進行修正，可以減少外界環(huán)境的干擾，避免了只通過熒光信號對樣品微滴檢測出現的錯檢或漏檢的情況，該聚合酶鏈式反應檢測裝置準確性和靈敏度較高。

此外，采用阻抗檢測機構輔助進行樣品微滴有無的檢測，提高了該裝置對陰性微滴的檢測靈敏度和準確性，并降低了對控制機構信噪比的要求。該聚合酶鏈式反應檢測裝置的系統設計簡便，制造成本低。

此外，還有必要提供一種聚合酶鏈式反應檢測方法。

一種聚合酶鏈式反應檢測方法，使用上述任一項所述聚合酶鏈式反應檢測裝置檢測所述樣品微滴，所述聚合酶鏈式反應檢測方法包括如下步驟：

將含有所述樣品微滴的樣品溶液泵入所述傳送微通道，所述樣品微滴經所述傳送微通道依次逐個通過所述檢測微通道的光學檢測窗口；

控制所述激發(fā)光光源通過所述光學檢測窗口照射所述檢測微通道中的所述樣品微滴，激發(fā)所述樣品微滴產生熒光信號，所述熒光探測器通過所述光學檢測窗口收集所述熒光信號并將收集到的所述熒光信號轉換為數字信號傳輸到所述控制機構；

同時控制所述阻抗分析儀收集所述樣品微滴通過所述第一電極與所述第二電極之間的所述檢測區(qū)域產生的阻抗信號并將收集到的所述阻抗信號傳輸到所述控制機構；

所述控制機構同步分析所述熒光信號和所述阻抗信號，通過所述熒光信號提取所述樣品微滴的熒光幅值和第一脈寬，通過所述阻抗信號提取所述微樣品滴的阻抗幅值和第二脈寬，同步分析所述熒光信號和所述阻抗信號的數據信息得到所述樣品微滴的有效數據。

本發(fā)明中聚合酶鏈式反應檢測方法通過將阻抗檢測法和熒光檢測法結合使用，從多個維度對樣品微滴進行檢測分析，得到樣品微滴的數量以及微滴熒光強度的準確性和靈敏度高。

附圖說明

圖1為一實施方式的聚合酶鏈式反應光學檢測裝置的結構示意圖；

圖2為一實施方式的聚合酶鏈式反應光學檢測裝置中阻抗檢測機構中三個電極的位置示意圖；

圖3為一實施方式的聚合酶鏈式反應光學檢測裝置中阻抗檢測機構的結構示意圖；

圖4為一實施方式的聚合酶鏈式反應光學檢測裝置中阻抗檢測機構和光學檢測窗口的位置示意圖；

圖5為一實施方式的聚合酶鏈式反應光學檢測方法的流程示意圖；

圖6為一實施方式的聚合酶鏈式反應光學檢測方法中控制結構同步分析的流程示意圖。

具體實施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內容的理解更加透徹全面。

需要說明的是，當元件被稱為“固定于”另一個元件，它可以直接在另一個元件上或者也可以存在居中的元件。當一個元件被認為是“連接”另一個元件，它可以是直接連接到另一個元件或者可能同時存在居中元件。

除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發(fā)明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術語“和/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。

如圖1所示，一實施方式的聚合酶鏈式反應檢測裝置10，用于檢測樣品微滴20，包括樣品傳送機構100、激發(fā)光光源機構200、光學檢測機構300、阻抗檢測機構400及控制機構500。

該樣品傳送機構100具有用于傳送該樣品微滴20的傳送微通道102以及僅供單排該樣品微滴20通過的檢測微通道101，該檢測微通道101設于該傳送微通道102的一端且與該傳送微通道102連通，該樣品傳送機構100在檢測微通道段設有光學檢測窗口(圖未示)，激發(fā)光光源機構200可以通過光學檢測窗口照射檢測微通道101中的激發(fā)該樣品微滴20產生熒光信號，光學檢測機構300也可以通過光學檢測窗口收集檢測微通道101中的該樣品微滴20產生的熒光信號。

在其中一個實施方式中，該樣品傳送機構100還包括稀釋微通道，用于傳送稀釋液沖洗樣品微滴20。該稀釋微通道有兩個，分別為第一稀釋微通道103和第二稀釋微通道104，該第一稀釋微通道103和該第二稀釋微通道104分別設在該傳送微通道102的兩側，該第一稀釋微通道103、該第二稀釋微通道104和該傳送微通道102在其與該檢測微通道101連通的一端處交叉連通，且該第一稀釋微通道103和該第二稀釋微通道104與該檢測微通道101相連通。

樣品微滴20在傳送微通道102內聚集流動，到達與檢測微通道101相連通的一端處時，與第一稀釋微通道103和第二稀釋微通道104中流出的稀釋液交匯，樣品微滴20在稀釋液的作用下逐個分開進入到檢測微通道101中?？蛇x地，通過調整第一稀釋微通道103和第二稀釋微通道104中稀釋液的流速，控制每個樣品微滴20之間的距離至少三倍于單個樣品微滴20的粒徑。

在其中一個實施方式中，該第一稀釋微通道103和該第二稀釋微通道104的另一端(相對于該第一稀釋微通道103、該第二稀釋微通道104與該傳送微通道102交匯連通端的一端)設有用于供該樣品微滴20稀釋液進入的第一進液微通道113和第二進液微通道114，該傳送微通道102的另一端設有用于供該樣品微滴20進入的進樣微通道112，該第一稀釋微通道103與第一進液微通道113、該第二稀釋微通道104與第二進液微通道114及該傳送微通道102與該進樣微通道112的連接處分別設有密封圈110和夾具111。

第一稀釋微通道103、該第二稀釋微通道104及該傳送微通道102在夾具111和密封圈110的作用下與第一進液微通道113、第二進液微通道114及進樣微通道112的端口對齊，并在密封圈110和夾具111的作用下達到密封效果。

該激發(fā)光光源機構200具有用于激發(fā)該樣品微滴20產生熒光信號的激發(fā)光光源(圖未示)，該激發(fā)光光源通過該光學檢測窗口照射該檢測微通道中的該樣品微滴20，激發(fā)該樣品微滴20產生熒光信號。

在其中一個實施方式中，該激發(fā)光光源機構200還包括聚焦透鏡(圖未示)，聚焦透鏡用于對光束進行聚焦處理?？蛇x地，激發(fā)光光源照射出的光束先進行準直整形處理，再通過聚焦透鏡聚焦，聚焦后的光斑從阻抗檢測機構400之間穿過通過光學檢測窗口照射到樣品微滴20。

光學檢測機構300具有用于收集和轉換該樣品微滴20中熒光信號的熒光探測器(圖未示)，該熒光探測器通過該光學檢測窗口收集該樣品微滴20的熒光信號并將收集到的該熒光信號轉換為電信號，再經信號放大電路放大，由采樣電路完成數字信號的采樣并傳輸到控制機構400。

阻抗檢測機構400包括激勵電源401、電極及阻抗分析儀404。在電極的一側通過導線接入激勵電源401，在電極的另一側通過導線接入阻抗采集儀404。激勵電源401用于提供阻抗；電極至少有兩個，用于檢測樣品微滴20的阻抗信號；阻抗分析儀404的激勵信號可以是電流激勵，也可以是電壓激勵，用于收集樣品微滴20的阻抗信號。

激發(fā)光光源照射樣品微滴20的光學檢測窗口可以位于多個電極之間，也可以位于多個電極的一側，只要確保多個電極之間形成的最大檢測區(qū)域每一次檢測的樣品微滴20與激發(fā)光光源照射的樣品微滴20是同一個即可。

在其中一個實施方式中該電極有兩個，分別為第一電極402和第二電極403。該激勵電源401、該第一電極402、該第二電極403與該阻抗分析儀404相連接形成回路，該第一電極402與該第二電極403設在該檢測微通道101的表面并均與該檢測微通道101交叉接觸，該第一電極402與該第二電極403之間形成能夠容納至少一個該樣品微滴20的檢測區(qū)域，該阻抗分析儀404用于收集該樣品微滴20通過該檢測區(qū)域產生的阻抗信號?？蛇x地，該第一電極402與該第二電極403寬度均為10μm-20μm。該檢測區(qū)域的長度為1.5-2個該樣品微滴的粒徑。進一步可選地，第一電極402和第二電極403的材料是金。

在其中一個實施方式中，該第一電極402與該第二電極403平行設置。該第一電極402與該第二電極403分別設在該光學檢測窗口的兩側。可選地，該第一電極402與該第二電極403位于檢測微通道101的下表面且垂直于該檢測微通道中該樣品微滴的流動方向。

第一電極402通過導線與激勵電源401及阻抗分析儀404相連接，第二電極403通過導線與激勵電源401及阻抗分析儀404相連接，且其共同連接形成回路。激發(fā)光光源照射出的光束從第一電極402與該第二電極403之間穿過經光學檢測窗口照射到樣品微滴20，保證第一電極402與該第二電極403形成的檢測區(qū)域每一次檢測的樣品微滴20與激發(fā)光光源照射的樣品微滴20是同一個。

如圖2所示的一個實施方式中，電極有三個，其中第一電極402和第二電極403之間設有公共電極405，第一電極402和第二電極403之間的距離至少可以容納一個樣品微滴20。第一電極402、第二電極403和公共電極405之間形成差分信號，第一電極402、第二電極403和公共電極405的一端通過導線與激勵電源401連接，另一端通過導線與阻抗分析儀404相連接。通過設置第一電極402、第二電極403和公共電極405可以提高收集的阻抗信號的準確性。

如圖3所示的一個實施方式中，由于位于檢測微通道101表面的電極尺寸較小，很難外接到外部電路上，該第一電極402與該第二電極403的端部均延伸于該樣品傳送機構100的外部且外接于pcb板30上。檢測微通道101表面的電極與pcb板30上的電極通過焊錫或金屬涂層連接在一起。外接于pcb板30上的該第一電極402與該第二電極403的寬度可以為1.27mm、2.0mm或2.54mm等，該寬度只要適用于連接pcb板30的通用管腳即可。可選地，外接于pcb板30上的該第一電極402與該第二電極403的寬度均為1.27mm，便于外接外圍電路。

如圖4所示的一個實施方式中，激發(fā)光光源照射出的光束可以緊挨著電極的位置從電極的側面通過，只要保證每次電極之間形成的檢測區(qū)域檢測到的樣品微滴20與激發(fā)光光源照射的樣品微滴20時同一個即可。

控制機構500用于分析該熒光探測器收集的熒光信號及該阻抗分析儀404收集的阻抗信號，其中熒光探測器收集的熒光信號及該阻抗分析儀404收集的阻抗信號屬于同一個樣品微滴20。

該樣品微滴20經該傳送微通道102依次逐個進入到該檢測微通道101，該光學檢測機構300和該阻抗檢測機構400對該檢測微通道101中的同一個該樣品微滴20分別進行熒光信號和阻抗信號收集，其中，該激發(fā)光光源通過該光學檢測窗口照射該檢測微通道中101的該樣品微滴20，激發(fā)該樣品微滴20產生熒光信號，該熒光探測器通過該光學檢測窗口收集該熒光信號并將收集到的該熒光信號轉換為數字信號傳輸到該控制機構500；該阻抗分析儀404收集該樣品微滴20通過該檢測區(qū)域產生的阻抗信號并將收集到的該阻抗信號傳輸到該控制機構500，該控制機構500同步分析該熒光信號和該阻抗信號得到該樣品微滴20的有效數據，如是否為所測樣品微滴、樣品微滴的信號波形脈寬及樣品微滴的熒光數據等所需數據信息。

本發(fā)明中的聚合酶鏈式反應檢測裝置10通過使用光學檢測機構300和阻抗檢測機構400共同檢測樣品微滴20，將阻抗檢測法和熒光檢測法結合使用，從多個維度對樣品微滴20進行檢測分析。本發(fā)明同時檢測每個樣品微滴20的熒光信號和阻抗信號，對于熒光量很低的陰性微滴，通過阻抗信號能夠準確區(qū)分是否是樣品微滴20；對于熒光量較高的陽性微滴，通過阻抗信號識別出微滴大小，并判斷是否真的是陽性微滴，降低陽性微滴的錯檢率。利用阻抗數據對熒光數據進行修正，可以減少受到環(huán)境的干擾，避免了只通過熒光信號對樣品微滴20檢測出現的錯檢或漏檢的情況，該聚合酶鏈式反應檢測裝置準確性和靈敏度較高。

此外，采用阻抗檢測機構400輔助進行樣品微滴20有無的檢測，提高了該裝置對陰性微滴的檢測靈敏度和準確性，并降低了對控制機構500信噪比的要求。該聚合酶鏈式反應檢測裝置的系統設計簡便，制造成本低。

此外，還有必要提供一種聚合酶鏈式反應檢測方法。

一種聚合酶鏈式反應檢測方法，使用上述任一項該聚合酶鏈式反應檢測裝置10檢測該樣品微滴20，該聚合酶鏈式反應檢測方法如圖5所示包括如下步驟：

該樣品微滴20經該傳送微通道102依次逐個通過該檢測微通道101的光學檢測窗口，可選地，在檢測微通道101中每個樣品微滴20的間距至少三倍于單個微滴樣品的粒徑。

該激發(fā)光光源通過該光學檢測窗口照射該檢測微通道101中的該樣品微滴20，激發(fā)該樣品微滴20產生熒光信號，該熒光探測器通過該光學檢測窗口收集該熒光信號并將收集到的該熒光信號轉換為數字信號傳輸到該控制機構500；

同時該阻抗分析儀404收集該樣品微滴20通過該第一電極402與該第二電極403之間的該檢測區(qū)域產生的阻抗信號并將收集到的該阻抗信號傳輸到該控制機構500；

該控制機構500同步分析該熒光信號和該阻抗信號，通過該熒光信號提取該樣品微滴20的熒光幅值和第一脈寬，通過該阻抗信號提取該微樣品滴20的阻抗幅值和第二脈寬，同步分析該熒光信號和該阻抗信號的數據信息得到該樣品微滴20的有效數據，如是否為所測樣品微滴、樣品微滴的信號波形脈寬及樣品微滴的熒光數據等所需數據信息。

控制機構500同步分析該熒光信號和該阻抗信號的流程如圖6所示，根據所述阻抗信號提取的阻抗幅值和第二脈寬的閾值判斷該信號是否是樣品微滴20，如果所述阻抗信號判斷是樣品微滴20則再根據所述熒光信號提取所述樣品微滴20的熒光幅值和第一脈寬判斷是否是樣品微滴20，如果所述熒光信號也判斷是樣品微滴20則記錄樣品微滴20的激發(fā)光數值作為熒光數據，并根據所述熒光幅值范圍判斷所述熒光數據是否正常，如果熒光信號判斷不是樣品微滴20則認為是熒光信號判斷出現偏差，仍然判斷該信號為樣品微滴20，并取該樣品微滴20的激發(fā)光數值的平均值作為該樣品微滴20的熒光數據，如果阻抗信號判斷不是樣品微滴20則認為該信號不是樣品微滴20，不記錄該樣品微滴20的熒光數據，綜上得到所述樣品微滴20的有效數據，如是否為所測樣品微滴、樣品微滴的信號波形脈寬及樣品微滴的熒光數據等所需數據信息。

根據信號提取的脈寬靈敏度，熒光信號的靈敏度低于阻抗信號的靈敏度，所以熒光信號對于第二脈寬的閾值判斷要比阻抗信號對于第一脈寬的閾值判斷要大一些。

本發(fā)明中聚合酶鏈式反應檢測方法通過將阻抗檢測法和熒光檢測法結合使用，從多個維度對樣品微滴20進行檢測分析，得到樣品微滴的數量以及微滴熒光強度的準確性和靈敏度高。

本發(fā)明提到的聚合酶鏈式反應檢測方法中的熒光信號，包括但不僅限于一維，也可以為二維及以上的多路熒光信號。如本發(fā)明也可以適用于現在常用的fam和vic的二維熒光系統。

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。