一種利用同源表位肽抗體檢測原肌球蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種原肌球蛋白的檢測方法，特別涉及一種利用同源表位肽抗體檢測 原肌球蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們生活水平的提高，蝦蟹類水產(chǎn)品的消費量日益增加，2013年全國水產(chǎn)品 總產(chǎn)量5907. 68萬噸，人均占有量43. 63千克，已經(jīng)成為我國人民重要的食物來源。但蝦蟹 類水產(chǎn)品是聯(lián)合國糧農(nóng)組織公布的八大類食物過敏原之一，我國的調(diào)研數(shù)據(jù)也表明蝦蟹類 水產(chǎn)品是引發(fā)消費者發(fā)生過敏性疾病的主要原因。此外，處于保護消費者安全及貿(mào)易保護 的目的，發(fā)達國家針對食物過敏原，制定了嚴格的檢測標準和指標，由此形成有效的貿(mào)易壁 皇。近年來我國的食品出口因為過敏原問題被扣留、退回、索賠和終止合同的事件等經(jīng)常發(fā) 生，部分產(chǎn)品甚至長期受阻。因此，水產(chǎn)品過敏原的問題已經(jīng)成為制約我國水產(chǎn)品行業(yè)發(fā)展 的重要瓶頸因素。
[0003] 為了有效的消除或緩解水產(chǎn)品過敏原對人們身體健康及相關(guān)行業(yè)所造成的危害， 首先要發(fā)展先進的檢測技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上建立合理、完善的檢測體系。從目前國內(nèi)外的發(fā) 展情況看，這一檢測體系包括快速篩選檢測技術(shù)和確證檢測方法，首先利用前者對大量樣 本進行現(xiàn)場、快速的篩檢，從中發(fā)現(xiàn)的疑似樣本則利用后者進行最終的驗證。
[0004] 包括蝦蟹類水產(chǎn)品過敏原，目前食品過敏原的確證性檢測主要利用液相色譜-質(zhì) 譜聯(lián)用等大型儀器進行，已經(jīng)形成了較為成熟的檢測方法。由于過敏原種類繁多，不同的水 產(chǎn)品中過敏原或多或少的有一些差異。因此盡管免疫分析等檢測手段已經(jīng)取得了較快的發(fā) 展并顯示出巨大的潛力，但較高的研究和使用成本使它們還無法作為理想的快速篩選工具 而普及使用。對于包括水產(chǎn)品過敏原在內(nèi)的食品過敏原，目前均難以實現(xiàn)大量樣品高效的 快速篩選和現(xiàn)場檢測，這也是當前世界食品安全研究領(lǐng)域的關(guān)鍵問題和難點問題之一。而 面對當前蝦蟹類水產(chǎn)品產(chǎn)量大、種類繁多、特別是以蝦蟹類水產(chǎn)品為原料的調(diào)理食品呈現(xiàn) 快速增長的現(xiàn)實情況，水產(chǎn)品過敏原快速篩選技術(shù)的研究和開發(fā)顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用同源表位肽抗體檢測原肌球蛋白的方法，突破針 對單一過敏原逐個發(fā)展檢測方法的免疫分析模式，而針對蝦蟹類水產(chǎn)品過敏原，研究制備 了具有廣譜識別能力的族特異性表位肽抗體，開發(fā)了一種新型的水產(chǎn)品過敏原檢測方法， 實現(xiàn)了水產(chǎn)品中過敏原的高通量快速檢測。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0007] 1. -種利用同源表位肽抗體檢測原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0008] 1)海產(chǎn)品中原肌球蛋白同源表位的篩選
[0009] 在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫收集多種海產(chǎn)品原肌球蛋白的氨基酸序列，將獲得的原肌球 蛋白的氨基酸序列利用EBI中的Clustalw軟件進行多序列比對，結(jié)果用Bioedit軟件分析 其中保守和非保守區(qū)域位置，篩選確定不同原肌球蛋白的共同表位，稱為同源表位；
[0010] 2)表位肽的線性合成及鑒定
[0011] 將步驟1)篩選得到的同源表位采用F-m〇C法進行固相合成，采用高效液相色譜進 行純化后，得到純度為99%的表位肽，并采用質(zhì)譜進行鑒定；
[0012] 3)表位肽多克隆抗體的制備
[0013] 以表位肽為抗原，結(jié)合血藍蛋白合成完全抗原后，免疫BALB/c小鼠，制備表位肽 的多克隆抗體，并通過proteinGSepharose親和柱進行純化，得表位肽多克隆抗體；
[0014] 4)海產(chǎn)品原肌球蛋白競爭性ELISA檢測方法的建立
[0015] 以蝦原肌球蛋白（蝦過敏原蛋白）為標準品，稀釋后以蝦原肌球蛋白l〇〇ng/ 孔的包被量進行96孔板包被，將梯度濃度的蝦原肌球蛋白液分別與等體積的表位肽多 克隆抗體液共同加入96孔板包被孔中孵育，以辣根過氧化物酶標記的二抗進行檢測，以 3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺作為顯色劑，用H2S04終止后，測定450nm的吸光值，并繪制標準 曲線（橫坐標為抗原濃度，縱坐標為吸光值）；
[0016] 5)待檢樣品中原肌球蛋白的檢測
[0017] 將待檢樣品中的原肌球蛋白進行抽提，以蝦原肌球蛋白100ng/孔的包被量進行 96孔板包被，將抽提得到的待檢樣品中的原肌球蛋白液與等體積的表位肽多克隆抗體液共 同加入96孔板包被孔中孵育，以辣根過氧化物酶標記的二抗進行檢測，以3, 3'，5, 5' -四甲 基聯(lián)苯胺作為顯色劑，用H2S04終止后，測定450nm的吸光值，將待檢樣品的0D值換算成B/ B0,其中B為待檢樣品在450nm的0D值，B0為空白對照的0D值，根據(jù)步驟4)繪制的標準 曲線計算出待檢樣品中原肌球蛋白的含量，當測定的0D值位于標準曲線線性區(qū)域內(nèi)，即為 待測樣品中有原肌球蛋白檢出，反之視為未檢出。
[0018] 作為優(yōu)選，所述海產(chǎn)品包括蝦類和蟹類。
[0019] 作為優(yōu)選，辣根過氧化物酶標記的二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG抗體。
[0020] 作為優(yōu)選，步驟4)中梯度濃度的蝦原肌球蛋白溶液的濃度梯度為：0.Ing/mL， Ing/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL，10μg/mL，100μg/mL，1000μg/mL。
[0021] 作為優(yōu)選，表位肽多克隆抗體溶液為表位肽多克隆抗體用pH7. 4的含有0. 5%BSA 的PBST按照lg:2000mL的稀釋比稀釋而成。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是：以表位肽抗體為基礎(chǔ)建立的檢測方法，不但解決了當前由 于蝦蟹類水產(chǎn)品種類繁多帶來的檢測結(jié)果不準確的問題，而且能夠消除加工或貯藏等因素 對檢測結(jié)果的影響。
【附圖說明】
[0023] 圖1是間接競爭ELISA法檢測蝦原肌球蛋白的標準曲線。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。
[0025]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0026] 實施例：
[0027] -種利用同源表位肽抗體檢測原肌球蛋白的方法，包括以下步驟：
[0028] 1)海產(chǎn)品中原肌球蛋白同源表位的篩選
[0029] 取4種已經(jīng)有完整氨基酸序列的蝦過敏原、4種蝦類的原肌球蛋白以及6種蟹類 原肌球蛋白，在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中查找對 應的序列，相應的氨基酸序列編號見表1。將獲得的14種蛋白氨基酸序列利用EBI中的 Clustalw軟件（http: //www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行多序列比對，結(jié)果用 Bioedit軟件分析其中保守和非保守區(qū)域位置，篩選確定不同原肌球蛋白的共同表位（共 同表位的標準就是表位肽的序列相同），稱為同源表位。
[0030] 表1 14種甲殼類原肌球蛋白的檢索號
[0031]
[0033] 2)表位肽的線性合成及鑒定
[0034] 將步驟1)篩選得到的同源表位采用Fmoc固相方法合成表位多肽，委托上海吉爾 生化有限公司完成。所制備多表位多肽的分析和純化采用高效液相色譜（HPLC)方法進行， 并利用電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS)對其進行質(zhì)譜分析鑒定其分子量，驗證合成準確性。
[0035] 3)表位肽多克隆抗體的制備
[0036] 以表位肽為抗原，結(jié)合血藍蛋白合成完全抗原后，免疫BALB/c小鼠，制備表位肽 的多克隆抗體，并通過proteinGSepharose親和柱進行純化，得表位肽多克隆抗體，具體 操作為：
[0037] (1)選擇健康雌性6-8周齡的Babl/c純種小鼠（體重50~70g)6只，斷尾米血， 作為陰性對照；
[0038] (2)免疫用抗原的制備方法，將表位肽與血藍蛋白進行偶聯(lián)，形成完全抗原，并用 于制備抗體；
[0039] (3)小鼠免疫程序
[0040]
[0041 ]
[0042] 第3次免疫后7天，斷尾采血，測定抗血清的效價，若效價未達到要求，繼續(xù)免疫。 效價達到要求后，蝦過敏原蛋白溶液腹腔注射，沖擊免疫1次，5d后摘眼球采血，收集于2mL 滅菌塑料離心管中。室溫靜置4h，5000rpm離心15min，取上清，proteinGSepharose親和 柱純化后，加入硫柳汞，使其終濃度為0. 01 %，分裝，_80°C冰箱中保存。
[0043] 4)海產(chǎn)品原肌球蛋白競爭性ELISA檢測方法的建立
[0044] 蝦原肌球蛋白的制備方法如下：
[0045] 將蝦肉與4倍體積（g:mL)pH7. 4, 20mmol/LTris-HCl緩沖液中進行絞碎，經(jīng)離心 得到的上清用30% -50%飽和度的硫酸銨鹽析；鹽析后的沉淀再次溶于20mm〇l/LTris-HCl 緩沖液中透析，透析后的樣品用〇.Olmol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4. 5-4. 7,進行等電點 沉淀，將沉淀重新溶于20mm〇l/LTriS-HCl緩沖液中透析，透析后的樣品上樣于預先用 pH7. 4, 20mm〇l/LTris-HCl平衡的DEAE52離子交換層析，收集未吸附部分進行濃縮后，上樣 于SephadexG-100凝膠柱層析，純化后即得到蝦過敏原原肌球蛋白。
[0046] 精確稱取蝦原肌球蛋白（蝦過敏原蛋白）10mg，用0. 01mol/L，pH7. 4的PBS定容至 10ml，即可得到1000mg/L的蝦原肌球蛋白儲備液。將蝦原肌球蛋白儲備液稀釋得系列濃度 為 0·In