專利名稱：：激活β-肌球蛋白重鏈表達(dá)的微RNA的鑒定的制作方法激活P-肌球蛋白重^^達(dá)的微RNA的鑒定發(fā)明背景本發(fā)明是在來自(美國)國家衛(wèi)生研究院的經(jīng)費(fèi)支持下進(jìn)行的，經(jīng)費(fèi)號HL53351-06。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。本申請要求2006年8月1日提交的美國臨時申請流水號60/834,667;2007年7月31日提交的60/952,911;和2007年7月31日提交的60/952,917的優(yōu)先權(quán)，通過提及將其完整內(nèi)容收入本文。1.發(fā)明領(lǐng)域一般地，本發(fā)明涉及發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明關(guān)注心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中的基因調(diào)節(jié)和細(xì)胞生理學(xué)。明確地，本發(fā)明涉及對miRNA的抑制，導(dǎo)致(3-肌球蛋白重鏈((3-MHC)表達(dá)降低，由此治療心臟肥大和心力衰竭。本發(fā)明還涵蓋上調(diào)此miRNA用于治療肌肉骨骼疾病。2.相關(guān)技術(shù)的描述應(yīng)答施加于心臟的工作負(fù)荷升高的心臟肥大是一種基礎(chǔ)的適應(yīng)性才幾制。它是一種特化的過程，反映了由于神經(jīng)、內(nèi)分泌或機(jī)械刺激中的任一項或組合而發(fā)生的細(xì)胞大小和質(zhì)量(mass)(而非細(xì)胞數(shù)目)的數(shù)量增加。高血壓，心臟肥大的另一種因素，常常是充血性心力衰竭的前兆。當(dāng)發(fā)生心力衰竭時，左心室常常肥大和擴(kuò)張，而且收縮功能的指數(shù)，諸如射血分?jǐn)?shù)，會降低。顯然，心臟肥大應(yīng)答是一種復(fù)雜的綜合征，而且闡明導(dǎo)致心臟肥大的^L制對于各種刺激所致的心臟病的治療會是有益的。病理性心肌肥大的特征在于心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的增加和重現(xiàn)(reminiscentof)早期胚胎發(fā)育的基因表達(dá)序型。具體地說，P-肌球蛋白重鏈((3-MHC)、骨骼a-肌動蛋白(sACT)、及心房和腦兩種鈉尿肽(分別是ANP和BNP)的表達(dá)增加，而成年心臟肌肉特異性基因、a-肌球蛋白重鏈(a-MHC)和肌質(zhì)網(wǎng)Ca氣ATP酶(SERCA)的表達(dá)降低。更具體地，有令人信服的證據(jù)指明MHC同種型(isoform)表達(dá)變化在人心力衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用。事實(shí)上，a-MHCmRNA和蛋白質(zhì)水平在衰弱的心臟中顯著降低，而且通過(3-阻滯劑療法改善左心室射血分?jǐn)?shù)與a-MHC表達(dá)正?；嘘P(guān)。另夕卜，鑒定了人a-MHC基因中的一處突變與肥厚性心肌病有關(guān)，這證明了a-MHC表達(dá)水平對于正常心臟功能是至關(guān)重要的，盡管其豐度低。如此，清楚的是a和卩兩種MHC在心臟肥大發(fā)生中發(fā)揮作用，但是這些產(chǎn)物在產(chǎn)生和/或維持病理狀態(tài)中確切的作用特征仍然未知。發(fā)明概述如此，依照本發(fā)明，在一個實(shí)施方案中提供了調(diào)節(jié)心臟收縮性和重塑(remodeling)的方法，包括給心臟細(xì)胞施用miR-208表達(dá)或活性的調(diào)控劑。在一個實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)心臟收縮蛋白質(zhì)基因表達(dá)的方法，包括給心臟細(xì)胞施用miR-208表達(dá)或活性的調(diào)控劑。所述調(diào)控劑可以是miR-208表達(dá)或活性的激動劑或拮抗劑。在本發(fā)明的某些方面，提供了減少心臟細(xì)胞中的卩-MHC表達(dá)的方法，包括給心臟細(xì)胞施用miR-208表達(dá)或活性的抑制劑。在本發(fā)明的其它方面，提供了提高心臟細(xì)胞中的P-MHC表達(dá)的方法，包括提高內(nèi)源miR-208表達(dá)或活性或給心臟細(xì)胞施用外源miR-208。在本發(fā)明的一個方面，提供了提高心臟細(xì)胞中的快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的表達(dá)的方法，包括給心臟細(xì)胞施用miR-208表達(dá)或活性的抑制劑。在本發(fā)明的另一個方面，提供了降低心臟細(xì)胞中的快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的表達(dá)的方法，包括提高內(nèi)源miR-208表達(dá)或活性或給心臟細(xì)胞施用外源miR-208。依照本發(fā)明的方法可以提高或降低的快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的例子包括骨骼肌4丐蛋白I、肌鈣蛋白T3、肌球蛋白輕鏈、或a-骨骼肌動蛋白。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療病理性心臟肥大或心力衰竭的方法，包括鑒定具有心臟肥大、心力衰竭、或心肌梗死后重塑的患者；并抑制患者心臟細(xì)胞中的miR-208表達(dá)或活性。在另一個實(shí)施方案中，提供了預(yù)防病理性肥大或心力衰竭的方法，包括鑒定有風(fēng)險發(fā)生病理性心臟肥大或心力衰竭的患者；并抑制患者心臟細(xì)胞中的miR-208表達(dá)或活性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療心肌梗死的方法，包括抑制所述受試者的心臟細(xì)胞中的miR-208表達(dá)或活性。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防心臟肥大和擴(kuò)張型心肌病的方法，包括抑制受試者心臟細(xì)胞中的miR-208表達(dá)或活性。在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制心臟肥大進(jìn)展的方法，包括抑制受試者心臟細(xì)胞中的miR-208表達(dá)或活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在患有心力衰竭或心臟肥大的受試者中提高運(yùn)動耐量、減少入院治療、改善生活質(zhì)量、降低發(fā)病率、和/或降低死亡率的方法，包括抑制受試者心臟細(xì)胞中的miR-208表達(dá)或活性。在本發(fā)明的其它方面，提供了在病理條件下通過施用miR-208抑制劑來提高心臟細(xì)胞中的a-MHC表達(dá)的方法。在本發(fā)明的某些方面，抑制miR-208的表達(dá)或活性包括施用miR-208的antagomir。在一個實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了miR-208antagomir。antagomir適于投遞至目標(biāo)器官、組織、或細(xì)胞類型的任何方法來進(jìn)行。例如，在本發(fā)明的某些方面，miR-208的調(diào)控劑可以通過靜脈內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射、心包內(nèi)注射、或直接注射入組織(例如心臟組織、骨骼肌組織)來施用。在一些方面，施用包括口服、經(jīng)皮、腹膜內(nèi)、皮下、持續(xù)釋放、受控釋放、延遲釋放、栓劑、或舌下施用miR-208。在本發(fā)明的某些方面，在患者中治療或預(yù)防病理性心臟肥大或心力衰竭進(jìn)一步包括給患者施用第二心臟肥大療法。所述第二療法可以是例如p阻滯劑、ionotrope、利尿藥、ACE-I、AII拮抗劑、BNP、Ca、阻滯劑、和ERA、或HDAC抑制劑。所述第二療法可以在抑制miR-208之前、同時、或之后施用。病理性心臟"巴大或心力衰竭的治療可以定義為病理性心臟爿巴大或心力衰竭的一種或多種癥狀的改善。得到改善的癥狀可以是例如升高的運(yùn)動能力(exercisecapacity)、升高的心臟射血體積、降低的左心室舒張末期壓、降低的肺毛細(xì)血管楔壓、升高的心排血量或心排血指數(shù)、降低的肺動脈壓、降低的左心室收縮和舒張末期內(nèi)徑(endsystolicanddistolicdimensions)、降j氐的左右心室壁壓(wallstress)、降低的壁張力(walltension)、提高的生活質(zhì)量、和降低的疾病相關(guān)發(fā)病率或死亡率。病理性心臟肥大的治療還可以定義為延遲從心臟肥大到心力衰竭的轉(zhuǎn)變。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，提供了在有風(fēng)險發(fā)生病理性心臟肥大或心力衰竭的患者中預(yù)防病理性肥大或心力衰竭的方法。有風(fēng)險發(fā)生病理性心臟肥大或心力衰竭的患者可以展現(xiàn)出一種或多種風(fēng)險因子，包括例如長期不受控制的高血壓、未矯正的瓣膜病、慢性咽峽炎、新近的心肌梗死、心臟病的先天素因或病理性肥大。在某些方面，有風(fēng)險的患者可以是診斷為具有心臟肥大的遺傳素因。在本發(fā)明的某些方面，有風(fēng)險的患者可以具有心臟肥大的家族史。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低骨骼肌細(xì)胞中的快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因表達(dá)或活性的方法，包括給骨骼肌細(xì)胞施用miR-208。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在受試者中治療或預(yù)防肌肉骨骼病癥的方法，包括鑒定具有或有風(fēng)險發(fā)生肌肉骨骼病癥的患者；并提高所述患者骨骼肌細(xì)胞中的miR-208表達(dá)和/或活性。肌肉骨骼病癥可以是例如失用性萎縮、應(yīng)答于微重力的月幾肉消庫毛(muscle-wastinginresponsetomicrogravity)、或失4申經(jīng)支酉己。在本發(fā)明的某些方面，治療或預(yù)防肌肉骨l^病癥的方法進(jìn)一步包括施用第二非miR-208療法。提高miR-208的表達(dá)和/或活性可以包括給受試者施用miR-208或者給受試者施用表達(dá)miR-208的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體是病毒表達(dá)載體。所述病毒表達(dá)載體可以是例如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。在某些方面，所述表達(dá)載體是非病毒表達(dá)載體。在本發(fā)明的某些方面，miR-208或編碼miR-208的表達(dá)載體與脂質(zhì)媒介相結(jié)合?；蛘?，可以僅僅提供獨(dú)立的miR-208，任選地被包括在投遞媒介內(nèi)，諸如脂質(zhì)體或納米顆粒。miR-208是心臟特異性的，這一點(diǎn)可防止其它器官中發(fā)生不想要的副作用。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定miR-208的調(diào)控劑的方法，包括(a)使細(xì)胞接觸候選化合物；(b)評估m(xù)iR-208活性或表達(dá)；并(c)比較步驟(b)中的活性或表達(dá)與不存在候選化合物時的活性或表達(dá)，其中測得的活性或表達(dá)之間的差異指示該候選化合物是miR-208的調(diào)控劑。在本發(fā)明的某些方面，在體外使細(xì)胞接觸候選化合物。在本發(fā)明的其它方面，在體內(nèi)使細(xì)胞接觸候選化合物。所述miR-208的調(diào)控劑可以是miR-208的激動劑或拮抗劑?？梢砸勒毡景l(fā)明的方法來篩選的候選化合物的非限制性例子是肽、多肽、多核苷酸、或小分子。評估m(xù)iR-208活性或表達(dá)可以包括評估m(xù)iR-208的表達(dá)水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉多種評估RNA表達(dá)水平的方法，包括例如Northern印跡或RT-PCR。評估m(xù)iR-208活性或表達(dá)可以包括評估m(xù)iR-208的活性。在一些實(shí)施方案中，評估m(xù)iR-208的活性包括評估受miR-208調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)或活性。受miR-208調(diào)節(jié)的基因包括例如a和P-肌球蛋白重鏈和快速骨骼肌蛋白質(zhì)基因，諸如快速骨骼肌鈣蛋白I、肌4丐蛋白T3、肌球蛋白輕鏈、和a骨骼肌動蛋白。在本發(fā)明的某些方面，評估m(xù)iR-208的活性包括評估a-肌球蛋白重鏈表達(dá)水平對(3-肌球蛋白重鏈表達(dá)水平的比率。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉多種評估受miR-208調(diào)節(jié)的基因的活性或表達(dá)的方法。此類方法包括例如Northern印跡、RT-PCR、ELISA、或Western印跡。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過如下方法鑒定的miR-208調(diào)控劑，所述方法包括(a)使細(xì)胞接觸候選化合物；(b)評估m(xù)iR-208活性或表達(dá)；并(c)比較步驟(b)中的活性或表達(dá)與不存在候選化合物時的活性或表達(dá)，其中測得的活性或表達(dá)之間的差異指示該候選化合物是miR-208的調(diào)控劑。miR-208的調(diào)控劑可以被包括在藥物組合物中，用于依照本發(fā)明的方法治療心臟病癥和/或肌肉骨骼病癥。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過如下方法鑒定的miR-208抑制劑，所述方法包括(a)使細(xì)胞接觸候選化合物；(b)評估m(xù)iR-208活性或表達(dá)；并(c)比較步驟(b)中的活性或表達(dá)與不存在候選化合物時的活性或表達(dá)，其中接觸候選化合物的細(xì)胞中的活性或表達(dá)與不存在候選化合物的細(xì)胞中的活性或表達(dá)相比的降低指示該候選化合物是miR-208的抑制劑。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療病理性心臟肥大或心力衰竭的方法，包括鑒定具有心臟肥大或心力衰竭的患者；并給患者施用miR-208抑制劑。在本發(fā)明的某些方面，所述miR-208抑制劑可以是通過如下方法鑒定的，所述方法包括(a)使細(xì)胞接觸候選化合物；(b)評估m(xù)iR-208活性或表達(dá)；并(c)比較步驟(b)中的活性或表達(dá)與不存在候選化合物時的活性或表達(dá)，其中接觸候選化合物的細(xì)胞中的miR-208活性或表達(dá)與不存在候選化合物的細(xì)胞中的活性或表達(dá)相比的降低指示該候選化合物是miR-208的抑制劑。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療肌肉骨骼病癥的方法，包括鑒定具有肌肉骨骼病癥或有風(fēng)險發(fā)生肌肉骨骼病癥的患者；并給患者施用miR-208激動劑。在本發(fā)明的某些方面，所述miR-208激動劑可以是通過如下方法鑒定的，所述方法包括(a)使細(xì)胞接觸候選化合物；(b)評估m(xù)iR-208活性或表達(dá)；并(c)比較步驟(b)中的活性或表達(dá)與不存在候選化合物時的活性或表達(dá)，其中接觸候選化合物的細(xì)胞中的miR-208活性或表達(dá)與不存在候選化合物的細(xì)胞中的活性或表達(dá)相比的升高指示該候選化合物是miR-208的;敫動劑。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其細(xì)胞未能表達(dá)功能性miR-208。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其細(xì)胞包含在異源啟動子控制下的miR-208編碼區(qū)，所述異源啟動子在所述非人哺乳動物的細(xì)胞中是有活性的。所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以是例如小鼠或大鼠。所述啟動子可以是組織特異性啟動子，諸如例如骨骼肌特異性啟動子或心臟肌肉特異性啟動子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物細(xì)胞，其缺乏一個或兩個天然miR-208等位基因。詞語"一個"或"一種"在權(quán)利要求書/說明書中與術(shù)語"包含"、"包括"或"含有，，一起使用時的使用可以表示"一(個/種)"，但是也與"一(個/種)或多(個/種)"、"至少一(個/種)"、或"一(個/種)或多于一(個/種)"的意思一致。就本發(fā)明的任何方法或組合物而言，可以實(shí)施本文中所討論的任何實(shí)施方案，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物和試劑盒可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。在本申請全文中，術(shù)語"約，，用于表示某數(shù)值包括用于測定該數(shù)值的裝置或方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差。術(shù)語"或"在權(quán)利要求書中的使用用于表示"和/或"，除非明確指出僅指二選一的或者各選項互相排斥，盡管公開內(nèi)容支持僅指二選一和"和/或"的定義。在用于本說明書和權(quán)利要求書時，詞語"包含"(及任何形式的包含，諸如"包括"和"含有")、"具有"(及任何形式的具有，諸如"有，，和"帶有")、"包括"(及任何形式的包括，諸如"包含"和"含有")、或"含有，，(及任何形式的含有，諸如"含")指包括在內(nèi)(inclusive)或開放式的(open-ended),而且不排除別的、未敘及的成分或方法步驟。本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)以下詳述將變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，盡管詳述和具體實(shí)施例指出了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是它們僅是作為例示而提供的，因為本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和改良對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言根據(jù)此詳述將是顯而易見的。附圖筒述以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分，用以進(jìn)一步演示本發(fā)明的某些方面。通過參照這些附圖中的一幅或多幅并結(jié)合本文所述具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。圖l-miR-208包含在心臟oi-MHC基因中。miR-208由ccM/ZC基因的內(nèi)含子27編碼。星號指示序列保守性。圖2-miR-208具有與a-MHC相同的表達(dá)樣式。通過成年小鼠組織的Northern分析進(jìn)行的miR-208轉(zhuǎn)錄物;險測。U6mRNA充當(dāng)加樣對照。圖3A-C-甲狀腺激素對miR-208表達(dá)的調(diào)節(jié)。(圖3A)a-和^M/7C的PTU/丁:3調(diào)節(jié)的示意圖。(圖3B)在有和無T3的情況下將大鼠用PTU處理1周，并通過實(shí)時？01檢測《^//(^和^^//(:111腦八。(圖3C)如所示的將大鼠用PTU或PTU+T3處理l周，并通過Northern印跡檢測miR-208表達(dá)。分析了來自每種條件下4只動物的心臟。圖4A-C-a-MHC表達(dá)抑制導(dǎo)致降低的miR-208水平。(圖4A-B)第O,3,6,9,12,15,18和21天的a-和P-似/ZC轉(zhuǎn)錄物的相對表達(dá)水平。(圖4C)PTU處理過程中所示時間點(diǎn)大鼠心臟組織中miR-208的Northern印跡分析。圖5A-B-miR-208基因敲除。(圖5A)通過同源重組生成miR-208突變型小鼠的策略。用側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的新霉素抗性盒(Neo)替換前miRNA(pre-miRNA)序列。通過雜合小鼠與包含CAG-Cre轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的交配消除小鼠種系中的新霉素盒。DTA,白喉毒素A。(圖5B)通過來自野生型(WT)和miR-208突變型(KO)小鼠的心臟的Northern分析進(jìn)行的miR-208轉(zhuǎn)錄物才僉測。圖6A-B-miR-208刪除不改變a-MHC表達(dá)。(圖6A)通過來自所示基因型的小鼠的心臟的RNA的RT-PCR進(jìn)行的aMHC轉(zhuǎn)錄物分析。顯示了引物相對于aM/7C外顯子的位置，而且引物對顯示在每組樣品上方。(圖6B)所示基因型的新生小鼠的心臟中的aMHC和bMHC蛋白質(zhì)水平的Westem分析。分析了每種基因型的2只小鼠。檢測甘油醛-3-磷酸脫氬酶(GAPDH)作為加樣對照。圖7-miR-208敲除中快速骨骼基因的上調(diào)。圖8-miR-208敲除小鼠中心臟應(yīng)激應(yīng)答(stressresponse)基因的失調(diào)。圖9-miR-208在心臟基因調(diào)節(jié)中的作用的模型。ccM7/C基因編碼miR-208，其負(fù)調(diào)節(jié)THRAP1和骨骼肌基因(及可能別的耙物)的表達(dá)。a-和卩-MHC基因是連鎖的(linked)，而且miR-208是應(yīng)答應(yīng)激信號傳導(dǎo)而發(fā)生的(3MHC上調(diào)和PTU阻斷T3信號傳導(dǎo)所需要的。a-和(3-MHC分別促進(jìn)快速和慢速收縮。圖IO-人心臟樣品未衰竭的-衰竭的(failing)。圖ll-THRAP1作為miR-208的預(yù)測靶物。THRAP1的3'UTR中推定的miR-208結(jié)合位點(diǎn)的序列比對顯示了高水平的互補(bǔ)性和序列保守性。圖12-3'UTRTHRAP1螢光素酶測定。圖13-miR-208突變型小鼠的心臟中快速骨骼肌基因的上調(diào)。圖14A-E-野生型和miR-208—z'動物在TAB后的分析。(圖14A)假手術(shù)或TAB21天后野生型和miR-208一小鼠中通過實(shí)時PCR檢測ocMi/CmRNA表達(dá)。(圖14B)通過來自野生型和miR-208一小鼠的心臟組織的Northern印跡檢測miR-208。(圖MC)超聲心動圖顯象分析指示FS的降低，這是由于miR-208^和同窩野生型小鼠二者中應(yīng)答于TAB的收縮期左心室內(nèi)徑(LVinsystole,LVIDs)擴(kuò)張的增加所導(dǎo)致的。TAB后心縮期(s)或心舒期(d)的前壁和后壁(AW和PW)厚度顯示與野生型動物相比，miR-208;動物中變鈍的(blunted)肥大型應(yīng)答(n=5-7每組)。*p<0.05，與相應(yīng)的野生型組相比。(圖MD)通過Northern分析檢測來自野生型和miR-208轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟的miR-208轉(zhuǎn)錄物。(圖14E)通過來自所示基因型的心臟中的實(shí)時PCR沖企測aMHC、卩MHC、ANF和BNP的轉(zhuǎn)錄物。數(shù)值表述成與野生型小鼠相比的表達(dá)增加倍數(shù)(士SEM)(n=3)。圖15A-G-miR-208一小鼠應(yīng)答于壓力過度負(fù)荷而顯示心臟肥大的降低。(圖15A)野生型和miR-208一小鼠的心臟的Masson三色染色組織學(xué)切片。miR-208的缺失削弱了在進(jìn)行21天TAB的野生型小鼠中所見的肥大和纖維化。標(biāo)尺在頂圖中等于2mm而在底圖中等于20iam。(圖1SB)通過實(shí)時PCR4企測假手術(shù)或TAB手術(shù)后的野生型和miR-208一小鼠的心臟中的卩MHC、ANF和BNP的轉(zhuǎn)錄物。數(shù)值表述成與假手術(shù)的野生型小鼠相比的表達(dá)增加倍數(shù)(±SEM)(n=3)。(圖15C)^假手術(shù)和TAB后21天的成年野生型和miR-208突變型小鼠中的(iMHC和pMHC蛋白質(zhì)水平的Westem分析。(圖1SD)表達(dá)鈣依賴磷酸酶(calcineurin)轉(zhuǎn)基因(CnA-Tg)的6周齡小鼠的心臟和miR-208一的心臟的組織學(xué)切片；對CnA-Tg進(jìn)行Masson三色染色。miR-208的缺失削弱了在CnA-Tg小鼠中所見的肥大和纖維化。標(biāo)尺在頂圖中等于2mm而在底圖中等于20fim。(圖15E)通過實(shí)時PCR檢測來自所示基因型的心臟中的(3MHC、ANF和BNP的轉(zhuǎn)錄物。數(shù)值表述成與野生型小鼠相比的表達(dá)增加倍數(shù)(士SEM)(1^3)。(圖15F)成年野生型和有和無CnA轉(zhuǎn)基因的miR-208突變型小鼠中aMHC和卩MHC蛋白質(zhì)水平的Westem分析。(圖UG)成年野生型和miRJ08轉(zhuǎn)基因動物中(xMHC和(3MHC蛋白質(zhì)水平的Westem分析。圖16A-C-PTU處理后的野生型和miR-208^動物的分析。(圖16A)通過Northern印跡檢測來自PTU處理后的野生型和miR-208一小鼠的心臟組織的miR-208。(圖16B)超聲心動圖顯象顯示了野生型和miR-208^小鼠中相當(dāng)?shù)膽?yīng)答于PTU的心率(HR)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)降低，這是由于心舒期(d)和心縮期(s)二者中左心室擴(kuò)張(LVdilation)(LVID)的增加和前后左心室壁(AW,PW)的變薄0=6)導(dǎo)致的。*p<0.05，與相應(yīng)的野生型組相比。(圖16C)通過實(shí)時PCR檢測來自PTU處理后的野生型和miR-208;小鼠的心臟中的」7VF和AV尸的轉(zhuǎn)錄物。數(shù)值表述成與接受常規(guī)食物的野生型小鼠相比的表達(dá)增加倍數(shù)(士SEM)(n=3)。圖17A-B-miR-208對-MHC基因的響應(yīng)性的調(diào)節(jié)。(圖17A)野生型和miR-208突變型小鼠中的基線和PTU處理后2周的aMHC和卩MHC表達(dá)的miR-208一小鼠的心臟中的aMHC和卩MHC轉(zhuǎn)錄物。數(shù)值表述成與接受常規(guī)食物的野生型小鼠相比的表達(dá)增加倍數(shù)(士SEM)(n=3)。圖18A-D-miR-208靶向THRAPl。(圖18A)7T/i^P/的3'UTR中推定的miR-208結(jié)合位點(diǎn)的序列比對顯示了高水平的互補(bǔ)性和序列保守性。(圖18B)將COSl細(xì)胞用3'UTR縈光素酶構(gòu)建物以及miR-126和miR-208的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。數(shù)值表述成與單獨(dú)的報道物相比的螢光素酶表達(dá)增加倍數(shù)(士SD)。(圖18)將C0S1用HA-MCD-WTUTR或HA-MCD-突變型UTR，以及范圍為0.1-2嗎的遞增劑量的pCMV-miR-208轉(zhuǎn)染。使用免疫印跡檢測HA-水平。(圖18D)使用THRAP1特異性抗體對被THRAP1免疫沉淀的心臟細(xì)胞溶胞物進(jìn)行的THRAP1Westem印跡，其中使用400嗎來自野生型動物或miR-208一動物的蛋白質(zhì)。圖19-THRAP1轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR分析。通過來自野生型和miR-208^小鼠的心臟的RNA的RT-PCR進(jìn)行的rZ/^4尸/轉(zhuǎn)錄物分析。顯示了引物在mRNA轉(zhuǎn)錄物中的位置。圖20-甲狀腺激素受體信號傳導(dǎo)靶物的實(shí)時PCR分析。通過實(shí)時PCR檢測來自野生型和miR-208-、鼠的心臟中的5EiC4^和尸丄仏及G丄t/7V的轉(zhuǎn)錄物。數(shù)值表述成與野生型小鼠相比的表達(dá)增加倍數(shù)(士SEM)。圖21-顯示野生型、miR-208仏和miR-208-/-形式的心臟中的miR-499表達(dá)的Northern印跡。野生型和突變型小鼠中miR-208的表達(dá)和miR-499，以及Myb7b之間有正相關(guān)。圖22-Myh7b基因座的結(jié)構(gòu)和miR-499編碼區(qū)在其中的位置。圖23-顯示心臟和比目魚肌中miR-499表達(dá)的RNA印跡。mir-499在快速骨骼肌纖維諸如腓腸肌/跖肌(GP)、脛骨前肌(TA)或趾長伸肌(EDL)中不表達(dá)。圖24-顯示具有心臟病的野生型小鼠中miR-499表達(dá)的Northem印跡。MI，心肌梗死。CnATg,鉤依賴磷酸酶轉(zhuǎn)基因小鼠。圖25-心臟肌肉中miR-208調(diào)節(jié)miR-499的示意圖。圖26A-C-心臟肥大過程中的miRNA表達(dá)。(圖26A)來自假手術(shù)和TAB21天后的小鼠和來自CnATg小鼠的代表性心臟的H&E染色切片。標(biāo)尺等于2mm。(圖2GB)下面顯示了顯示在每種類型的心臟中表達(dá)有變化的微RNA數(shù)目的Venn圖。(圖^C)在肥大過程中表達(dá)有變化的微RNA的Northern印跡。才全測U6RNA作為加樣對照。圖27-miR-29表達(dá)應(yīng)答心臟應(yīng)激而下調(diào)。左邊顯示了來自野生型小鼠(WT)和具有依賴磷酸酶轉(zhuǎn)基因(CnA)或TAB誘導(dǎo)的肥大和纖維化的小鼠的心臟。右邊顯示了每種類型的心臟中miR-29的相對表達(dá)水平。圖28-與野生型相比來自miR-208敲除小鼠的心臟的微陣列分析。對6周齡時自野生型和miR-208缺失型心臟分離的mRNA進(jìn)行了微陣列分析。僅次于miR-208的下調(diào)最多的miRNA是miR-499。圖29-miR-29家族在miR-208缺失型心臟中顯著上調(diào)。圖30-miR-29家族靶向編碼膠原和細(xì)胞外基質(zhì)中參與纖維化的其它成分的mRNA。圖31-miR-208和miR-29家族控制心臟纖維化的模型。在正常心臟中，miR-208抑制miR-29的表達(dá)。在miR-208缺失的情況中，miR-29表達(dá)上調(diào)，阻止應(yīng)答應(yīng)激而發(fā)生的細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)和纖維化。miR-208、-499和-29的功能是相互關(guān)聯(lián)的。miR-208的缺失可能具有心臟保護(hù)性，這種保護(hù)性通過阻止miR-499表達(dá)和上調(diào)miR-29表達(dá)，并因此阻斷纖維化來實(shí)現(xiàn)。例示性實(shí)施方案的詳述心力衰竭是世界上發(fā)病和死亡的主要原因之一。僅在美國，估計有300萬人當(dāng)前正罹患著心肌病，而且每年另有40萬人得到診斷。擴(kuò)張型心肌病(DCM)，也稱作"充血性心肌病"，是心肌病的最常見形式，而且具有接近每10萬人中40例的估計流行程度(Durand等，1995)。雖然DCM有其它的原因，但是有人已經(jīng)指出家族性擴(kuò)張型心肌病占"特發(fā)性，，DCM的大約200/。。大約一半的DCM病例是特發(fā)性的，其余的則與已知的疾病過程有關(guān)。例如，癌癥化療中所使用的某些藥物(例如多柔比星(doxombicin)和柔紅霉素(daunoribucin))可導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌損傷。另夕卜，許多DCM患者是長期酗酒者。幸運(yùn)的是，對于這些患者，如果在疾病病程中早期減少或停止飲酒的話，心肌功能障礙的進(jìn)展可以被停止或逆轉(zhuǎn)。圍產(chǎn)期心肌病是DCM的另一種特發(fā)性形式，與傳染性后遺癥相關(guān)的疾病也是?？傊募〔。―CM，是重大的公知健康問題。心臟病及其征候，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心臟肥大，顯然是今日美國面臨的一個主要健康風(fēng)險。診斷、治療和維護(hù)患有這些疾病的患者的花費(fèi)高達(dá)數(shù)十億美元。兩種特別嚴(yán)重的心臟病征候是心肌梗死和心臟肥大。關(guān)于心肌才更死，典型地，由于動脈粥樣硬化而在冠狀動脈中發(fā)生急性血小板性冠狀動脈閉塞并引起心肌細(xì)胞死亡。因為心肌細(xì)胞，即心臟肌肉細(xì)胞，是終末分化的且一般不能進(jìn)行細(xì)胞分裂，它們在急性心肌梗死過程中死亡后一般被瘢痕組織替換。瘢痕組織沒有收縮性，對心臟功能沒有幫助，且常常在心臟收縮過程中擴(kuò)張或者提高心室的大小和有效半徑(例如變肥大)而對心臟功能產(chǎn)生有害作用。關(guān)于心臟肥大，一種理論將其看作類似異常發(fā)育的疾病，因此提出了心臟中的發(fā)育信號是否有助于肥大疾病的問題。心臟肥大是對幾乎所有形式的心臟病(包括那些源自高血壓、機(jī)械負(fù)荷、心肌梗死、心率失常、內(nèi)分泌失調(diào)、和心臟收縮蛋白質(zhì)基因中的遺傳突變的心臟病)的適應(yīng)性應(yīng)答。雖然肥大應(yīng)答最初是提升心排血量的補(bǔ)償機(jī)制，但是持續(xù)的肥大可導(dǎo)致DCM、心力衰竭、和猝死。在美國，每年有大約50萬人被診斷有心力衰竭，死亡率大約50%。關(guān)于心臟肥大的原因和結(jié)果已經(jīng)有很多著述，但是其潛在的分子機(jī)制尚未闡明。對這些機(jī)制的理解是心臟病的預(yù)防和診斷中主要關(guān)心的問題，而且作為設(shè)計特異性靶向心臟肥大和心臟心力衰竭的新藥物中的治療模式，將具有關(guān)鍵意義。因為病理性心臟肥大通常直到心臟損傷嚴(yán)重到足以產(chǎn)生心力衰竭之前都不產(chǎn)生任何癥狀，所以心月幾病的癥狀是與心力衰竭相關(guān)的癥狀。這些癥狀包括呼吸急促、筋疲力盡(fatiguewkhexertion)、不能平躺又不變得呼吸急促(端坐呼吸)、陣發(fā)性夜間呼吸困難、心臟尺度擴(kuò)大、和/或下肢腫脹?；颊哌€常常呈現(xiàn)血壓升高、額外心音、心臟雜音、肺和系統(tǒng)性栓塞、胸痛、肺充血、和心悸。另外，DCM引起降低的射血分?jǐn)?shù)(即內(nèi)在收縮功能和重塑二者的度量)。該疾病進(jìn)一步表征為心室擴(kuò)張和心肌收縮性降低引起的收縮功能明顯削弱，在許多患者中導(dǎo)致擴(kuò)張性心力衰竭。作為肌細(xì)胞/心肌功能障礙的結(jié)果，患病心臟還經(jīng)歷細(xì)胞/腔重塑，促使"DCM表型，，的形成。隨著疾病進(jìn)展，癥狀也進(jìn)展。DCM患者中危及生命的心率失常(包括室性心動過速和心室纖顫)的發(fā)生率也大大升高。在這些患者中，暈厥(頭暈)事件被視為猝死的前兆。擴(kuò)張型心肌病的診斷典型地依賴于心臟腔擴(kuò)大，特別是心室擴(kuò)大的表現(xiàn)。擴(kuò)大通常可以借助胸部X射線觀察，但是使用超聲心動圖進(jìn)行評估更精確。DCM常常難以與急性心肌炎、瓣膜性心臟病、冠心病、和高血壓心臟病區(qū)分。一旦作出擴(kuò)張型心肌病的診斷，則盡力確定和治療潛在可逆轉(zhuǎn)的病因并預(yù)防進(jìn)一步的心臟損傷。例如，必須排除冠心病和瓣膜性心臟病。貧血、異常的心動過速、營養(yǎng)缺乏、曱狀腺疾病和/或其它問題需要加以處置和控制。如上所述，使用藥理學(xué)藥劑的治療方法仍然是降低或消除心力衰竭征候的主要機(jī)制。利尿劑是輕度到中度心力衰竭的一線治療方法。不幸的是，許多常用利尿劑(例如噻嗪類)具有許多不良反應(yīng)。.例如，某些利尿劑可能提高血清膽固醇和甘油三酯。此外，利尿劑對于患有重度心力衰竭的患者一般是無效的。如果利尿劑無效，那么可以使用血管舒張劑(vasodilatoryagent);血管緊張素轉(zhuǎn)化(ACE)抑制劑(例如恩諾普利(enalopril)和賴諾普利(lisinopril))不僅提供癥狀減輕，而且據(jù)報道說降低死亡率(Young等，1989)。然而，ACE抑制劑仍然伴隨著不良反應(yīng)，導(dǎo)致它們忌用于具有某些疾病狀態(tài)(例如腎動脈狹窄)的患者。類似的，肌力藥(inotropicagent)療法(即通過提高心肌肌肉收縮的力量來改善心排血量的藥物)伴隨著各方面的不良反應(yīng)，包括胃腸問題和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。由此可見，當(dāng)前使用的藥理學(xué)藥劑在特定患者群中具有嚴(yán)重的缺點(diǎn)。新的、安全的且有效的藥劑毫無疑問將會惠及那些不能使用目前可用的藥理學(xué)模式或者無法從那些形式獲得足夠減輕的患者。DCM患者的預(yù)后是可變的，而且取決于心室功能障礙的程度，大多數(shù)死亡發(fā)生在診斷后五年內(nèi)。I.本發(fā)明成年心臟中(x-與p-MHC同等型的比率是心臟收縮性的主要決定因素。卩-MHC是成年心臟中的主要肌球蛋白同等型，它展示相對低的ATP酶活性，而a-MHC具有高ATP酶活性。應(yīng)答于多種病理性刺激(諸如心肌梗死、高血壓、和其它病癥時)，P-MHC表達(dá)升高而a-MHC表達(dá)降低，結(jié)果是肌纖維ATP酶活性降低和心臟肌纖維的縮短速率降低，導(dǎo)致最終的收縮功能障礙。值得注意的是，心臟a-MHC含量的輕微變化可以對心臟性能具有深刻影響。微RNA(miR)是小的、約22個核苷酸的RNA，它們衍生自更大的前miR(pre-miR)。miR起耙mRNA阻抑物的作用，這通過促進(jìn)靶mRNA降解(當(dāng)它們的序列完全互補(bǔ)時)或抑制耙mRNA翻譯(當(dāng)它們的序列包含錯配時)來實(shí)現(xiàn)。微RNA-208(miR-208)由a-MHC基因的內(nèi)含子編碼，而且在心臟中特異性表達(dá)。本發(fā)明人創(chuàng)建了miR-208敲除小鼠并發(fā)現(xiàn)了miR-208是在成年心臟中激活(3-MHC基因表達(dá)以及激活數(shù)種其它收縮蛋白質(zhì)基因表達(dá)所必需的。另外，miR-208抑制導(dǎo)致心臟纖維化的劇烈降低。這些發(fā)現(xiàn)表明調(diào)控miR-208表達(dá)的策略對人體中的心臟收縮性會具有深刻影響，例如在心臟損傷后的心臟中抑制miR-208以阻止(3-MHC表達(dá)并維持a-MHC表達(dá)。本發(fā)明的另一個方面是miR-208表達(dá)或活性的激動作用用于治療a-MHC基因中有突變的個體，所述激動作用是通過治療性激活內(nèi)源miR-208基因或是通過使用腺病毒載體或其它載體(不需要使用腺病毒系統(tǒng)的異位表達(dá)手段來提高(3-MHC表達(dá))將外源miR-208導(dǎo)入心臟來實(shí)現(xiàn)的。miR-208突變型小鼠心臟中數(shù)種快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的上調(diào)也表明miR-208典型地遏制快速骨骼肌基因程序。對心臟中這些基因的激活是調(diào)節(jié)心臟收縮性的一種潛在手段。另外，本發(fā)明人建議使用miR-208來遏制骨骼肌中的快速纖維基因，由此激活慢速纖維基因的交互性(reciprocal)表達(dá)，這些慢速纖維基因與增強(qiáng)的胰島素敏感性和骨骼肌耐久力關(guān)聯(lián)。骨骼肌中慢速纖維基因的遏制和快速纖維基因的激活與許多肌肉骨骼病癥有關(guān)，包括失用性萎縮(disuseatrophy)、應(yīng)答于4元重力的月幾肉消尋毛(muslewastinginresponsetoanti-gravity)、禾口失4申經(jīng)支酉己(denervation)。如此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了miR-208是心臟中卩-MHC基因表達(dá)的肌肉特異性的、至關(guān)重要的調(diào)節(jié)物，另外還調(diào)節(jié)心臟纖維化。miR-208調(diào)節(jié)(3-MHC表達(dá)和快速骨骼肌基因表達(dá)的發(fā)現(xiàn)完全是新的，微RNA用于控制心臟收縮性和骨骼肌功能的用途也是如此。II.miRNAA.背景在2001年，數(shù)個小組使用一種新的克隆方法自秀麗線蟲(C.elegans)、果蠅(Drosophila)、和人類分離和鑒定了一大類"微RNA"(miRNA)(Lagos-Quintana等，2001;Lau等，2001;Lee和Ambros,2001)。在植物和動物(包括似乎不具有內(nèi)源siRNA的人類)中鑒定了數(shù)百種miRNA。如此，盡管與siRNA相似，但是miRNA是截然不同的。至今觀察到的miRNA長大約21-22個核苷酸，而且它們源自更長的前體，這些前體自非蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄得到。參見綜述Carrington等(2003)。前體形成在自身互補(bǔ)區(qū)中彼此背靠背折疊的結(jié)構(gòu)；然后它們受到動物中的Dicer核酸酶或植物中的DCL1的加工。miRNA分子通過與其耙物的精確或不精確的堿基配對來阻斷翻譯。miRNA涉及基因調(diào)節(jié)。有些miRNA,包括/&-4和/"-7，通過結(jié)合輩巴mRNA中部分互補(bǔ)的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)來抑制蛋白質(zhì)合成。其它miRNA,包括在植物中找到的ScarecrowmiRNA，像siRNA—樣發(fā)揮功能，結(jié)合完全互補(bǔ)的mRNA序列來破壞靶轉(zhuǎn)錄物(Grishok等，2001)。隨著科學(xué)家們開始理解微RNA在調(diào)節(jié)真核基因表達(dá)中所發(fā)揮的廣泛作用，關(guān)于這些分子的研究日益增多。了解最多的兩種miRNA,即//"-4和/ef-7，在秀麗線蟲中通過調(diào)節(jié)一個關(guān)鍵mRNA家族的翻譯來調(diào)節(jié)發(fā)育時機(jī)(綜述見Pasquinelli,2002)。已經(jīng)在秀麗線蟲、果蠅、小鼠、和人類中鑒定了數(shù)百種miRNA。正如對于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的分子而言能想到的，已經(jīng)顯示了miRNA水平在各組織之間和在各發(fā)育狀態(tài)之間有變化。另外，一項研究顯示了兩種miRNA的降低的表達(dá)與慢性淋巴細(xì)胞性白血病之間的強(qiáng)相關(guān)性，從而提供了miRNA與癌癥之間的可能聯(lián)系(Calin,2002)。雖然該領(lǐng)域仍然年輕，但是人們推測miRNA在高等真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面和轉(zhuǎn)錄因子具有同樣的重要性。有些例子說明了miRNA在細(xì)胞分化、早期發(fā)育、和細(xì)胞過程像凋亡和脂肪代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。//w-4和/ef-7都在秀麗線蟲發(fā)育過程中調(diào)節(jié)從一個幼蟲狀態(tài)到另一幼蟲狀態(tài)的過渡(passage)(Ambros,2003)。柳>-"和6a"tom是調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的果蠅miRNA，它們的調(diào)節(jié)作用表觀上是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)的基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的(Brermecke等，2003,Xu等，2003)。還有人提示miR14涉及脂肪代謝(Xu等，2003)。L^-6和mzT-273是秀麗線蟲miRNA，它們調(diào)節(jié)感化性神經(jīng)元中的不對稱性(Chang等，2004)。另一種調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的動物miRNA是miR-181，它指導(dǎo)造血細(xì)胞分化(Chen等，2004)。這些分子代表了具有已知功能的動物miRNA的整個范圍。毫無疑問，對miRNA功能的進(jìn)一步了解將會揭示有助于正常發(fā)育、分化、細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)通訊、細(xì)胞周期、血管發(fā)生、凋亡、和許多其它細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。鑒于miRNA在許多生物學(xué)功能中的重要作用，miRNA有可能會對治療性干預(yù)或診斷性分析提供重要的指示。對生物分子像miRNA的功能的表征常常牽涉將該分子導(dǎo)入細(xì)胞或自細(xì)胞中消除該分子并測量結(jié)果。如果將miRNA導(dǎo)入細(xì)胞導(dǎo)致凋亡，那么該miRNA毫無問參與凋亡途徑。用于將miRNA導(dǎo)入細(xì)胞和自細(xì)胞中消除miRNA的方法已有記載。兩份新近的出版物記載了可用于抑制特定miRNA活性的反義分子(Meister等，2004;Hutvagner等，2004)。另一份出版物記載了在轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后由內(nèi)源RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄并生成特定miRNA的治療的用途(Zeng等，2002)。這兩種試劑組合已經(jīng)用于評估單一miRNA。B.miR-208miR-208是一種內(nèi)含子miRNA，其位于a-MHC基因的第27個內(nèi)含子內(nèi)。圖l。人類、小鼠、大鼠、和犬的miR-208的前-miRNA編碼序列分別見SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17。成熟miR陽208序列見SEQIDNO:5。像a-MHC—樣，miR-208僅在心臟中表達(dá)。圖2。使用PicTar算法來鑒定miRNA靶物(Krek等，2005),本發(fā)明人鑒定了曱狀腺激素受體相關(guān)蛋白l(THRAPl)是miR-208的預(yù)測靶物。來自人類、黑猩猩、小鼠、大鼠、犬、雞、河豚、和斑馬魚的THRAP13'UTR序列分別見SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、和SEQIDNO:13。C.miR-208的抑制劑一般而言，miRNA的抑制劑采取"antagomir"的形式，即與miRNA互補(bǔ)、阻斷miRNA功能的化學(xué)工程化單鏈短寡核香酸(Kriitzfeldt等，2005)。其它辦法包括用改造成具有某些"藥物樣"特性(用于穩(wěn)定性的化學(xué)修飾；用于投遞的膽固醇偶聯(lián))的反義2'-0-曱基(2'-OMe)寡核苷酸和小干擾雙鏈RNA(siRNA)來抑制miRNA(Krutzfeldt等，2005)。III.治療心臟肥大的方法A.治療方案當(dāng)前心血管病癥背景下的心臟肥大的醫(yī)學(xué)管理包括使用至少兩種類型的藥物凝乳酶-血管緊張素系統(tǒng)的抑制劑和(3-腎上腺素能阻滯劑(Bristow,1999)。心力衰竭背景下的治療病理性肥大的治療劑包括血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑和P-腎上腺素能受體阻滯劑(Eichhom和Bristow,1996)。其它已經(jīng)披露用于治療心臟肥大的藥學(xué)藥劑包括血管緊張素II受體拮抗劑(美國專利5,604,251)和神經(jīng)肽Y拮抗劑(WO98/33791)。盡管有當(dāng)前可用的藥用化合物，對心臟肥大及續(xù)起的心力衰竭的預(yù)防和治療仍然是治療學(xué)上的挑戰(zhàn)。非藥理學(xué)治療主要用作藥理學(xué)治療的輔助手段。非藥理學(xué)治療的一種手段包括減少飲食中的鈉。另外，非藥理學(xué)治療還需要消除某些促發(fā)性藥物(precipitatingdrug),包括負(fù)性肌力藥(negativeinotropicagent)(例如某些4丐通道阻滯劑和抗心率失常藥如丙吡胺(disopyramide))、心臟毒素(例如安非他明(amphetamine))、和血(漿)容量擴(kuò)充藥(例如非類固醇抗炎藥和糖皮質(zhì)激素)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了利用miR-208的抑制劑來治療心臟肥大或心力衰竭的方法。為了本申請的目的，治療包括減少心臟肥大的一種或多種癥狀，諸如降低的運(yùn)動能力、降低的射血體積、升高的左心室舒張末期壓、升高的肺毛細(xì)血管楔壓、降低的心排血量、心排血指數(shù)、升高的肺動脈壓、升高的左心室收縮和舒張末期內(nèi)徑、和升高的左心室壁壓、管壁張力和壁厚度——對右心室而言也一樣。另外，miR-208的抑制劑的使用可以預(yù)防心臟肥大及其相關(guān)癥狀發(fā)生。治療方案會依臨床狀況而變化。然而在大多數(shù)情況中，長期維持似乎是適當(dāng)?shù)摹？赡苓€希望間歇地用miR-208的抑制劑治療肥大，諸如在疾病進(jìn)展過程中的一個短期窗口中進(jìn)行。B.聯(lián)合療法在另一個實(shí)施方案中，聯(lián)合其它治療模式使用miR-208的抑制劑。如此，在上文所述療法之外，還可以給患者提供更多"標(biāo)準(zhǔn)，，藥學(xué)心臟療法。其它療法的例子包括但不限于所謂的"p阻滯劑"、抗高血壓藥、強(qiáng)心劑、抗血栓藥、血管舒張劑、激素拮抗劑、肌力藥(iontr叩es)、利尿劑、內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑、磷酸二酯酶抑制劑、ACE抑制劑、血管緊張素2型拮抗劑和細(xì)胞因子阻滯劑/抑制劑、和HDAC抑制劑。聯(lián)合用藥可以通過使來心臟細(xì)胞接觸含有兩種藥劑的單一組合物或藥理學(xué)配制劑實(shí)現(xiàn)，或者通過使細(xì)胞同時接觸兩種不同的組合物或配制劑，其中一種組合物含有所述表達(dá)構(gòu)建體，而另一種含有所述藥劑?；蛘撸褂胢iR-208抑制劑的療法可以在其它藥劑的施用之前或之后進(jìn)行，間隔范圍為幾分鐘到幾周。在將另一藥劑和表達(dá)構(gòu)建體分別應(yīng)用于細(xì)胞的實(shí)施方案中，一般會確保在每次投遞的時間點(diǎn)之間不會經(jīng)過一長段時間，以使得所述藥劑和表達(dá)構(gòu)建體仍能夠?qū)?xì)胞發(fā)揮有利的聯(lián)合效應(yīng)。在此類情況中，通常會使細(xì)胞接觸這兩種形態(tài)的相隔時間在大約12-24小時內(nèi)，更優(yōu)選在相隔大約6-12小時內(nèi)，最優(yōu)選只有大約12小時的延遲時間。然而，在有些情況中，可能希望顯著延長治療的時間段，其中在各次施用之間相隔數(shù)天(2、3、4、5、6或7天)到數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。還可以想到的是，可能希望施用miR-208抑制劑或者另一藥劑多于一次。對此，可以采用各種聯(lián)合用藥。舉例而言，基于總共3次和4次施用有下列例示性的排列，其中"A"是miR-208抑制劑，而"B"是另一藥劑A/B/A、B/A/B、B/B/A、A/A/B、B/A/A、A/B/B、B/B/B/A、B/B/A/B、A/A/B/B、A/B/A/B、A/B/B/A、B/B/A/A、B/A/B/A、B/A/A/B、B/B/B/A、A/A/A/B、B/A/A/A、A/B/A/A、A/A/B/A、A/B/B/B、B/A/B/B、B/B/A/B同樣涵蓋其它4關(guān)合用藥方式。C.藥理學(xué)治療劑藥理學(xué)治療劑及施用方法、劑量等是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見例^口"PhysiciansDeskReference"、Klaassen的"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"、"Remington'sPharmaceuticalSciences"、和"TheMerckIndex,EleventhEdition"，通過相關(guān)部分中的提及收入本文)，而且可以根據(jù)本文的公開內(nèi)容與本發(fā)明聯(lián)合。根據(jù)所治療受試者的狀況，一些劑量變化會是必須的。無論如何，負(fù)責(zé)施用的人會為受試者個體確定適宜的劑量，而且此類個體確定在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)?？捎糜诒景l(fā)明的藥理學(xué)治療劑的非限制性例子包括抗高脂蛋白藥、抗動脈硬化藥、抗血栓藥/溶纖維蛋白藥、凝血藥、抗心率不齊藥、抗高血壓藥、血管加壓藥(vesopresser)、充血性心力衰竭的治療劑、抗心絞痛藥、抗菌藥或其組合。另外，應(yīng)當(dāng)注意，任何下述各項可用于開發(fā)心臟療法耙基因的新集合，而本發(fā)明實(shí)施例(見下文)中使用P-阻滯劑。雖然這些基因中許多可能交疊，但是可以開發(fā)新的基因靶。i.抗高脂蛋白藥在某些實(shí)施方案中，可以將降低一種或多種血液脂質(zhì)和/或脂蛋白濃度的藥劑(在本文中稱作"抗高脂蛋白藥，，)的施用與依照本發(fā)明的心血管療法聯(lián)合，特別是在動脈粥樣硬化和血管組織增厚(thickening)或阻塞的治療中。在某些方面，抗高脂蛋白藥可以包括芳氧鏈烷酸/纖維酸(fibricacid)衍生物、樹脂/膽汁酸螯合劑(s叫uesterant)、HMGCoA還原酶抑制劑、煙酸衍生物、曱狀腺激素或曱狀腺激素類似物、雜類藥劑(miscellaneousagent)或其組合。a.芳氧鏈烷酸/纖維酸衍生物芳氧鏈烷酸/纖維酸衍生物的非限制性例子包括千氯貝特(beclobrate)、enzafibrate、比尼貝特(binifibrate)、環(huán)丙貝特(ciprofibmte)、克利貝特(clinofibrate)、氯貝特或氯貝丁酯(clofibrate)(安臟美-S(atromide-S))、氯貝酸(clofibricacid)、依托貝特(etofibrate)、非諾貝特(fenofibrate)、吉非貝齊(gemfibrozil)(洛貝林(lobid))、尼可貝特(nicofibrate)、吡貝特(pirifibrate)、氯煙貝特(ronifibrate)、雙貝特(simfibrate)和益多酉旨(theofibrate)。b.樹脂/膽汁酸螯合劑樹脂/膽汁酸螯含(cholybar，questran)、考來替泊(colestipol)(colestid)禾口降膽葡胺(polidexide)。c.HMGCoA還原酶抑制劑HMGCoA還原酶抑制劑的非限制性例子包括洛伐他汀(lovastatin)(美降降之(zocor))。d.煙酸書t生物煙酸衍生物的非限制性例子包括煙酸鹽(nicotinate)、阿西莫司(acepimox)、戊四煙酯(niceritrol)、尼可氯面旨(nicoclonate)、尼可莫爾(nicomol)考口氧煙酉臾(oxiniacicacid)。e.曱狀腺激素和類似物曱狀腺激素及其類似物的非限制性例子包括etoroxate、曱狀丙酸(勿ropropicacid)和甲狀腺素(thyroxine)。f.雜類抗高脂蛋白藥雜類抗高脂蛋白藥的非限制性例子包括阿昔呋喃(acifran)、阿扎膽醇(azacosterol)、苯氟雷司(benfluorex)、(3畫亞千基丁酰胺(benzalbutyramide)、肉i威(carnitine)、石克酸l欠骨素(chondroitinsulfate)、氯站,酮曱醚(clomestrone)、右旋糖酐(detaxtmn)、碌b酸右旋糖肝鈉(dextransulfatesodium)、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid)、赤西同口票口令(eritadenine)、夫|i勃(furazabol)、美才各魯托(meglutol)、曱亞油酰胺(melinamide)、雙曱雌三醇(mytatrienediol)、鳥氛酸(ornithine)、y-谷維素(oryzanol)、泛疏乙胺(pantethine)、季戊四醇四乙酸酉旨(pentaerythritoltetraacetate)、a-苯基丁酰胺(phenylbutyramide)、p比4U也爾(pirozadil)、普羅布考(probucol)(lorelco)、|3-谷甾醇(sitosterol)、石黃托酸-口底口秦鹽(sultosilicacid-piperazinesalt)、碌u地醇(tiadenol)、曲巾白4立酉享(triparanol)和聯(lián)苯丁酸(xenbucin)。ii.抗動脈粥才羊^/f匕藥抗動脈粥樣硬化藥的非限制性例子包括吡啶醇氨基曱酸酯(pyridinolcarbamate)。iii.抗血栓藥/溶纖維蛋白藥在某些實(shí)施方案中，有助于清除或預(yù)防血塊的藥劑的施用可以與調(diào)控劑的施用聯(lián)合，特別是在動脈粥樣硬化和血管系統(tǒng)(例如動脈)阻塞的治療中?？寡ㄋ幒?或溶纖維蛋白藥的非限制性例子包括抗凝劑、抗凝劑拮抗劑、抗血小板劑、血栓溶解劑、血栓溶解劑拮抗劑或其組合。在某些方面，優(yōu)選可以口服施用的抗血栓藥，諸如例如阿司匹林(aspirin)和華法林(wafarin)(香豆定(Coumadin))。a.抗凝劑抗凝劑的非限制性例子包括醋硝香豆素(acenocoumarol)、安克洛酶(ancrod)、菌萍二S同(anisindione)、；臭節(jié)二酉同(bromindione)、氣節(jié)二酉同(clorindione)、庫美香豆素(coumetarol)、環(huán)香豆素(cyclocumarol)、疏酸右旋糖酐鈉(dextransulfatesodium)、雙香豆素(dicumarol)、二苯茚酮(diphenadione)、只又香豆素乙酉旨(ethylbiscoumacetate)、只又香豆素亞乙酉旨(ethylidenedicoumarol)、氟茚二酉同(fluindione)、肝素(heparin)、？K蟲至素(hirudin)、阿樸酸鈉(lyapolatesodium)、奧沙二酮(oxazidione)、戊聚糖多硫酸酯(pentosanpolysulfate)、笨萍二酉同(phenindione)、笨并香豆素(phenprocoumon)、印黃高磷蛋白(phosvitin)、p比考他胺(picotamide)、p塞氯香豆素(tioclomarol)和華法林warfarin)。b.抗血小板劑抗血小板劑的非限制性例子包括阿司匹林(aspirin)、右旋糖酐(dextran)、雙嘧達(dá)莫(dipyridamole)(潘生丁(persantin))、肝素(heparin)、石黃"比酮(sulfmpyranone)(安特靈(anturane))和p塞氯匹定(ticlopidine)(力抗一全(ticlid))。c.血栓溶解劑血栓溶解劑的非限制性例子包括組織纖溶酶原激活物(Activase)、纖溶酶、尿激酶原、尿激酶(雅激酶(Abbokinase))、鏈激酶(Streptase)、阿尼普酶(anistreplase)/APSAC(依米刃卩酶(eminase))。iv.凝血藥在患者患有出血或出血可能性升高的某些實(shí)施方案中，可以使用可增強(qiáng)血液凝固的藥劑。血液凝固促進(jìn)劑的非限制性例子包括血栓溶解劑拮抗劑和^U疑劑4吉^t劑。a.i元)疑劑4吉4元齊寸抗凝劑拮抗劑的非限制性例子包括魚精蛋白(protamine)和維生素K1。b.血栓溶解劑拮抗劑和抗血栓藥血栓溶解劑拮抗劑的非限制性例子包括氨基己酸(amicar)和氨曱環(huán)酸(amstat)?？寡ㄋ幍姆窍拗菩岳影ò⒛歉窭?anagrelide)、阿加曲班(argatroban)、西魯峻啉(cilstazol)、達(dá)曲班(daltroban)、去纖苦(defibrotide)、依諾肝素(enoxaparin)、速避凝(fraxiparine)、p引哚布喻(indobufen)、lamoparan、奧扎格雷(ozagrel)、吡考他胺(picotamide)、普拉貝脲(plafibride)、替地肝素(tedelparin)、？塞氯匹定(ticlopidine)和三氟柳(triflusal)。v.抗心率不齊藥抗心率不齊藥的非限制性例子包括I類抗心率不齊藥(鈉通道阻滯劑)、n類抗心率不齊藥(p-腎上腺素能阻滯劑)、ni類抗心率不齊藥(復(fù)極延長藥)、iv類抗心率不齊藥(鈣通道阻滯劑)和雜類抗心率不齊藥。a.鈉通道阻滯劑鈉通道阻滯劑的非限制性例子包括IA類、IB類和IC類抗心率不齊藥。IA類抗心率不齊藥的非限制性例子包括丙吡胺(disppyramide)(諾佩斯(norpace))、普魯卡因胺(procainamide)(pronestyl)和奎尼丁(quinidine)(quinidex)。IB類抗心率不齊藥的非限制性例子包括利多卡因(lidocaine)(賽洛卡因(xylocaine))、妥卡尼(tocainide)(妥卡胺(tonocard))和美西律(mexiletine)(脈舒律(mexitil))。IC類抗心率不齊藥的非限制性例子包括恩卡尼(encainide)(恩犬(enkaid))和氟卡尼(flecainide)(tambocor)。b.卩阻滯劑卩阻滯劑(也稱作P-腎上腺素能阻滯劑、p-腎上腺素能拮抗劑或II類抗心率不齊藥)的非限制性例子包括醋丁洛爾(acebutolol)(sectral)、阿普洛爾(alprenolol)、氨磺洛爾(amosulalol)、阿羅洛爾(arotinolol)、阿替洛爾(atenolol)、苯呋洛爾(befunolol)、倍他洛爾(betaxolol)、貝凡洛爾(bevantolol)、比索洛爾(bisoprolol)、波口引洛爾(bopindolol)、布庫洛爾(bucumolol)、布菲洛爾(bufetolol)、丁呔洛爾(bufiiralol)、布尼洛爾(bunitrolol)、布拉洛爾(bupranolol)、鹽酸布替君(butidrinehydrochloride)、丁非洛爾(butofilolol)、卡拉洛爾(carazolol)、卡替洛爾(carteolol)、卡維地洛(carvedilol)、塞利洛爾(celiprolol)、塞他洛爾(cetamolol)、氯拉洛爾(cloranolol)、地來洛爾(dilevalol)、依泮洛爾(epanolol)、艾司洛爾(esmolol)(brevibloc)、茚諾洛爾(indenolol)、拉貝洛爾(labetalol)、左布諾洛爾(levobunolol)、曱口引洛爾(mepindolol)、美替洛爾(metipranolol)、美托洛爾(metoprolol)、莫普洛爾(moprolol)、納多洛爾(nadolol)、萘肝洛爾(nadoxolol)、硝苯洛爾(nifenalol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴布洛爾(penbutolol)、吲咮洛爾(pindolol),普拉洛爾(practolol)、丙萘洛爾(pronethalol)、萘心安(propanolol)(心4尋安(inderal))、索他洛爾(sotalol)(betapace)、硫氧洛爾(sulfinalol)、他林洛爾(talinolol)、特他洛爾(tertatolol)、遂嗎洛爾(timolol)、托利洛爾(toliprolol)和希波酚(xibinolol)。在某些方面，卩阻滯劑包括芳氧丙醇胺衍生物。芳氧丙醇胺衍生物的非限制性例子包括醋丁洛爾(acebutolol)、阿普洛爾(alprenolol)、阿羅洛爾(arotinolol)、阿替洛爾(atenolol)、倍他洛爾(betaxolol)、貝凡洛爾(bevantolol)、比索洛爾(bisoprolol)、波口引洛爾(bopindolol)、布尼洛爾(bunitrolol)、丁非洛爾(butofilolol)、卡拉洛爾(carazolol)、卡替洛爾(carteolol)、卡維地洛(carvedilol)、塞利洛爾(celiprolol)、塞他洛爾(cetamolol)、依泮洛爾(epanolol)、茚諾洛爾(indenolol)、曱吲洛爾(mepindolol)、美替洛爾(metipranolol)、美托洛爾(metoprolol)、莫普洛爾(moprolol)、纟內(nèi)多洛爾(nadolol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴布洛爾(penbutolol)、。引咮洛爾(pindolol)、propanolol、他林洛爾(talinolol)、特他洛爾(tertatolol)、^塞嗎洛爾(timolol)和托利洛爾(toliprolol)。c.復(fù)極延長劑延長復(fù)極的藥劑(也稱作III類抗心率不齊藥)的非限制性例子包括胺碘西同(amiodarone)(可達(dá)龍(cordarone)),口索寸也》各爾(sotak)1)(betapace)。d.4丐通道阻滯劑/拮抗劑4丐通道阻滯劑(也稱作IV類抗心率不齊藥)的非限制性例子包括芳烴胺(arylalkylamine)(例如bepridile、；也爾石克卓(diltiazem)、芬i也4木(fendiline)、戈洛帕米(gallopamil)、普尼拉明(prenylamine)、特羅地林(terodiline)、維拉帕米(verapamil))、二氫吡啶衍生物(非洛地平(felodipine)、^f尹拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群i也平(nitrendipine))、口底口秦書t生物(例如才圭利口秦(cinnarizine)、氟桂利口秦(flunarizine)、利多氟口秦(lidoflazine))或雜類4丐通道阻滯劑諸如千環(huán)烷(bencyclane)、依他苯酮(etafenone)、4美(magnesium)、米貝拉地爾(mibefradil)或哌克昔林(perhexiline)。在某些實(shí)施方案中，4丐通道阻滯劑包括長效二氫吡啶(硝苯地平型)釣拮抗劑。e.雜類抗心率不齊藥雜類抗心率不齊藥的非限制性例子包括阿糖腺苷(adenosine)(腺苷(adenocard))、地高辛(digoxin)(4立諾辛(lanoxin))、乙酰卡尼(acecainide)、阿義馬4木(ajmaline)、克冠嗎啉(amoproxan)、阿普片木定(aprindine)、溴卡胺曱苯磺酸鹽(bretyliumtosylate)、丁萘夫汀(bunaftine)、布托苯定(butobendine)、卡泊酉交(capobenicacid)、西苯口坐淋(cifenline)、p比二丙胺(disopyranide)、二氬查尼丁(hydroquinidine)、英地卡尼(indecainide)、異丙托溴鎮(zhèn)(ipatropiumbromide)、利多卡因(lidocaine)、勞^立義明(lorajmine)、勞卡尼(lorcainide)、曱氧苯汀(meobentine)、莫雷西口秦(moricizine)、p比美諾(pirmenol)、丙緩脈靈(prajmaline)、普羅巾白酮(propafenone)、p比i若4木(pyrinoline)、奎尼丁聚半乳沖唐醛酸鹽(quinidinepolygalacturonate)、石克酸查尼丁(quinidinesulfate)和維p奎地爾(viquidil)。vi.抗高血壓藥抗高血壓藥的非限制性例子包括交感神經(jīng)阻滯藥、a/p阻滯劑、a阻滯劑、抗血管緊張素II藥、卩阻滯劑、鈣通道阻滯劑、血管舒張劑和雜類抗高血壓藥。a.a阻)'帶劑a阻滯劑(也稱作(x-腎上腺素能阻滯劑或a-腎上腺素能拮抗劑)的非限制性例子包括氨磺洛爾(amosulalol)、阿羅洛爾(arotinolol)、達(dá)旅唑(dapipmzole)、多沙唑。秦(doxazosin)、曱石黃酰二氫麥角毒(ergoloidmesylates)、芬司匹利(fenspiride)、巧I口朵4i明(indoramin)、貝洛爾(labetalol)、尼麥角4木(nicergoline)、口底p坐。秦(prazosin)、特4立峻。秦(terazosin)、妥^立"坐片木(tolazoline)、曲馬峻口秦(trimazosin)和育亨賓(yohimbine)。在某些實(shí)施方案中，a阻滯劑可以包括喹唑啉衍生物。壹唑啉衍生物的非限制性例子包括阿夫唑。秦(alfUzosin)、布那口坐。秦(bunazosin)、多沙峻漆(doxazosin)、艱峻口秦(prazosin)、特拉唾口秦(terazosin)和曲馬哇口秦(trimazosin)。b.a/p阻滯劑在某些實(shí)施方案中，抗高血壓藥既是a腎上腺素能拮抗劑又是卩腎上腺素能拮抗劑。a/p阻滯劑的非限制性例子包括拉貝洛爾(labetalol)(normodyne、湍泰低(trandate))。c.抗血管緊張素II類藥抗血管緊張素II類藥的非限制性例子包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素II受體拮抗劑。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACE抑制劑)的非限制性例子包括阿拉普利(alacepril)、依那普利(enalapril)(Vasotec)、卡托普利(captopril)、西4立普利(cilazapril)、i也4立普利(delapril)、依那普^立利(enalaprilat)、福辛普利(fosin叩ril)、賴諾普利(lisinopril)、莫維普利(moveltopril)、培咮普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)。血管緊張素II受體阻滯劑(也稱作血管緊張素II受體拮抗劑、ANG受體阻滯劑或ANG-II型-1受體阻滯劑(ARBS)的非限制性例子包括angiocandesartan、依普羅沙坦(eprosartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(losartan)和纈沙坦(valsartan)。d.交感神經(jīng)阻滯藥交感神經(jīng)阻滯藥的非限制性例子包括作用于中樞的交感神經(jīng)阻滯藥或作用于外周的交感神經(jīng)阻滯藥。作用于中樞的交感神經(jīng)阻滯藥(也稱作中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)交感神經(jīng)阻滯藥)的非限制性例子包括可樂定(clonidine)(catapres)、胍那節(jié)(guanabenz)(wytensin)、胍法辛(guanfacine)(tenex)和曱基多巴(methyldopa)(愛道美(aldomet))。作用于外周的交感神經(jīng)阻滯藥的非限制性例子包括神經(jīng)節(jié)阻滯劑、腎上腺素能神經(jīng)元阻滯劑、P-腎上腺素能阻滯劑或al-腎上腺素能阻滯劑。神經(jīng)節(jié)阻滯劑的非限制性例子包括美卡拉明(mecamylamine)(inversine)和曲美芬(trimethaphan)(阿方那特(arfonad))。腎上腺素能神經(jīng)元阻滯劑的非限制性例子包括胍乙啶(guanethidine)(依斯邁林(ismelin))和利舍平(reserpine)(serpasil)。|3-腎上腺素能阻滯劑的非限制性例子包括醋丁洛爾(acenitolol)(sectral)、阿替洛爾(atenolol)(天諾敏(tenormin))、倍他洛爾(betaxolol)(卡爾侖(kerlone))、卡替洛爾(carteolol)(卡特洛爾(cartrol))、<|立貝洛爾(labetalol)(normodyne、湍泰j氐(trandate))、美4乇洛爾(metoprolol)(lopressor)、納多洛爾(nadanol)(康力口爾多(corgard》、噴布洛爾(penbutolol)(levatol)、口引口呆洛爾(pindolol)(visken)、普萘洛爾(propranolol)(心得安(inderal))和瘞嗎洛爾(timolol)(blocadren)。al-腎上腺素能阻滯劑的非限制性例子包括艱口坐漆(prazosin)(脈寧平(minipress))、多沙峻。秦(doxazocin)(卡杜雷(Cardura))和特拉唑喚(terazosin)(高特靈(hytrin))。e.血管舒張劑在某些實(shí)施方案中，心血管擴(kuò)張劑治療劑可以包括血管舒張劑(例如腦血管舒張劑、冠狀動脈血管舒張劑或周圍血管舒張劑)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，血管舒張劑包括冠狀動脈血管舒張劑。冠狀動脈血管舒張劑的非限制性例子包括胺氧三苯(amotriphene)、地巴唑(bendazol)、琥珀苯呋地爾(benfurodilhemisuccinate)、苯石典達(dá)龍(benziodarone)、氯酚漆(chloracizine)、chromonar、氣苯p夫醇(clobenfUrol)、氣石肖甘'油(clonitrate)、i也4立卓(dilazep)、雙嘧達(dá)莫(dipyridamole)、氬普4立明(droprenilamine)、乙氧黃酮(efloxate)、赤蘚醇四硝酸酯(erythrityltetranitrane)、依他苯酮(etafenone)、芬地林(fendiline)、夫洛地爾(floredil)、更利芬(ganglefene)、乙烷雌酚雙(卩-二乙氨乙基醚)(herestrolbis((3-diethylaminoethylether)、海索苯定(hexobendine)、硝乙醇胺曱苯磺酸鹽(itramintosylate)、凱林(khellin)、利多氟。秦(lidoflanine)、甘露醇六;肖酉交酉旨(mannitolhexanitrane)、美；也巴口秦(medibazine)、；肖酉吏甘'油(nicorglycerin)、戊四硝酉旨(pentaerythritoltetranitrate)、戊硝商享(pentrinitrol)、口底克昔》木(perhexiline)、匹美茶石咸(pimefylline)、曲匹i也爾(trapidil)、tricromyl、曲美他嗪(trimetazidine)、磷酸三硝乙醇胺(trolnitratephosphate)和維斯那定(visnadine)。在某些方面，血管舒張劑可以包括長期療法血管舒張劑或高血壓緊急血管舒張劑。長期療法血管舒張劑的非限制性例子包括肼屈嗪(hydralazine)(apresoline)和米諾地爾(minoxidil)(loniten)。高血壓緊急血管舒張劑的非限制寸生仿J子包4舌；肖普鹽(nitroprusside)(nipride)、二氮口秦(diazoxide)(hyperstatIV)、肼屈。秦(hydralazine)(apresoline)、米諾地爾(minoxidil)(1oniten)和維4i巾白米(verapamil)。f.雜類抗高血壓藥雜類抗高血壓藥的非限制性例子包括阿義馬林(ajmaline)、y-氨基丁酸、丁苯石典胺(bufeniode)、西氯他寧(cicletainine)、環(huán)西多明(ciclosidomine)、鞣酸綠藜安(cryptenaminetannate)、非諾多泮(fenoldopam)、氟司p奎南(flosequinan)、酉同色4木(ketanserin)、美布氨酯(mebutamate)、美卡4立明(mecamylamine)、曱基多巴(methyldopa)、曱基4-吡。定基酮碌b代縮氨基脲(methyl4-pyridylketonethiosemicarbazone)、莫峻胺(muzolimine)、巾白吉林(pargyline)、潘必咬(pempidine)、口比刃，i也爾(pinacidil)、口底羅克生(piperoxan)、普立口底隆(primaperone)、原藜,械(protoveratrine)、蘿巴新(raubasine)、瑞西美托(rescimetol)、利美尼定(rilmenidene)、沙4立豸斤(saralasin)、石肖普4內(nèi)(sodiumnitromsside)、替尼酉臾(ticrynafen)、掉月鹵石黃酉交曲美芬(trimethaphancamsylate)、酪氨酸酶(tyrosinase)和烏4立i也爾(urapidil)。在某些方面，抗高血壓藥可以包括芳基乙醇胺衍生物、苯噻二。秦衍生物、,羧烴基(肽/內(nèi)酰胺)衍生物、二氫吡啶衍生物、胍衍生物、肼/酞。秦、咪唑衍生物、季銨化合物、利舍平衍生物或磺磷酰胺衍生物。芳基乙醇胺衍生物.芳基乙醇胺衍生物的非限制性例子包括氨磺洛爾(amosulalol)、丁^^洛爾(buforak)1)、地來洛爾(dilevalol)、拉貝洛爾(labetalol)、丙萘洛爾(pronethalol)、索他洛爾(sotalol)和硫氧洛爾(sulfmalol)。苯噢二噪衍生物.苯瘞二溱衍生物的非限制性例子包括阿爾噻溱(althizide)、千氟遂。秦(bendroflumethiazide)、千p塞。秦(benzthiazide)、卡氬氯漆口秦(benzylhydrochlorothiazide)、布p塞。秦(buthiazide)、氯p塞。秦(chlorothiazide)、氯p塞酮(chlorthalidone)、環(huán)戊p塞口秦(cyclopenthiazide)、環(huán)p塞。秦(cyclothiazide)、二氮。秦(diazoxide)、依匹^塞。秦(epithiazide)、乙"塞。秦(ethiazide)、芬^奎峻(fenquizone)、氫氯蓬,(hydrochlorothizide)、氫氟p塞口秦(hydroflumethizide)、曱氯漆口秦(methyclothiazide)、美替克侖(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、對氟p塞喚(paraflutizide)、泊利p塞。秦(polythizide)、四氯p塞漆(tetrachlormethiazide)和三氯逸漆(trichlormethiazide)。N-羧烴基(肽/內(nèi)酰胺)衍生物.,羧烴基(肽/內(nèi)酰胺)衍生物的非限制性例子包括阿拉普利(alacepril)、卡托普利(captopril)、西拉普利(dlazapril)、地拉普利(delapril)、依那普利(enalapril)、依那普拉利(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、賴諾普利(lisinopril)、莫維普利(moveltipril)、培咮普利(perindopril)、p奎那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)。二氫吡啶衍生物.二氫吡啶衍生物的非限制性例子包括氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、j尹4立地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼索地平(nisoldipine)禾口尼群;也平(nitrendipine)。胍衍生物.胍衍生物的非限制性例子包括倍他尼定(bethanidine)、異喹胍(debrisoquin)、胍那千(guanabenz)、胍那克林(guanacline)、胍那決爾(g腿adrel)、胍那佐定(g腿azodine)、胍乙咬(g畫ethidine)、胍法辛(guanfacine)、胍氯酚(guanochlor)、胍諾沙節(jié)(guanoxabenz)和胍生(guanoxan)。肼/酞溱.肼/酞喚的非限制性例子包括布屈。秦(budralazine)、卡屈。秦(cadralazine)、雙肼屈。秦(dihydralazine)、恩屈。秦(endralazine)、肼卡巴口秦(hydracarbazine)、肼屈。秦(hydralazine)、苯異丙肼(pheniprazine)、匹爾屈口秦(pildralazine)和托屈口秦(todralazine)。咪唑f汴生物.咪唑衍生物的非限制性例子包括可樂定(clonidine)、洛非西定(lofexidine)、酚妥拉明(phentolamine)、漆美尼定(tiamenidine)和托洛尼定(tolonidine)。季銨化合物.季銨化合物的非限制性例子包括阿扎溴銨(azamethoniumbromide)、松達(dá)氯按(chlorisondaminechloride)、六曱雙鎮(zhèn)(hexamethonium)、曱石克氰戊嗎p林[pentacyniumbis(methylsulfate)]、五曱溴4妄(pentamethoniumbromide)、酒石酉臾戊乂又p比胺(pentoliniumtartrate)、芬4乇氣4妄(phenactropiniumchloride)和曱石克曲美替定(trimethidiniummethosulfate)。利舍平衍生物.利舍平衍生物的非限制性例子包括比他舍平(bietaserpine)、；也舍平(deserpidine)、瑞西那明(rescinnamine)、利舍平(reserpine)和昔洛舍平(syrosingopine)?；橇柞０费苌?磺磷酰胺衍生物的非限制性例子包括安布賽特(ambuside)、氣帕胺(clopamide)、p夫塞米(furosemide)、。引達(dá)巾白胺(indapamide)、p奎乙宗(quinethazone)、曲巾白胺(tripamide)和希巾白胺(xipamide)。g.血管力口壓藥(vesopressors)血管加壓藥一般用于在外科程序中可能發(fā)生的休克過程中提高血壓。血管加壓藥(也稱作抗低血壓藥)的非限制性例子包括氨曱氧苯。秦甲基硫酸鹽(ameziniummethylsulfate)、血管緊張素酰胺、二曱福林(dimetofrine)、多巴胺(dopamine)、依替非明(etifelmin)、依替福林(etilefrin)、吉培福林(gepefrine)、間羥胺(metaraminol)、米多君(midodrine)、去曱腎上腺素(norepinephrine)、福來君(pholedrine)和昔奈福4木(synephrine)vii.用于充血性心力衰竭的治療劑用于充血性心力衰竭治療的藥劑的非限制性例子包括抗血管緊張素II藥、后負(fù)荷—前負(fù)荷還原處理(reductiontreatment)、利尿藥和肌力藥。a.后負(fù)荷-前負(fù)荷減少在某些實(shí)施方案中，可以用聯(lián)合療法來治療不能耐受血管緊張素拮抗劑的動物患者。此類療法可以聯(lián)合肼屈漆(hydralazine)(apresoline)和硝酸異山梨酉旨(isosorbidedinitrate)(isordil,sorbitrate)的施用。b.利尿藥利尿劑的非限制性例子包括噻嗪(thiazide)或苯噻二嗪(benzothiadiazine)衍生物(例如阿爾噻嗪(althiazide)、千氟噻嗪(bendroflumethazide)、芐噻嗪(benzthiazide)、千氬氯p塞口秦(benzylhydrochlorothiazide)、布p塞口秦(buthiazide)、氯p塞。秦(chlorothiazide)、氯p塞。秦(chlorothiazide)、氯p塞酮(chlorthalidone)、環(huán)戊p塞口秦(cyclopenthiazide)、依匹p塞。秦(epithiazide)、乙p塞。秦(ethiazide)、乙p塞。秦(ethiazide)、芬p奎哇(fenquizone)、氪氯p塞。秦(hydrochlorothiazide)、氫氟p塞口秦(hydroflumethiazide)、曱氯p塞。秦(methyclothiazide)、美替克侖(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、對氟p塞漆(paraflutizide)、泊利p塞。秦(polythizide)、四氯口塞口秦(tetrachloromethiazide)、三氯p塞口秦(trichlormethiazide))、有才幾汞(侈'J濁口氯汞君(chlormerodrin)、美才立魯利(meralluride)、汞羅茶石咸(mercamphamide)、石克汞林鈉(mercaptomerinsodium)、汞香豆酸(mercumallylicacid)、汞香豆林鈉(mercumatilindodium)、IU匕亞汞(mercurouschloride)、求4敬矛J(mersalyl))、蝶啶(例如呋氨蝶啶(furterene)、氨苯蝶啶(triamterene))、嘌呤(例如茶堿乙酸口底口秦(acefylline)、7-嗎啉曱茶石威(7-morpholinomethyltheophylline)、巾白馬溴巾白馬溴(pamobrom)、丙可可石威(protheobromine)、可可石咸(theobromine))、類固醇(steroid)包括醛甾酮拮抗劑(例如坎利酮(canrenone)、夾竹桃苷(oleandrin)、螺內(nèi)酯(spironolactone))、磺酰胺衍生物(例如乙酰唑胺(acetazolamide)、安布賽特(ambuside)、阿佐塞米(azosemide)、布美他尼(bumetanide)、布他峻胺(butazolamide)、氣米非那胺(chloraminophenamide)、氣非那胺(clofenamide)、氯帕胺(clopamide)、氯索隆(clorexolone)、二苯基曱烷-4,4'-二磺酰胺(diphenylmethane-4,4'-disulfonamide)、二磺法胺(disulfamide)、依索哇胺(ethoxzolamide)、p夫塞米(fUrosemide)、口引達(dá)中白胺(indapamide)、美夫西凈爭(mefruside)、醋曱峻胺(methazolamide)、口比口各他尼(piretanide)、口奎乙宗(quinethazone)、4乇沖立塞米(torasemide)、曲巾白胺(tripamide)、希巾白胺(xipamide))、尿嘧咬(例如氨美口定(aminometradine)、阿米美吱(amisometradine))、保4甲拮抗劑(potassiumsparingantagonist)(例如阿米洛利(amiloride)、氨苯蟲萊"定(triamterene))或雜類利尿劑諸如氯丙口秦(aminozine)、熊果香(arbutin)、氯拉々L尼(chlorazanil)、依4也尼酉吏(ethacrynicacid)、依^6峻啉(etozolin)、肼卡巴口秦(hydracarbazine)、異山梨酉旨(isosorbide)、甘露酉孚(mannitol)、美才乇查酉同(metochalcone)、莫峻胺(muzolimine)、艱克昔林(perhexiline)、替尼酸(ticrnafen)和脲(urea)。c.肌力藥正性肌力藥(也稱作強(qiáng)心藥)的非限制性例子包括茶堿乙酸(acefylline)、醋洋地黃毒苦(acetyldigitoxin)、2-氨基-4畫皮考啉(2-amino-4-picoline)、氨力農(nóng)(amrinone)、琥3白苯p夫i也爾(benfurodilhemisuccinate)、布4立i也l斤(bucladesine)、黃夾)欠香B(cerberosine)、樟p比^f也胺(camphotamide)、鈴蘭毒苦(convallatoxin)、/f茲麻香(cymarin)、地i若帕明(denopamine)、去乙酰毛花芬(deslanoside)、毛;也黃香(digitalin)、毛地黃(digitalis)、洋地黃毒普(digitoxin)、地高辛(digoxin)、多巴酚丁胺(dobutamine)、多巴胺(dopamine)、多培沙明(dopexamine)、依諾昔酮(enoximone)、紅皮素(erythrophleine)、非那可明(fenalcomine)、吉他林(gitalin)、羥基洋地黃毒苷(gitoxin)、胍基乙酸(glycocyamine)、辛胺醇(heptaminol)、白毛荒分石成(hydrastinine)、異波巾白胺(ibopamine)、毛花洋地黃苦(lanatoside)、曱氧酚酰胺(metamivam)、米力農(nóng)(milrinone)、黃夾次普B(nerifolin)、歐夾竹桃苷(oleandrin)、哇巴因(ouabain)、奧昔非君(oxyfedrine)、普瑞4爭羅(prenalterol)、〉每蔥次香(proscillaridine)、蟾力蘇(resibufogenin)、海蔥苷(scillaren)、海蔥香酉己基(scillarenin)、毒毛S走花素(strphanthin)、好b馬哇(sulmazole)、可可減(theobromine)和扎莫特羅(xamoterol)。在具體的方面，正性肌力藥是強(qiáng)心苦、P-腎上腺素能激動劑或磷酸二酯酶抑制劑。強(qiáng)心苷的非限制性例子包括地高辛(digoxin)(lanoxin)和洋地黃毒苷(digitoxin)(crystodigin)。P-腎上腺素能激動劑的非限制性例子包括沙丁胺醇(albuterol)、班布特羅(bambuterol)、比托特羅(bitolterol)、卡布特羅(carbuterol)、克侖特羅(clenbuterol)、氯丙那林(clorprenaline)、地諾帕明(denopamine)、雙輕乙麻黃堿(dioxethedrine)、多巴酚丁胺(dobutamine)(獨(dú)步催(dobutrex))、多巴胺(dopamine)(intropin)、多培沙明(dopexamine)、麻黃石威(ephedrine)、乙非君(etafedrine)、乙基去曱腎上&泉素(ethylnorepinephrine)、非諾特羅(fenoterol)、福莫特羅(formoterol)、海索那林(hexoprenaline)、異波帕胺(ibopamine)、乙基異丙腎上腺素(isoetharine)、異丙腎上腺素(isoproterenol)、馬布特羅(mabuterol)、奧西那林(metaproterenol)、曱氧那明(methoxyphenamine)、奧昔非君(oxyfedrine)、p比布特羅(pirbuterol)、丙卡特羅(procaterol)、普羅托醇(protokylol)、瑞普特羅(reproterol)、利米特羅(rimiterol)、利托君(ritodrine)、索特瑞醇(soterenol)、特布他林(terbutaline)、曲托喹酚(tretoquinol)、妥洛特羅(tulobuterol)和扎莫特羅(xamoterol)。磷酸二酯酶抑制劑的非限制性例子包括氨力農(nóng)(amrinone)(inocor)。d.抗心絞痛藥抗心絞痛藥可以包括有機(jī)硝酸酯(organonitrate)、4丐通道阻滯劑、卩阻滯劑及其組合。有機(jī)硝酸酯(也稱作硝基血管舒張劑)的非限制性例子包括硝酸甘油(nitroglycerin)(nitro-bid,nitrostat)、二^肖酉交異山梨酉事酉旨(isosorbidedinitrate)(isordil，sorbitrate)禾口,肖酉臾戊酉旨(amylnitrate)(aspirol,vaporole)。viii.內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑內(nèi)皮縮血管肽(ET)是21個氨基酸的肽，其具有很強(qiáng)的生理學(xué)和病理生理學(xué)效應(yīng)，這些效應(yīng)似乎與心力衰竭的形成有關(guān)。ET的效應(yīng)是經(jīng)由與兩類細(xì)胞表面受體的相互作用來介導(dǎo)的。A型受體(ET-A)與血管收縮和細(xì)胞生長有關(guān)，而B型受體(ET-B)與內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管舒張及與其它神經(jīng)激素(諸如醛固酮)的釋放有關(guān)。可抑制ET生成或抑制其刺激相關(guān)細(xì)胞的能力的藥理學(xué)藥劑是本領(lǐng)域已知的。對ET生成的抑制涉及使用能阻斷一種酶的藥劑，該酶稱作內(nèi)皮縮血管肽轉(zhuǎn)化酶，涉及將該肽的前體加工成活性形式的作用。對ET刺激細(xì)胞的能力的抑制涉及使用能阻斷ET與其受體相互作用的藥劑。內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑(ERA)的非限制性例子包括波生坦(Bosentan)、恩拉生坦(Enrasentan)、安貝生坦(Ambrisentan)、達(dá)盧生坦(Darusentan)、替峻生坦(Tezosentan)、阿曲生坦(Atrasentan)、Avosentan、Clazosentan、Edonentan、司他生坦(sitaxsentan)、TBC3711、BQ123、和BQ788。D.夕卜科治療手段(surgicaltherapeuticagent)在某些方面，次級(secondary)治療手段可以包括一些類型的手術(shù)，包括例如預(yù)防性、診斷性或用于分期或分類的、治愈性和姑息性手術(shù)。手術(shù)，特別是治愈性手術(shù)，可以與其它療法聯(lián)合使用，諸如本發(fā)明和一種或多種其它藥劑。此類用于血管和心血管疾病和病癥的外科治療手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，而且可以包括但不限于對生物體實(shí)施手術(shù)、提供心血管機(jī)械假體(cardiovascularmechanicalprostheses)、血管成形術(shù)、冠狀動脈再灌注、導(dǎo)管消融(catheterablation)、給受試者提供可植入的心復(fù)律器除顫器(cardioverterdefibrillator),機(jī)械循環(huán)支持(mechanicalcirculatorysupport)或其組合?？捎糜诒景l(fā)明的機(jī)械循環(huán)支持的非限制性例子包括主動脈內(nèi)球嚢反搏(intra-aorticballooncounterpulsation)、左心室輔助裝置(leftventricularassistdevice)或其組合。E.藥物配制劑和給患者施用的路徑在臨床應(yīng)用中，以適合于預(yù)定應(yīng)用的形式制備藥物組合物。通常，這需要制備基本上不含熱原以及其它會對人類或動物有害的雜質(zhì)的組合物。通常會希望采用適宜的鹽和緩沖劑來使得投遞載體穩(wěn)定和容許被靶細(xì)胞攝取。在將重組細(xì)胞導(dǎo)入患者中時，也會采用緩沖劑。本發(fā)明的水性組合物含有有效量的載體或細(xì)胞，它們?nèi)芙饣蚍稚⒃谒帉W(xué)可接受的載體或水性介質(zhì)中。短語"藥學(xué)可接受的，，或"藥理學(xué)可接受的，，指在施用給動物或人類時不產(chǎn)生不利的、過敏的、或其它不當(dāng)?shù)姆磻?yīng)的分子實(shí)體和組合物。在用于本文時，"藥學(xué)可接受的載體"包括溶劑、緩沖劑、溶液、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌藥、等張劑和吸收延遲劑、等等在配制藥品(諸如適合于給人類施用的藥品)中可被接受使用的藥劑。此類介質(zhì)和藥劑對藥學(xué)活性物質(zhì)的使用是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明涵蓋任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑在治療性組合物中的4吏用，除非其與本發(fā)明的活性成分不相容。還可以將補(bǔ)充性的活性成分摻入組合物中，只要它們不使組合物的載體或細(xì)胞失活。本發(fā)明的活性組合物可以包括藥學(xué)制備物。這些依照本發(fā)明的組合物的施用可以經(jīng)由任何普通路徑，只要經(jīng)該路徑可達(dá)到草巴組織。這包括口服(oral)、經(jīng)鼻、或口含(buccal)?；蛘撸┯每梢允峭ㄟ^皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，或者通過直接注射入心臟組織。此類組合物通常會作為藥學(xué)可接受的組合物來施用，如上文所述。也可以胃腸外或腹膜內(nèi)施用活性化合物。舉例而言，可以在與表面活性劑諸如羥丙基纖維素適當(dāng)混合的水中制備作為游離堿(freebase)或藥理學(xué)可接受鹽的活性化合物溶液。也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及在油中制備分散體。在貯存和使用的常規(guī)條件下，這些制備物一般含有防腐劑以預(yù)防微生物的生長。適合于注射用途的藥學(xué)形式包括例如無菌水溶液或分散體和無菌粉劑，無菌粉劑用于即時制備無菌可注射溶液或分散體。通常，這些制備物是無菌的且流動性達(dá)到易于注射的程度。制備物在生產(chǎn)和貯存的條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，而且應(yīng)當(dāng)具有針對微生物(諸如細(xì)菌和真菌)的污染作用的防護(hù)措施。適宜的溶劑或分散介質(zhì)可以包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、聚丙二醇、和液體聚乙二醇、等等)、它們的合適混合物、和植物油。例如，適當(dāng)?shù)牧鲃有钥梢酝ㄟ^使用涂層(coating)(諸如卵磷脂)、通過維持所需粒度(在分散體的情況中)、和通過使用表面活性劑來維持。對微生物作用的預(yù)防可以通過多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來得到，例如對羥基苯曱酸酯(parabens)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)、等等。在許多情況中，優(yōu)選包括等張劑，例如糖或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長的吸收可以通過在組合物中使用延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來得到。無菌可注射溶液可以如下來制備，即，將活性化合物以適宜量摻入溶劑以及想要的任何其它成分(例如上文所列舉的)中，繼以過濾滅菌。通常，分散體如下來制備，即將各種已滅菌的活性成分摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和想要的其它成分(例如上文所列舉的)的無菌媒介中。對于用來制備無菌可注射溶液的無菌粉劑，優(yōu)選的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，從事先經(jīng)無菌過濾的溶液產(chǎn)生包含活性成分加上任何額外的期望成分的粉末。對于口部施用(oraladministration),—般將本發(fā)明的多肽與賦形劑摻合在一起，并以不可攝取(non-ingestible)的漱口劑和潔齒劑的形式使用。漱口劑可以如下來制備，即將活性成分以需要量摻入適宜溶劑(諸如硼酸鈉溶液(Dobell氏液))中?；蛘?，可以將活性成分摻入含有硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的防腐洗液(antisepticwash)中。也可以將活性成分分散在潔齒劑中，包括凝膠劑、糊劑、粉劑和膏劑。可以將活性成分以治療有效量添加至糊劑潔齒劑，其可以包括水、粘合劑、磨粉、芳香劑、起泡劑、和濕潤劑。本發(fā)明的組合物一般可以配制成中性的或鹽的形式。藥學(xué)可接受的鹽包括例如酸加成鹽(以蛋白質(zhì)的游離氨基形成的)，其衍生自無菌酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如醋酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸、等等)。以蛋白質(zhì)的游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化4丐、或氫氧化鐵)或有機(jī)44(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等等)。一旦配制好后，優(yōu)選以與劑型(dosageformulation)相容的方式和以治療上有效的量來施用溶液?？梢砸远喾N劑型(dosageform)來容易地施用配制劑，諸如可注射溶液、藥物釋放膠嚢、等等。例如，對于水溶液的胃腸外施用，一般將溶液適當(dāng)緩沖，并首先使得液體稀釋劑等張(例如用充足的鹽水或葡萄糖)。此類水溶液可以用于例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選地，采用無菌水性介質(zhì)，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，特別是根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容。舉例而言，可以將單個劑量溶解于lml等張NaCl溶液，并且將其或是添加至1000ml皮下輸液液體中，或是注射于建議的輸注部位(參見"Remington'sPharmaceuticalSciences"第15版，pp1035-1038和1570-1580)。取決于所治療的受試者的狀況，劑量必然會有一些變化。無論如何，負(fù)責(zé)施用的人會為受試者個體確定適宜的劑量。此外，對于人類施用，制備物應(yīng)當(dāng)達(dá)到FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)辦公室(O伍ceofBiologiesstandards)所要求的無菌性、熱原性、整體安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。IV.治療肌肉骨骼疾病和纖維變性疾病的方法在miR-208突變型小鼠的心臟中觀察到了數(shù)種快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的上調(diào)。miR-208突變型小鼠的心臟中快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的這種上調(diào)指示了miR-208遏制快速骨骼肌基因程序(program)。在骨骼肌中，對慢速纖維基因的遏制和對快速纖維基因的激活與眾多肌肉骨骼病癥有關(guān)，包括失用性萎縮、應(yīng)答無重力的肌肉消耗、和失神經(jīng)支配。如此，骨骼肌細(xì)胞中miR-208的表達(dá)在遏制快速纖維基因，及由此激活慢速纖維基因的交互性表達(dá)中可能是有用的。因而，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于通過給患有或有風(fēng)險發(fā)生肌肉骨骼病癥的受試者的骨骼肌施用miR-208來治療肌肉骨骼病癥的方法。根據(jù)特化的收縮和代謝特性，成年骨骼肌纖維可以分成快速顫搐(fasttwitch)和慢速顫搐(slowtwitch)亞型。這些特性反映了肌球蛋白重鏈和輕鏈、原肌球蛋白、和肌釣蛋白以及肌紅蛋白的快速和慢速收縮蛋白同等型的特定集合的表達(dá)(Naya等，2000)。慢速顫搐肌肉主要在慢性活動，諸如姿勢維持和持久的運(yùn)動活動中被使用?？焖兕澊だw維主要用于大力爆發(fā)性活動。成年骨骼肌表型不是靜態(tài)的，而是保持適應(yīng)載荷承擔(dān)和收縮使用樣式的變化的調(diào)整的能力，導(dǎo)致形態(tài)、表型、和收縮特性的適應(yīng)。例如，對于嚙齒類和人類，太空飛行的微重力環(huán)境中身體負(fù)荷的消除導(dǎo)致程度顯著的肌肉萎縮及與收縮和代謝特性從慢到快變化有關(guān)的蛋白質(zhì)表型改變(Tsika等，2002;Baldwin和Haddad，2001;Edgerton和Roy,2000;Fitts等，2000)。如此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給骨骼肌施用miR-208來治療或預(yù)防應(yīng)答重力環(huán)境降低的肌肉消耗的方法。失用性萎縮是因肌肉缺乏使用所致的肌肉萎縮。失用性萎縮通常見于臥床不起者、四肢上石膏者、或出于其它原因不活動者。另外，對肌纖維電活性的破壞，包括失神經(jīng)支配，可導(dǎo)致肌肉萎縮。在短期失用后，肌肉萎縮是可逆的。然而，極端的肌肉失用可導(dǎo)致骨骼肌纖維的永久喪失，并且被結(jié)締組織所取代。發(fā)明人設(shè)想，通過遏制骨骼肌中的快速纖維基因，從而激活慢速纖維基因的交互性表達(dá)，可以減輕或預(yù)防肌肉萎縮的癥狀。如此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給骨骼肌施用miR-208來治療或預(yù)防肌肉萎縮的方法。在控制心臟中的纖維化中發(fā)揮重要作用之外，miR-29分子家族的遍在表達(dá)意味著它還可在其它纖維變性癥候中發(fā)揮作用，諸如那些累及腎、肝和肺的纖維變性癥候。還觀察到糖尿病繼發(fā)的纖維化。l型和2型糖尿病患者的心肌病風(fēng)險升高。糖尿病中的心肌病伴隨著一群特征，包括降低的舒張期順應(yīng)性、間質(zhì)纖維化和肌細(xì)胞肥大。由于miR-208抑制miR-29,因此對miR-208的抑制可用于阻斷心臟纖維化以及非心臟纖維化二者。先天性肝纖維化(CHF)是一種罕見的侵襲肝和腎二者的疾病?；颊哌z傳得到常染色體隱性性狀。肝異常是肝大、將血液從不同器官運(yùn)送至肝的靜脈系統(tǒng)的壓力升高(門靜脈高壓)、和蔓延整個肝臟的纖維樣結(jié)締組織(肝纖維化)，常常稱作肝損害?；疾€體腎功能也受損，這通常是由常染色體隱性多嚢性腎疾病(ARPKD)引起的。成人中與CHF相關(guān)的腎功能受損是由常染色體顯性多嚢性腎疾病(ADPKD)引起的。腎功能的漸進(jìn)性損失不僅伴隨著腎d、球硬化的發(fā)展，而且伴隨著間質(zhì)纖維化。間質(zhì)纖維化的特征在于對腎小管和間質(zhì)毛細(xì)管的破壞以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的積累。小管間質(zhì)性纖維化的嚴(yán)重性早已被認(rèn)為是人類和實(shí)驗性腎d、球腎炎二者中漸進(jìn)性腎損傷的決定性因素。肺纖維化，或稱肺的瘢痕形成，是纖維變性組織逐漸取代正常肺氣嚢的結(jié)果。在瘢痕形成時，組織變厚，引起組織將氧傳遞入血流的能力不可逆喪失。癥狀包括氣短(特別是伴有費(fèi)力)、慢性頻繁干咳、疲勞和虛弱、胸部不適、食欲喪失和體重快速減輕。有人假設(shè)肺纖維化可能是自身免疫病癥，或者是病毒感染的后效應(yīng)。然而，越來越多的人相信遺傳素因是關(guān)鍵因素。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有肺纖維化病史的家族中存在SP-C蛋白中的突變。最近的看法是，纖維變性過程是一種針對肺微觀損傷的(遺傳上偏向的)反應(yīng)。雖然仍然不知道確切的原因，但是已經(jīng)與吸入的環(huán)境和職業(yè)污染物、吸煙、疾病(諸如硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡和結(jié)節(jié)病)、某些醫(yī)藥和治療性輻射聯(lián)系起來?；颊咧械奶悄虿⌒募〔〉奶卣髟谟谛募》蚀?、間質(zhì)纖維化、毛細(xì)管內(nèi)皮變化、和毛細(xì)管基片增厚，其繼發(fā)于膠原結(jié)構(gòu)的改變。膠原積累增加主要見于心外膜和血管周區(qū)域，在那里它誘導(dǎo)LV舒張功能受損，常常導(dǎo)致心力衰竭。V.試劑盒本文所述的任何組合物可包括在試劑盒中。在一個非限制性例子中，miRNA個體包括在試劑盒中。試劑盒可以進(jìn)一步包括水和雜交緩沖液以便于miRNA兩條鏈的雜交。試劑盒還可以包括一種或多種轉(zhuǎn)染試劑以便于將miRNA投遞至細(xì)胞。試劑盒的成分可以在水性介質(zhì)中或以凍干形式包裝。試劑盒的容納手段一般會包括至少一個管形瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容納手段，其中可以裝盛成分，優(yōu)選經(jīng)過合適等分的成分。若試劑盒中有超過一種成分(標(biāo)記試劑和標(biāo)記物可以包裝在一起)，則試劑盒一般還會包括第二、第三或其它額外容器，將所述額外成分分開裝盛。然而，管形瓶中可以裝有各種成分組合。本發(fā)明的試劑盒通常還會包括裝盛核酸的手段，和任何其它試劑容器，其為了商業(yè)銷售是封閉固定的。此類容器可以包括注射或吹塑模制的塑料容器，其中放置想要的管形瓶。若在一種和/或多種液體溶液中提供試劑盒的各成分，則所述液體溶液是水溶液，特別優(yōu)選無菌水溶液。然而，試劑盒的各成分可以作為干燥粉劑來提供。若以干粉來提供各試劑和/或各成分，則所述粉劑可以通過添加合適的溶劑來重建。還可以在另一容納手段中提供所述溶劑。容納手段一般會包括至少一個管形瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器手段，其中裝有核酸配制劑，優(yōu)選合適分配的。試劑盒還可以包括第二容器手段，用于裝盛無菌的、藥學(xué)可接受的緩沖劑和/或其它稀釋劑。本發(fā)明的試劑盒通常還會包括用于裝盛管形瓶的手段，其為了商業(yè)銷售是封閉固定的，諸如例如注射/或吹塑模制的塑料容器，其中放置需要的管形瓶。此類試劑盒還可以包括保持或維持miRNA或保護(hù)其免于降解的成分。此類成分可以是不含RNA酶的，或提供針對RNA酶的保護(hù)。此類試劑盒一般會為每種試劑或溶液提供合適的單獨(dú)容器。試劑盒還會包括采用試劑盒成分以及使用未包括在試劑盒中的任何其它試劑的說明(書)。說明(書)可以包括可以實(shí)施的變化形式。此類試劑是本發(fā)明試劑盒的實(shí)施方案。然而，此類試劑盒不限于上文所列舉的具體項目，而可以包括任何用于操作或表征miRNA的試劑。VI.篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明進(jìn)一步包括用于鑒定在預(yù)防或治療或逆轉(zhuǎn)心臟肥大或心力衰竭中有用的miR-208抑制劑的方法。這些測定法可以包括對候選物質(zhì)大型文庫的隨機(jī)篩選；或者，所述測定法可以用于針對已經(jīng)過選擇的化合物的集中篩選，所述選擇是針對使得化合物更有可能抑制miR-208的表達(dá)和/或功能的結(jié)構(gòu)屬性而進(jìn)行的。為了鑒定miR-208的調(diào)控劑，一般會在存在和不存在候選物質(zhì)時測定miR-208功能。例如，所述方法一般包括(a)提供候選調(diào)控劑；(b)將候選調(diào)控劑與miR-208混合；(c)測量miR-208活性；并(d)比較步驟(c)中的活性與不存在候選調(diào)控劑時的活性，其中測量得到的活性之間有差異指示候選調(diào)控劑確實(shí)是miR-208的調(diào)控劑。所述測定法也可以在分離的細(xì)胞、器官、或活的生物體中實(shí)施。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的所有篩選方法本身是有用的，即使有可能無法找到有效的候選物。本發(fā)明提供了用于篩選此類候選物的方法，而不僅僅是找到它們的方法。A.調(diào)控劑在用于本文時，術(shù)語"候選物質(zhì)"指任何可能調(diào)控miR-208的誘導(dǎo)p-MHC的功能的分子。通常會從各種商業(yè)來源獲得認(rèn)為達(dá)到有用藥物的基本標(biāo)準(zhǔn)的分子文庫，以"強(qiáng)力"推動有用化合物的鑒定。對此類文庫(包括組合產(chǎn)生的文庫，例如antagomir文庫)的篩選是對大量相關(guān)的(和無關(guān)的)化合物進(jìn)行活性篩選的快速且高效的方式。組合法也可用來在具有活性的但在其它方面并不理想的化合物的基礎(chǔ)上創(chuàng)建第二代、第三代、和第四代化合物，從而有助于潛在藥物的快速進(jìn)化。B.體外測定法體外測定法是一種運(yùn)行快速、廉價且容易的測定法。此類測定法一般使用分離的分子，可以快速地、大量地運(yùn)行，由此提高在短時間內(nèi)可獲得的信息量?？梢允褂枚鄠€器皿來運(yùn)行測定，包括試管、板、盤和其它表面，諸如測驗片(dipstick)或珠子。WO84/03564中記載了一種高通量化合物篩選技術(shù)?？梢栽诠腆w基質(zhì)(諸如塑料針或一些其它表面)上合成大量的antogomir小化合物?？梢詫Υ祟惙肿涌焖俸Y選它們與miR-208雜交的能力。C.細(xì)胞內(nèi)(Incyto)測定法本發(fā)明還涵蓋在細(xì)胞中篩選化合物調(diào)控miR-208表達(dá)和功能的能力?？梢岳枚喾N細(xì)胞系，包括衍生自骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞系，來實(shí)施此類篩選測定法，包括為此目的進(jìn)行了專門工程改造的細(xì)胞。也可以使用原代心臟細(xì)胞，正如可以使用H9C2細(xì)胞系。D.體內(nèi)測定法體內(nèi)測定法涉及使用心臟疾病或肌肉骨骼疾病的各種動物模型，包括轉(zhuǎn)基因動物，它們經(jīng)過工程改造而具有特定的缺陷，或者攜帶可用于測量候選物質(zhì)達(dá)到和影響生物體內(nèi)不同細(xì)胞的能力的標(biāo)志物。由于它們的大小、易操作性、和關(guān)于它們的生理學(xué)和遺傳組成的信息，小鼠是一種優(yōu)選的實(shí)施方案，尤其是對于轉(zhuǎn)基因而言。然而，其它動物也是合適的，包括大鼠、家兔、倉鼠、豚鼠、沙鼠、旱獺、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬和猴(包括黑猩猩、長臂猿和狒狒)。針對抑制劑的測定法可以使用衍生自上述任一物種的動物模型來實(shí)施。用測試化合物處理動物可涉及以適宜形式給動物施用化合物。施用可以通過任何可用于臨床目的的路徑。測定化合物在體內(nèi)的效力可涉及多種不同標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于肥大性信號傳導(dǎo)途徑和肥大體征的改變。測量毒性和劑量響應(yīng)也可以以比體外測定法和細(xì)胞內(nèi)測定法更有意義的方式在動物中實(shí)施。VII.用于克隆、基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的載體在某些實(shí)施方案中，采用表達(dá)載體來表達(dá)miR-208或其抑制劑。表達(dá)要求在載體中提供適宜的信號，包含多種調(diào)節(jié)元件，諸如來自病毒和哺乳動物二者來源的、驅(qū)動感興趣基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的增強(qiáng)子/啟動子。還定義了設(shè)計成優(yōu)化信使認(rèn)A在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和可翻譯性的元件。還提供了為了建立表達(dá)產(chǎn)物的永久的、穩(wěn)定的細(xì)胞克隆而使用多種顯性藥物選擇標(biāo)記的條件，以及將藥物選擇標(biāo)記的表達(dá)與多肽的表達(dá)聯(lián)系起來的元件。A.調(diào)節(jié)元件在本申請全文中，術(shù)語"表達(dá)構(gòu)建體"意圖包括任何類型的遺傳構(gòu)建體，其包含編碼基因產(chǎn)物的核酸，該部分或整個核酸編碼序列能夠-故轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄物可以被翻譯成蛋白質(zhì)，但它不需要被翻譯成蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，"表達(dá)'，既包括基因的轉(zhuǎn)錄，又包括mRNA翻譯成基因產(chǎn)物。在其它實(shí)施方案中，"表達(dá)"只包括編碼感興趣基因的核酸的轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方案中，編碼基因產(chǎn)物的核酸在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。"啟動子"指被細(xì)胞的合成機(jī)構(gòu)或?qū)氲暮铣蓹C(jī)構(gòu)所識別，并且為啟動基因的特異性轉(zhuǎn)錄所需的DNA序列。短語"在轉(zhuǎn)錄控制之下"意味著啟動子相對于核酸處于正確位置和取向以控制RNA聚合酶啟動和基因表達(dá)。術(shù)語"啟動子"在本文中會用于指一組在RNA聚合酶II的起始位點(diǎn)周圍簇集的轉(zhuǎn)錄控制模塊。關(guān)于啟動子如何組織的看法大多來源于對數(shù)種病毒啟動子的分析，包括HSV胸苷激酶(汰)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單元的啟動子。這些研究(它們得到了后來工作的支持)顯示了啟動子由離散的功能性模塊構(gòu)成，每個模塊由大約7-20bpDNA組成，且包含一個或多個轉(zhuǎn)錄激活物識別位點(diǎn)或阻遏蛋白識別位點(diǎn)。每種啟動子中的至少一個模塊起著確定RNA合成起始位點(diǎn)的位置的功能。對此了解最多的例子是TATA盒，但是在一些缺乏TATA盒的啟動子中，諸如哺乳動物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子和SV40晚期基因的啟動子，由一個與起始位點(diǎn)自身有交疊的離散元件來幫助確定起始位置。別的啟動子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。通常，這些元件位于起始位點(diǎn)上游30-110bp的區(qū)域內(nèi)，盡管最近證明許多啟動子在起始位點(diǎn)的下游也有功能性元件。啟動子各元件之間的間距通常是靈活的，使得在某元件相對于另一元件顛倒或移動時啟動子功能得到保持。在tk啟動子中，啟動子各元件之間的間距可以提高至相距50bp，之后活性開始降低。取決于啟動子，似乎元件個體可協(xié)作地或獨(dú)立地發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的功能。在其它實(shí)施方案中，可以使用人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動子、SV40早期啟動子、Rous氏肉瘤病毒長末端重復(fù)、大鼠胰島素啟動子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶來高水平表達(dá)感興趣編碼序列。還涵蓋使用本領(lǐng)域眾所周知的其它病毒或哺乳動物細(xì)胞或細(xì)菌噬菌體啟動子來實(shí)現(xiàn)感興趣編碼序列的表達(dá)，只要表達(dá)水平對于給定目的是足夠的。通過采用具有公知特性的啟動子，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化后感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和表達(dá)樣式可以得到優(yōu)化。另外，通過選擇應(yīng)答于特定生理信號而受到調(diào)節(jié)的啟動子，可為基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型表達(dá)提供條件。表1和表2列舉了數(shù)種在本發(fā)明的內(nèi)容中可用于調(diào)節(jié)感興趣基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。該表并非意圖窮舉所有可能涉及啟動基因表達(dá)的元件，僅僅是例示性的。增強(qiáng)子是提高位于同一DNA分子上遠(yuǎn)端位置的啟動子所致轉(zhuǎn)錄的遺傳元件。增強(qiáng)子的組織與啟動子很像。也就是說，它們由許多個體元件構(gòu)成，每個元件結(jié)合一種或多種轉(zhuǎn)錄蛋白。增強(qiáng)子與啟動子之間的基本區(qū)別是運(yùn)作上的(operational)。增強(qiáng)子區(qū)作為整體必須能夠遠(yuǎn)距離刺激轉(zhuǎn)錄，而啟動子區(qū)或其組成元件則不需要如此。另一方面，啟動子必須具有一種或多種指導(dǎo)RNA合成在特定位點(diǎn)和以特定取向起始的元件，而增強(qiáng)子缺乏這些特性。啟動子和增強(qiáng)子常常是交疊的和毗鄰的，似乎常常具有非常相似的模塊組織。下文是可以在表達(dá)構(gòu)建體中與編碼感興趣基因的核酸聯(lián)合使用的病毒啟動子、細(xì)胞啟動子/增強(qiáng)子和誘導(dǎo)型啟動子/增強(qiáng)子的列表(表1和表2)。另外，也可以使用任何啟動子/增強(qiáng)子組合(根據(jù)真核啟動子數(shù)據(jù)庫EPDB)來驅(qū)動基因的表達(dá)。如果提供了適宜的細(xì)菌聚合酶的話(作為投遞復(fù)合體的一部分，或作為另一遺傳表達(dá)構(gòu)建體來提供)，真核細(xì)胞可支持某些細(xì)菌啟動子的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄。表l:啟動子和/或增強(qiáng)子<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表l:啟動子和/或增強(qiáng)子<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>特別感興趣的是肌肉特異性啟動子，尤其是心臟特異性啟動子。這些包括肌球蛋白輕鏈-2啟動子(Franz等，1994;Kelly等，1995)、a肌動蛋白啟動子(Moss等，1996)、肌4丐蛋白l啟動子(Bhavsar等，1996);Na4VCa2+交換器啟動子(Bames等，1997)、抗肌萎縮蛋白啟動子(Kimura等，1997)、a7整聯(lián)蛋白啟動子(Ziober和Kramer,1996)、腦鈉尿肽啟動子(LaPointe等，1996)和aB-晶體蛋白/小熱<木克蛋白啟動子(Gopal-Srivastava，1995)、a肌3求蛋白重《連啟動子(Yamauchi-Takihara等，1989)和ANF啟動子(LaPointe等，1988)。若采用cDNA插入序列，則通常會希望包括多腺苷酸化信號以實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄物的正確多腺苦酸化。認(rèn)為多腺苦酸化信號的性質(zhì)對于本發(fā)明的成功實(shí)施不是至關(guān)重要的，而且可以采用任何此類序列，諸如人生長激素和SV40多腺苦酸化信號。表達(dá)盒的元件還涵蓋終止子。這些元件可用于增強(qiáng)信息水平，并最大程度地減少從所述盒到其它序列的通讀。B.選擇標(biāo)記在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，細(xì)胞包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，可以通過在表達(dá)構(gòu)建體中引入標(biāo)記來在體外或在體內(nèi)識別細(xì)胞。此類標(biāo)記會賦予細(xì)胞以可識別的變化，從而有可能容易地識別包含表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞。通常，藥物選擇標(biāo)記的引入有助于克隆和轉(zhuǎn)化體的選擇，例如賦予針對新霉素、噪呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組氨醇的抗性的基因是有用的選擇標(biāo)記?；蛘撸梢圆捎妹?，諸如單純皰滲胸苷激酶(tk)或鏈霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。也可以采用免疫學(xué)標(biāo)記。認(rèn)為所采用的選擇標(biāo)記不是重要的，只要它能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時表達(dá)。選擇標(biāo)志的其它例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。C.多基因構(gòu)建體和IRES在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，使用內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)元件來創(chuàng)建多基因或多順反子信息。IRES元件能夠繞開5'曱基化帽依賴性翻譯的核糖體掃描模型并在內(nèi)部位點(diǎn)處開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已經(jīng)記載了來自小核糖核酸病毒(picanovirus)家族兩個成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988),以及來自哺乳動物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)?？梢詫RES元件與異源可讀框連4妻。可以一起轉(zhuǎn)錄多個可讀框，每個可讀框以IRES分開，創(chuàng)建多順反子信息。依靠IRES元件，核糖體可閱讀每個可讀框，從而實(shí)現(xiàn)高效翻譯?？梢酝ㄟ^用單個啟動子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄出單條信息來高效表達(dá)多個基因?？梢詫⑷魏萎愒纯勺x框與IRES元件連接。這包括分泌型蛋白質(zhì)、由獨(dú)立基因編碼的多亞基蛋白質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)或膜結(jié)合蛋白質(zhì)和選擇標(biāo)記的基因。這樣，可以利用單一構(gòu)建體和單一選擇標(biāo)記改造細(xì)胞使其同時具有數(shù)種蛋白質(zhì)的表達(dá)。D.表達(dá)載體的投遞有許多方式可以將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建體包括病毒或衍生自病毒基因組的工程改造構(gòu)建體。某些病毒經(jīng)受體介導(dǎo)的胞吞進(jìn)入細(xì)胞、整合入宿主細(xì)胞基因組中、及穩(wěn)定且高效地表達(dá)病毒基因的能力使得它們成為將外來基因轉(zhuǎn)移入哺乳動物細(xì)胞中的有吸引力的候選物(Ridgeway，1988;Nicolas和Rubenstein，1988;Baichwal和Sugden,1986;Temin，1986)。最早用作基因載體的病毒是DNA病毒，包括乳多空病毒(猿病毒40、牛乳頭狀瘤病毒、和多瘤病毒)(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986)和腺病毒(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986)。它們對外來DNA序列的容量相對較低，而且宿主鐠有限。此外，它們在允許細(xì)胞中的致瘤潛力和細(xì)胞病變效應(yīng)引起了人們對于安全性的擔(dān)憂。它們只能容納多至8kB的外來遺傳材料，但是能容易地導(dǎo)入多種細(xì)胞系和實(shí)驗室動物中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986)。用于體內(nèi)投遞的優(yōu)選方法之一涉及使用腺病毒表達(dá)載體。"腺病毒表達(dá)載體"意圖包括那些包含足以(a)支持構(gòu)建體的包裝和(b)表達(dá)已經(jīng)克隆其中的反義多核苷酸的腺病毒序列的構(gòu)建體。在此語境中，表達(dá)不要求基因產(chǎn)物被合成。表達(dá)載體包括遺傳工程形式的腺病毒。關(guān)于腺病毒---種36kB的線性的雙鏈DNA病毒——的遺傳組織的知識，容許人們用多至7kB的外來序列替代大段腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，腺病毒對宿主細(xì)胞的感染不導(dǎo)致染色體整合，因為腺病毒DNA能以附加體方式復(fù)制，沒有潛在的基因毒性。還有，腺病毒在結(jié)構(gòu)上是穩(wěn)定的，而且在廣泛擴(kuò)增后沒有檢測到基因組重排。腺病毒能感染幾乎所有上皮細(xì)胞，不管它們的細(xì)胞周期階段如何。迄今為止，腺病毒感染似乎只與輕微的疾病有關(guān)，諸如人類中的急性呼吸道疾病。由于其中等大小的基因組、易于操作、滴度高、靶細(xì)胞范圍寬和感染性高，腺病毒特別適合于用作基因轉(zhuǎn)移載體。該病毒基因組的兩個末端都包含100-200bp的反向重復(fù)(ITR),它們是病毒DNA復(fù)制和包裝所必需的順式元件?；蚪M的早期(E)和晚期(L)區(qū)域包含不同轉(zhuǎn)錄單元，由病毒DNA復(fù)制的發(fā)作分開。El區(qū)(E1A和E1B)編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒基因組轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)和一些細(xì)胞基因。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達(dá)導(dǎo)致用于病毒DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)的合成。這些蛋白質(zhì)涉及DNA復(fù)制、晚期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞關(guān)閉(shut-off)(Renan,1990)。晚期基因的產(chǎn)物，包括大多數(shù)病毒殼體蛋白質(zhì)，只在由主要晚期啟動子(MLP)產(chǎn)生的單一處理轉(zhuǎn)錄物受到顯著加工后方才表達(dá)。MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期效率特別高，而且由此啟動子產(chǎn)生的所有1111^八都具有5'-三元前導(dǎo)(TPL)序列，使得它們成為翻i奪所優(yōu)選的mRNA。在一種現(xiàn)有的系統(tǒng)中，自穿梭載體與前病毒載體之間的同源重組產(chǎn)生重組腺病毒。由于兩個前病毒載體之間可能的重組，可能自此過程產(chǎn)生野生型腺病毒。因此，自單個噬斑分離病毒的單克隆并檢驗其基因組結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的?，F(xiàn)有的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的生成和繁殖依賴于一種獨(dú)特的輔助細(xì)胞系，稱作293，它是通過用Ad5DNA片段轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞得到的，且組成性表達(dá)El蛋白(Graham等，1977)。由于E3區(qū)不是腺病毒基因組所必需的(Jones和Shenk，1978),現(xiàn)有的腺病毒載體借助293細(xì)胞在E1、D3之任一或兩個區(qū)域中攜帶外來DNA(Graham和Prevec,1991)。在自然界中，腺病毒能包裝野生型基因組的大約10S。/。(Ghosh-Choudhury等，l987)，從而提供了額外的大約2kbDNA的容量。結(jié)合El和E3區(qū)域中可替換的大約5.5kbDNA，現(xiàn)有的腺病毒載體的最大容量在7.5kb以下，或者說載體總長度的大約15%。超過80%的腺病毒基因組保留在載體主鏈中，而且是載體傳播的細(xì)胞毒性的來源。還有，El刪除病毒的復(fù)制缺陷是不完全的。輔助細(xì)胞系可以衍生自人細(xì)胞，諸如人胚胎腎細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞或其它人胚胎間充質(zhì)或上皮細(xì)胞?；蛘撸o助細(xì)胞可以衍生自對人腺病毒允許的其它哺乳動物物種的細(xì)胞。此類細(xì)胞包括例如Vero細(xì)胞或其它猴胚胎間充質(zhì)或上皮細(xì)胞。如上所述，優(yōu)選的輔助細(xì)胞系是293。Racher等(1995)披露了用于培養(yǎng)293細(xì)胞和繁殖腺病毒的改良方法。在一種模式下，將細(xì)胞個體接種入裝有100-200ml培養(yǎng)基的l升滲硅旋轉(zhuǎn)燒瓶(Techne,Cambridge,UK)，來培養(yǎng)天然細(xì)胞聚集體。以40rpm攪動后，用錐蟲藍(lán)估計細(xì)胞存活力。在另一種模式下，如下采用Fibra-Cel微載體(BibbySterlin,Stone,UK)(5g/l)。將重懸在5ml培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種體添加至250ml錐形瓶中的載體(50ml)并靜置l-4小時，偶爾攪動。然后用50ml新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基并開始搖動。為了病毒生成，讓細(xì)胞生長至大約80%匯合，之后更換培養(yǎng)基(至25%總體積)并以0.05的MOI添加腺病毒。將培養(yǎng)物靜置過夜，之后將體積增加至100%并再搖動72小時。除了腺病毒載體是復(fù)制缺陷的或者至少是條件性缺陷的這一要求之外，認(rèn)為腺病毒載體的性質(zhì)對于本發(fā)明的成功實(shí)施不是至關(guān)重要的。腺病毒可以是42種不同的已知血清型或亞群A-F之任一。為了獲得用于本發(fā)明的條件性缺陷的腺病毒載體，亞群C的5型腺病毒是優(yōu)選的起始材料。這是因為5型腺病毒是人腺病毒，已經(jīng)知道了關(guān)于它的許多生化和遺傳信息，而且在傳統(tǒng)上采用腺病毒作為載體的構(gòu)建方法大多使用它。如上所述，依照本發(fā)明的典型載體是復(fù)制缺陷的，而且不會有腺病毒E1區(qū)。如此，在已經(jīng)去除了E1編碼序列的位置導(dǎo)入編碼感興趣基因的多核香酸會是最方便的。然而，在腺病毒序列內(nèi)構(gòu)建體插入的位置對于本發(fā)明不是至關(guān)重要的。也可以將編碼感興趣基因的多核苷酸插入E3置換型載體中來取代已被刪除的E3區(qū)的位置，如Karlsson等(1986)所記載的，或者插入E4區(qū)，此時由輔助細(xì)胞系或輔助病毒來補(bǔ)足E4缺陷。腺病毒易于培養(yǎng)和操作，而且在體外和在體內(nèi)展現(xiàn)出寬宿主范圍?？梢砸愿叩味全@得這組病毒，例如109-1012個噬斑形成單位每!111，而且它們是高度感染性的。腺病毒的生命周期不要求整合入宿主細(xì)胞基因組中。通過腺病毒載體投遞的外來基因是附加體型的，因此對于宿主細(xì)胞具有較低的基因毒性。在用野生型腺病毒進(jìn)行的疫苗接種的研究中沒有副作用的報告(Couch等,1963;Top等，1971),證明了它們作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體的安全性和治療潛力。腺病毒載體已經(jīng)用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991;Gomez-Foix等，1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus和Horwitz,1992;Graham和Prevec,1991)。最近，動物研究提示重組腺病毒可用于基因療法(Stratford-Perricaudet和Perricaudet,1991;Stratford-Perricaudet等，1990;Rich等，1993)。給不同組織使用重組腺病毒的研究包括氣管滴注(Rosenfeld等，1991;Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、周圍靜脈內(nèi)注射(Herz和Gerard,1993)、和立體定向(stereotactic)腦中接種(LeGalLaSalle等，1993)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，其特征在于在受感染細(xì)胞中通過逆轉(zhuǎn)錄將它們的RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA的能力(Coffin,1990)。然后，所得DNA穩(wěn)定地整合入細(xì)胞染色體中成為原病毒并指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成。整合導(dǎo)致病毒基因序列在受體細(xì)胞及其后代中的保持。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包含三種基因，即gag、pol、和env，它們分別編碼殼體蛋白、聚合酶、和被膜成分。在gap基因上游存在的一種序列包含將基因組包裝入病毒體中的信號。病毒基因組的5'和3'末端存在兩個長末端重復(fù)(LTR)序列。它們包含強(qiáng)啟動子和增強(qiáng)子序列，而且也是整合到宿主細(xì)胞基因組中所要求的(Co伍n，1990)。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在將編碼感興趣基因的核酸插入病毒基因組中來取代(intheplaceof)某些病毒序列，以生成復(fù)制缺陷的病毒。為了生成病毒體，構(gòu)建包含gag、pol、和env基因但不含LTR和包裝成分的包裝細(xì)胞系(Mann等，1983)。若將包含cDNA以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列的重組質(zhì)粒導(dǎo)入此細(xì)胞系中(例如通過磷酸4丐沉淀)，包裝序列容許重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物包裝入病毒顆粒中，然后這些病毒顆粒被分泌入培養(yǎng)液中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986;Mann等，1983)。然后收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)液，任選濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染極其多種細(xì)胞類型。然而，整合和穩(wěn)定的表達(dá)要求宿主細(xì)胞的分裂(Paskind等，1975)?；谕ㄟ^化學(xué)添加乳糖殘基至病毒被膜而對逆轉(zhuǎn)錄病毒的化學(xué)修飾，最近開發(fā)了一種旨在使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有特異靶向性的新方法。此修飾能容許經(jīng)唾液酸糖蛋白受體對肝細(xì)胞的特異性感染。設(shè)計了使重組逆轉(zhuǎn)錄病毒具有靶向性的一種不同方法，其中使用了針對逆轉(zhuǎn)錄病毒被膜蛋白和特定細(xì)胞受體的生物素化抗體。通過使用鏈霉親合素經(jīng)生物素偶聯(lián)抗體(Roux等，1989)。使用針對主要組織相容性復(fù)合體I類和II類抗原的抗體，他們在體外用嗜親性病毒演示了對多種攜帶那些表面抗原的人細(xì)胞的感染(Roux等，1989)。某些條件對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在本發(fā)明所有方面的使用產(chǎn)生了限制。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常整合入細(xì)胞基因組中的隨機(jī)位點(diǎn)中。這可以通過對宿主基因的破壞或通過能干擾側(cè)翼基因功能的病毒調(diào)節(jié)序列的插入而導(dǎo)致插入性誘變(Varmus等，1981)。使用缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的另一項擔(dān)心是包裝細(xì)胞中可能出現(xiàn)野生型可復(fù)制病毒。這種現(xiàn)象的原因可能是來自重組病毒的完整序列插入到宿主細(xì)胞基因組中g(shù)ag、pol、env序列的上游的重組事件。然而，現(xiàn)在有新的包裝細(xì)胞系，它們可能大大降低了重組的可能性(Markowitz等，1988;Hersdorffer等，1990)。可以在本發(fā)明中采用其它病毒載體作為表達(dá)構(gòu)建體。可以采用衍生自病毒的載體，諸如痘苗病毒(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden,1986;Coupar等，1988)、腺伴隨病毒(AAV)(Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden，1986;Hermonat和Muzycska，1984)和皰滲病毒。它們?yōu)楦鞣N哺乳動物細(xì)胞提供了數(shù)項有吸引力的特征(Friedmann,1989;Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden,1986;Coupar等，1988;Horwich等，1990)。隨著對缺陷型乙肝病毒的認(rèn)識，人們對不同病毒序列的結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)性有了新的理解。體外研究顯示了病毒即使在多至80%的基因組被刪除時，仍然能保留輔助(病毒)依賴性包裝(helper-dependentpackaging)和逆轉(zhuǎn)錄的能力(Horwich等，1990)。這提示大部分基因組可以用外來遺傳材料替換。向肝性和持久性(整合)對于肝定向基因轉(zhuǎn)移是特別有吸引力的特征。Chang等將鏈霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因?qū)滕喴腋尾《净蚪M中來取代聚合酶編碼序列、表面編碼序列、和前-表面編碼序列。將它與野生型病毒共轉(zhuǎn)染入禽類肝癌細(xì)胞系中。使用含有高滴度重組病毒的培養(yǎng)液來感染原代小鴨肝細(xì)胞。至少在轉(zhuǎn)染后的24天里檢測到穩(wěn)定的CAT基因表達(dá)(Chang等，1991)。為了實(shí)現(xiàn)有義或反義基因構(gòu)建體的表達(dá)，必須將表達(dá)構(gòu)建體投遞入細(xì)胞中。此投遞可以在體外實(shí)現(xiàn)，正如在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的實(shí)驗室規(guī)程中，或者在體內(nèi)或回體實(shí)現(xiàn)，正如在某些疾病狀態(tài)的治療中。投遞機(jī)制之一是經(jīng)病毒感染，其中將病毒構(gòu)建體封裝在病毒顆粒中。本發(fā)明也涵蓋數(shù)種用于將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移入哺乳動物細(xì)胞中的非病毒方法。這些包括磷酸4丐沉淀(Graham和VanDerEb，1973;Chen和Okayama,1987;Rippe等，1990)、DEAE-右旋糖酐(Gopal，1985)、電穿孑L(Tur-Kaspa等,1986;Potter等，1984)、直接顯微注射(Harland和Weintraub,1985)、力口載了DNA的脂質(zhì)體(Nicolau和Sene，1982;Fraley等，1979)和Lipofectamine-DNA復(fù)合物、細(xì)胞超聲處理(Fechheimer等，1987)、使用高速微粒的基因轟擊(Yang等,1990)、及受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，1987;Wu和Wu,1988)。這些技術(shù)中有些可以成功地適應(yīng)體內(nèi)或回體用途。一旦將表達(dá)構(gòu)建體投遞入細(xì)胞中，編碼感興趣基因的核酸可以在不同位點(diǎn)定位和表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，編碼基因的核酸可以穩(wěn)定地整合入細(xì)胞的基因組中。此整合可以是通過同源重組而發(fā)生在天然的位置上并具有天然的取向(基因置換(genereplacement)),或者它可以是隨機(jī)的、非特異性定位的整合(基因增強(qiáng)(geneaugmentation))。在其它實(shí)施方案中，核酸可以以單獨(dú)的、附加型(episomal)的DNA區(qū)段形式穩(wěn)定地維持在細(xì)胞中。這樣的核酸區(qū)段或稱"附加體"編碼足以容許獨(dú)立于或宿主細(xì)胞周期，或與宿主細(xì)胞周期同步地維持和復(fù)制的序列。如何將表達(dá)構(gòu)建體投遞至細(xì)胞和在細(xì)胞中的什么地方維持核酸取決于所采用表達(dá)構(gòu)建體的類型。在本發(fā)明的又一個實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建體可以僅僅由棵重組DNA或質(zhì)粒組成。構(gòu)建體的轉(zhuǎn)移可以通過任何上文所述的以物理或化學(xué)方法將細(xì)胞膜透化的方法來實(shí)施。這特別適用于體外轉(zhuǎn)移，但是它也可以應(yīng)用于體內(nèi)用途。Dubensky等(1984)成功地以磷酸4丐沉淀物的形式將多瘤病毒DNA注射入成年和新生小鼠的肝和脾中，表現(xiàn)出積極的病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也證明了磷酸4丐沉淀的質(zhì)粒的直接腹膜內(nèi)注射導(dǎo)致轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。也可以以相似的方式在體內(nèi)轉(zhuǎn)移編碼感興趣基因的DNA并表達(dá)基因產(chǎn)物。在本發(fā)明的又一個實(shí)施方案中，將棵DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移入細(xì)胞中可能涉及顆粒轟擊。此方法依賴于將包被有DNA的微粒加速至高速，從而容許它們穿過細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞但不殺死細(xì)胞的能力(Klein等，1987)。已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種用于加速小顆粒的裝置。一種這樣的裝置依賴于高電壓放電來產(chǎn)生電流，電流繼而提供動力(Yang等，1990)。所用微粒由生物學(xué)惰性物質(zhì)組成，如鴒珠或金珠。已經(jīng)在體內(nèi)轟擊了選定的器官，包括大鼠和小鼠的肝、腎、和肌肉組織(Yang等，1990;Zelenin等，1991)。這可能要求手術(shù)暴露組織或細(xì)胞，以清除任何介于槍與輩巴器官之間的組織，即回體處理。還有，編碼特定基因的DNA可以經(jīng)此方法來投遞，并且仍然在本發(fā)明的涵蓋之下。在本發(fā)明的又一個實(shí)施方案中，可以將表達(dá)構(gòu)建體封裝在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是嚢泡結(jié)構(gòu)，其特征在于磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)。多層脂質(zhì)體具有具有被水性介質(zhì)分開的多個脂質(zhì)層。它們在將磷脂懸浮在過量的水溶液中時自發(fā)形成。脂質(zhì)成分經(jīng)歷自我重排，之后形成緊密結(jié)構(gòu)并在脂雙層之間捕獲水和溶解的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat，1991)。本發(fā)明還涵蓋Lipofectamine-DNA復(fù)合物。脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸投遞和體外外來DNA表達(dá)已經(jīng)非常成功。Wong等(1980)證明了脂質(zhì)體介導(dǎo)的投遞和外來DNA表達(dá)在培養(yǎng)的雞胚、HeLa和肝瘤細(xì)胞中的可行性。Nicolau等(1987)在大鼠中在靜脈內(nèi)注射后實(shí)現(xiàn)了成功的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以將脂質(zhì)體與血凝病毒(HVJ)復(fù)合。已經(jīng)證明這樣做可促進(jìn)與細(xì)胞膜的融合及促進(jìn)封入脂質(zhì)體的DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等，1989)。在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì)體可以與核非組蛋白染色體蛋白(HMG-I)復(fù)合或聯(lián)用(Kato等，1991)。在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì)體可以與HVJ和HMG-I二者復(fù)合或聯(lián)用。既然此類表達(dá)構(gòu)建體已經(jīng)成功地用于在體外和在體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達(dá)核酸，那么它們適用于本發(fā)明。若在DNA構(gòu)建體中采用細(xì)菌啟動子，則還會希望在脂質(zhì)體內(nèi)包括適宜的細(xì)菌聚合酶?？捎糜趯⒕幋a特定基因的核酸投遞入細(xì)胞中的其它表達(dá)構(gòu)建體有受體介導(dǎo)的投遞媒介(receptor-mediateddeliveryvehicles)。它們利用幾乎所有真核細(xì)胞中通過受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用對高分子的選擇性攝取。由于各種受體的細(xì)胞類型特異性分布，投遞可以是高度特異性的(Wu和Wu，1993)。受體介導(dǎo)的基因靶向媒介一般由兩種成分組成細(xì)胞受體特異性配體和DNA結(jié)合劑。數(shù)種配體已經(jīng)用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。了解最全面的配體是非唾液血液類粘蛋白(asialoorosomucoid,ASOR)(Wu和Wu，1987)和運(yùn)鐵蛋白(Wagner等，1990)。最近，一種與ASOR識別相同受體的合成擬糖蛋白(neoglycoprotein)已經(jīng)被用作基因投遞媒介(Ferkol等，1993;Perales等，1994),0273085)。在其它實(shí)施方案中，投遞媒介可以包含配體和脂質(zhì)體。例如，Nicolau等(1987)用乳糖?；窠?jīng)酰胺(lactosyl-ceramide)(—種以半乳糖為末端的無唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(asialganglioside))摻入脂質(zhì)體中，觀察到了肝細(xì)胞對胰島素基因的攝取增加。如此可見，通過任意種受體-配體系統(tǒng)，在有或無脂質(zhì)體的條件下將編碼特定基因的核酸特異性地投遞入某細(xì)胞類型中也是可行的。例如，可以使用表皮生長因子(EGF)作為受體，介導(dǎo)將核酸投遞入呈現(xiàn)EGF受體上調(diào)的細(xì)胞中?？梢岳酶事短莵戆邢蚋渭?xì)胞上的甘露糖受體。還有，針對CD5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(T細(xì)胞白血病)和MAA(黑素瘤)的抗體可以類似地用作靶向模塊。在一個特定的例子中，可以耳關(guān)合陽離子脂質(zhì)來施用寡核苷酸。陽離子脂質(zhì)的例子包括但不限于Lipofectin、DOTMA、DOPE、和DOTAP。WO0071096(通過提及明確收入本文)的公開文本記載了可以有效用于基因療法的不同配制劑，諸如DOTAP:膽固醇或膽固醇衍生物配制劑。其它公開文本也討論了不同脂質(zhì)或脂質(zhì)體配制劑(包括納米顆粒)和施用方法；這些包括但不限于美國專利開文本20030203865、20020150626、20030032615、和20040048787,通過提及將它們披露配制劑及施用和l殳遞核酸的其它相關(guān)方面明確并入本文。用于形成顆粒的方法也纟皮露于美國專利5,844,107、5,877,302、6,008,336、6,077,835、5,972,901、6,200,801、和5,972,900，本文通過提及并入那些方面。在某些實(shí)施方案中，可以在回體條件下更容易地實(shí)施基因轉(zhuǎn)移。回體基因療法指自動物分離細(xì)胞，在體外將核酸投遞入細(xì)胞，然后將經(jīng)過修飾的細(xì)胞返還入動物中。這可能涉及自動物手術(shù)清除組織/器官或細(xì)胞和組織的原代培養(yǎng)物。VIII.制作轉(zhuǎn)基因小鼠的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案提供了缺乏兩個功能性miR-208等位基因中的一個或兩個的轉(zhuǎn)基因動物。還有，在可誘導(dǎo)的、組織選擇性的或組成性的啟動子的控制下表達(dá)miR-208的轉(zhuǎn)基因動物、衍生自此類動物的重組細(xì)胞系、和轉(zhuǎn)基因胚胎可用于確定miR-208在心肌細(xì)胞的發(fā)育和分化中及在病理性心臟肥大和心力衰竭的形成中發(fā)揮的確切作用。另外，這些轉(zhuǎn)基因動物可以提供對心臟發(fā)育的認(rèn)識。組成性表達(dá)的miR-208編碼核酸的使用提供了過表達(dá)或下調(diào)的表達(dá)的模型。還涵蓋miR-208的兩個等位基因中的一個或兩個被"敲除"的轉(zhuǎn)基因動物。，在一個一般性的方面，如下生成轉(zhuǎn)基因動物，即以容許轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方式將給定轉(zhuǎn)基因整合入基因組中。用于生成轉(zhuǎn)基因動物的方法一般性地記載于Wagner和Hoppe,美國專利4，873,191(通過提及收入本文)和Brinster等，1985(通過纟是及收入本文)。典型地，通過顯微注射將側(cè)翼為基因組序列的基因轉(zhuǎn)移入受精卵中。將顯微注射后的卵植入宿主雌性中，并對后代篩選轉(zhuǎn)基因的表達(dá)?？梢杂迷S多動物的受精卵生成轉(zhuǎn)基因動物，包括但不限于爬行類、兩棲類、鳥類、哺乳類、和魚類?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何手段來制備用于顯微注射的DNA克隆。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以用適于切除細(xì)菌質(zhì)粒序列的酶來切割用于顯微注射的DNA克隆，并將DNA片段在TBE緩沖液中在l。/。瓊脂糖上電泳。用溴化乙錠染色來顯現(xiàn)DNA條帶，并切下含有表達(dá)序列的條帶。然后將切下的條帶置于裝有0.3M乙酸鈉pH7.0的透析袋中。將DNA電洗脫入透析袋中，用l:l苯酚:氯仿溶液抽-提，并通過兩倍體積的乙醇沉淀。將DNA再溶解于lml低鹽緩沖液(0.2MNaCl，20mMTrispH7.4,和lmMEDTA),并在Elutip-DTM柱上純化。將柱首先用3ml高鹽緩沖液(lMNaCl,20mMTrispH7.4，和lmMEDTA)預(yù)處理(prime),繼而用5ml低鹽緩沖液清洗。使DNA溶液流過柱三次以使DNA結(jié)合至柱基質(zhì)。用3ml低鹽緩沖液清洗一次后，用0.4ml高鹽緩沖液洗脫DNA,并用兩倍體積乙醇沉淀。通過UV分光光度計中260nm的吸光度測量DNA濃度。為了顯微注射，將DNA濃度在5mMTrispH7.4和0.1mMEDTA中調(diào)整至3嗎/ml。其它用于純化供顯微注射用的DNA的方法記載于Palmiter等，1982;和Sambrook等，2001。在一種例示性的顯微注射規(guī)程中，如下誘導(dǎo)六周齡雌性d、鼠超輸排卵，即注射(O.lcc,ip)5個IU的懷孕母馬血清促性腺激素(PMSG;Sigma)，48小時后再注射(O.lcc，ip)5個IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG;Sigma)。在hCG注射后立即將雌鼠與雄鼠置于一起。在hCG注射后21小時，通過C02窒息或頸脫位處死交配后的雌鼠，并自切出的輸卵管回收胚胎，置于含0.5。/。牛血清清蛋白(BSA;Sigma)的Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水中。用透明質(zhì)酸酶(lmg/ml)去除周圍的卵丘細(xì)胞。然后清洗原核期胚胎(pronuclearembryo)并在含0.50/。BSA的Earle氏平衡鹽溶液(EBSS)中放置在5。/。C02，95%空氣的增濕氣氛37.5°<:溫箱中，直至注射。可以在二細(xì)胞期植入胚胎。將隨機(jī)循環(huán)(randomlycycling)的成年雌性小鼠與切除了輸精管的雄鼠配對。C57BL/6或Swiss小鼠或其它相當(dāng)?shù)钠废悼梢杂糜诖四康摹?吏受體雌鼠與供體雌鼠在同時交配。在轉(zhuǎn)移胚胎時，用每克體重0.015ml的2.5。/。阿佛丁(avertin)的腹膜內(nèi)注射來麻醉受體雌鼠。通過背中單切口暴露輸卵管。然后穿過輸卵管正上方的體壁做一切口。用瓦切馬克斯氏精細(xì)鑷(watchmakersforceps)撕開卵巢嚢。將待轉(zhuǎn)移的胚胎置于移液器尖頭中(大約10-12個胚胎)的DPBS(Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水)中。將移液管尖頭插入輸卵管漏斗(infundibulum)并轉(zhuǎn)移胚胎。轉(zhuǎn)移后，用兩次縫合封閉切口。IX.定義在用于本文時，術(shù)語"心力衰竭，，泛指任何降低心臟泵血的能力的疾患。其結(jié)果是，在組織中形成充血和水腫。最常見的是，心力衰竭是由冠狀動脈血流降低所致的心肌膜收縮性降低引起的；然而，許多其它因素可導(dǎo)致心力衰竭，包括心瓣膜的損傷、維生素缺乏、和原發(fā)性心肌疾病。盡管尚未完全了解心力衰竭的精確生理學(xué)機(jī)制，但是一般認(rèn)為心力衰竭涉及數(shù)種心臟自主特性的紊亂，包括交感性、副交感性和壓力感受器應(yīng)答。短語"心力衰竭的表現(xiàn)'，廣泛用于涵蓋所有與心力衰竭有關(guān)的后果，諸如呼吸短促、壓凹性水腫、肝擴(kuò)大觸痛、頸靜脈充盈、肺羅音、等等，包括與心力衰竭有關(guān)的實(shí)驗所見。術(shù)語"治療"和"處理"或語法等同物涵蓋心力衰竭癥狀(即心臟泵血的能力)的改善和/或逆轉(zhuǎn)。心臟"生理學(xué)功能的改善"可以使用本文所述任何度量(例如測量射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)(fractionalshortening),左心室尺寸、心率等)，以及任何對動物存活的效應(yīng)來評估。在使用動物模型時，使用本文所述的任何測定法來比較接受治療的轉(zhuǎn)基因動物和未接受治療的轉(zhuǎn)基因動物的響應(yīng)(另外，可以包括接受治療的和未接受治療的非轉(zhuǎn)基因動物作為對照)。由此可以將在本發(fā)明的篩選方法中引起任何與心力衰竭有關(guān)的參數(shù)改善的化合物鑒定為治療性化合物。術(shù)語"擴(kuò)張型心肌病"(dilatedcardiomy叩athy)指心力衰竭的一種類型，其特征在于存在對稱性擴(kuò)張的左心室，伴有較差的收縮期收縮功能，另外，常常累及右心室。術(shù)語"化合物"指任何可用于治療或預(yù)防身體功能的疾病或病癥的化學(xué)實(shí)體、藥物、藥品、等等?；衔锇ㄒ阎暮蜐撛诘闹委熜曰衔??？梢允褂帽景l(fā)明的篩選方法進(jìn)行篩選來確定化合物為治療性。"已知的治療性化合物"指已經(jīng)證明在此治療中有效(例如通過動物試驗或給人類施用的前期實(shí)驗)的治療性化合物。換言之，已知的治療性化合物不限于在心力衰竭治療中有效的化合物。在用于本文時，術(shù)語"激動劑"指模擬"天然"或"自然"化合物的作用的分子或化合物。激動劑可以是在構(gòu)象、電荷或其它特征方面與這些天然化合物同源的。如此，激動劑可以被細(xì)胞表面上表達(dá)的受體所識別。此識別可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的生理學(xué)和/或生物化學(xué)變化，使得細(xì)胞以就像存在天然化合物一樣的方式對激動劑的存在做出反應(yīng)。激動劑可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、或任何其它與感興趣分子、受體、和/或途徑起反應(yīng)的分子。在用于本文時，術(shù)語"心臟肥大，，指成年心肌細(xì)胞通過肥大性生長來應(yīng)答壓力的過程。此類生長的特征在于細(xì)胞尺寸增大而沒有細(xì)胞分裂、在細(xì)胞內(nèi)裝配額外的肌節(jié)以最大化力量產(chǎn)生、和胎兒心臟基因程序的活化。心臟肥大常常與發(fā)病率和死亡率風(fēng)險升高有關(guān)，如此，致力于了解心臟肥大的分子機(jī)制的研究對人類健康將具有重大影響。在用于本文時，術(shù)語"拮抗劑"和"抑制劑"指可抑制可能涉及心臟肥大的細(xì)胞性因子(cellularfactor)的作用的分子、化合物、或核酸。拮抗劑可以劑可以被與激動劑所識別的相同受體所識別，或者被不同的受體所識別。拮抗劑可以具有阻止激動劑作用的別構(gòu)效應(yīng)?；蛘?，拮抗劑可以阻止激動劑的化而使得細(xì)胞以就像存在細(xì)胞因子一樣的方式對拮抗劑的存在做出反應(yīng)。拮抗劑和抑制劑可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、或任何其它與感興趣受體、分子、和/或途徑結(jié)合或相互作用的分子。在用于本文時，術(shù)語"調(diào)控"指生物學(xué)活性的變化或改變。調(diào)控可以是蛋白質(zhì)活性的升高或降低、激酶活性的變化、結(jié)合特征的變化、或與感興趣蛋白質(zhì)或其它結(jié)果的活性有關(guān)的生物學(xué)、功能、或免疫學(xué)特性的任何其它變化。術(shù)語"調(diào)控劑"指任何能夠使上文所述生物學(xué)活性變化或改變的分子或化合物。術(shù)語腎上腺素能受體拮抗劑"指能夠部分地或完全地阻斷貝塔(p)型腎上腺素受體(即響應(yīng)兒茶酚胺，尤其是去曱腎上腺素的腎上腺素能系統(tǒng)受體)的化學(xué)化合物或?qū)嶓w。有些(3-腎上腺素能受體拮抗劑展現(xiàn)出對一種受體亞型(一般是卩,)的一定程度特異性；此類拮抗劑稱作"(3!特異性腎上腺素能受體拮抗劑"和"|32特異性腎上腺素能受體拮抗劑"。術(shù)語"|3-腎上腺素能受體拮抗劑"指作為選擇性和非選擇性拮抗劑的化學(xué)化合物。(3-腎上腺素能受體拮抗劑的例子包括但不限于醋丁洛爾、阿替洛爾、丁氧胺、卡替洛爾、艾司洛爾、拉貝洛爾(labetolol)、美托洛爾、納多洛爾、噴布洛爾、心得安(propanolol)、和瘞嗎洛爾。本發(fā)明的方法涵蓋已知J3-腎上腺素能受體拮抗劑的衍生物的使用。事實(shí)上，本發(fā)明的方法涵蓋在功能上表現(xiàn)為|3-腎上腺素能受體拮抗劑的任何化合物。術(shù)語"血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑"或"ACE抑制劑"指這樣的化學(xué)化合物或?qū)嶓w，其能夠部分地或完全地抑制凝乳酶-血管緊張素系統(tǒng)中涉及將相對無活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)化成有活性的血管緊張素的酶。另外，ACE抑制劑同時抑制緩激肽的降解，這有可能顯著增強(qiáng)ACE抑制劑的抗高血壓效應(yīng)。ACE抑制劑的例子包括但不限于貝那普利(benazepril)、卡托普利、依那普利(enalopril)、福辛普利、賴諾普利、喹那普利(quiapril)和雷米普利。本發(fā)明的方法涵蓋已知ACE抑制劑的衍生物的使用。事實(shí)上，本發(fā)明的方法涵蓋在功能上表現(xiàn)為ACE抑制劑的任何化合物。在用于本文時，術(shù)語"基因型"指生物體的實(shí)際遺傳組成，而"表型"指個體所展示的身體性狀。另外，"表型"是基因組選擇性表達(dá)的結(jié)果(即它是細(xì)胞歷史的表達(dá)及其對胞外環(huán)境的響應(yīng))。事實(shí)上，人類基因組估計包含30,000-35,000個基因。在每種細(xì)胞類型中，這些基因中只有一小部分(即10-15%)得到表達(dá)。X.實(shí)施例包括下列實(shí)施例是為了進(jìn)一步例示本發(fā)明的各個方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員時運(yùn)轉(zhuǎn)良好的技術(shù)和/或組合物，如此可以認(rèn)為它們構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施模式。然而，根據(jù)本申請的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，可以在所公開的具體實(shí)施方案中做出許多變化，仍然獲得類似或相似的結(jié)果且不背離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例l-材料和方法Northern印跡分析。心臟組織樣品來自被診斷為心臟未衰竭的或心臟衰竭的匿名人體，獲自GileadColorado(Westminster,CO)。使用Trizol試劑(Gibco/BRL)，自小鼠、大鼠和人類心臟組織樣品分離總RNA。如先前所述(/)實(shí)施Northern印跡來檢測微RNA。用U6探針作為加樣對照(U6正向5-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3(SEQIDNO:18),U6反向5-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3(SEQIDNO:19))。為了檢測(xMHC表達(dá)，用覆蓋部分5'UTR區(qū)和第一個外顯子的aMHCcDNA片段探查含有10嗎來自成年野生型和miR-208突變型動物二者的心臟組織的RNA的Northern印跡。PTU處理。通過在所示持續(xù)時間里給動物投喂補(bǔ)充有0.15。/。PTU(購自HarlanTekladCo.(TD97061)(Madison,WI))的不含石典食物來誘導(dǎo)曱狀腺激素缺乏。微陣列和實(shí)時PCR分析。使用Trizol(Invitrogen)自心臟組織分離總RNA。使用小鼠基因組4302.0陣列(Affymetrix)實(shí)施微陣列分析。使用隨機(jī)六聚物引物(Invitrogen)對RNA樣品實(shí)施RT-PCR，然后使用購自ABI的Taqman探針的定量實(shí)時PCR分析一個基因子集的表達(dá)。miR-208突變型小鼠的生成。為了生成miR-208尋把載體，用SacII和NotI消化延伸到miR-208編碼區(qū)上游的0.4kb片段(5'臂)并連接入pGKneoF2L2dta尋靶質(zhì)粒中，位于loxP位點(diǎn)和Frt側(cè)翼的新霉素盒上游。用SalI和HindIII消化3.3kb片段(3'臂)并連接入載體中，在新霉素盒與Dta陰性選擇盒之間。通過使用5'和3'探針的Southern印跡分析鑒定攜帶遭到破壞的等位基因的耙ES細(xì)胞。鑒定出三個miR-208靶ES克隆，并用它們進(jìn)行胚泡注射。將這樣得到的嵌合小鼠與C57BL/6繁殖，以獲得突變型等位基因的種系傳遞(germlinetransmission)。PCR引物可應(yīng)請求獲得。Western印跡。如所述(Morkin，2000)自心臟組織提取肌球蛋白。通過SDSPAGE將MHC同等型分開，并用小鼠單克隆aMHC(BA-G5)(ATCC，Rockville,MD)和小鼠單克隆抗肌球蛋白(慢速，骨骼M8421)(Sigma，MO)實(shí)施Westem印跡，后者是對(3MHC高度特異性的。為了檢測所有有條紋的肌球蛋白，使用泛特異性抗體(小鼠單克隆3-48;AccurateChemical&ScientificCorporation,NY)。通過來自400昭心臟蛋白質(zhì)溶胞物的免疫沉淀檢測到THRAP1。將樣品于4。C預(yù)澄清1小時后，將上清液與liil家兔多克隆抗THRAPl(由洛克菲勒大學(xué)的R.Roeder饋贈)和15^d蛋白A珠子一起于4。C溫育過夜。將珠子用裂解緩沖液清洗三次，并在SDS樣品緩沖液中煮沸。通過SDS-PAGE解析免疫沉淀的THRAP1蛋白，并使用1:3000稀釋的家兔多克隆抗THRAP1和1:5000稀釋的偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗家兔IgG來分析，通過Luminol試劑(SantaCruz)來檢測。組織學(xué)分析和RNA原位雜交。將用于組織學(xué)分析的組織在克-漢二氏(Krebs-Henselheit)溶液中溫育，在4%多聚曱醛中固定，切片，并通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Krenz和Robbins,2004)為蘇木精和曙紅(H&E)及Masson氏三色染色或原位雜交進(jìn)行處理。使用Maxiscript試劑盒(Amersham)生成"S標(biāo)記的RNA探針。使用AdobePhotoshop將信號偽著色成紅色。經(jīng)胸超聲心動圖顯象。使用VingmedSystem(GEVingmedUltrasound,Horten,Norway)和11.5MHz線性陣列變換器，通過清醒小鼠中的二維超聲心動圖顯象評估心臟功能和心臟尺寸(dimensions)。使用M模式追蹤來測量舒張末期和收縮末期的前壁和后壁厚度。測量舒張期(LVIDd)或收縮期(LVIDs)中最大的前后直徑作為左心室(LV)內(nèi)徑(LVID)。由對小鼠基因型不知情的單個觀察者對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。依照如下公式計算LV縮短分?jǐn)?shù)(fractionalshorteningFS):FS(%)=[(LVIDd-LVIDs)/LVIDd]x100。轉(zhuǎn)基因小鼠的生成。將感興趣miRNA側(cè)翼的小鼠基因組片段亞克隆到包含a-MHC和人GHpoly(A)+信號的心臟特異性表達(dá)質(zhì)粒(Kiriazis和Kmnias,2000)中。自小鼠尾活檢物分離DNA,并使用對人GHpoly(A)+信號特異性的引物進(jìn)行PCR分析。治療和轉(zhuǎn)染測定法。通過PCR擴(kuò)增涵蓋miR-208編碼區(qū)的305bp基因組片段，并連接入pCMV6中。通過PCR擴(kuò)增涵蓋完整鼠THRAPl-UTR的lkb片段并連接入帶HA標(biāo)簽的pCMV6表達(dá)構(gòu)建體和螢火蟲螢光素酶(f-luc)報道物構(gòu)建體(pMIR-REPORTTM，Ambion)。通過基于PCR的誘變構(gòu)建了UCGUCUUAmiR-208種子結(jié)合序列的突變。實(shí)施例2-結(jié)果miR-208是心臟收縮功能的中樞調(diào)節(jié)物。內(nèi)含子微RNA作為宿主基因轉(zhuǎn)錄物的一部分被轉(zhuǎn)錄，剪接出來，并被加工成成熟miRNA。miR-208是位于a-MHC基因第27個內(nèi)含子內(nèi)的內(nèi)含子miRNA。圖l.像a-MHC—樣，miR-208只在心臟中表達(dá)。圖2.出生后甲狀腺激素通過刺激a-MHC合成和抑制(3-MHC表達(dá)來調(diào)節(jié)心室肌球蛋白同工酶的表達(dá)。為了沖企驗阻斷曱狀腺激素信號傳導(dǎo)是否也影響miRNA-208表達(dá)，發(fā)明人使用心臟大鼠樣品，將其暴露于丙基硫尿嘧咬(PTU)—段預(yù)定的時間。PTU通過抑制碘的"有機(jī)化"(即碘摻入T3和T4中)來阻斷曱狀腺激素生物合成，并由此遏制a-MHC表達(dá)和提高(3-MHC。Northern印跡分析指明了a-MHC表達(dá)水平與前-miRNA(即所謂的"莖環(huán)，，(stemloop))水平之間有極好的相關(guān)性，而成熟miRNA在此后仍然存在數(shù)周。圖3A-C和圖4A-C。為了研究miR-208的作用，發(fā)明人創(chuàng)建了miR-208缺失小鼠。圖5.盡管這沒有干擾a-MHC轉(zhuǎn)錄或翻i奪，但是對2月齡野生型和miR-208KO小鼠的心臟組織的微陣列分析表明，消除miR-208可導(dǎo)致對快速骨骼肌基因的強(qiáng)誘導(dǎo)。圖6A-B和圖7。為了檢驗心臟應(yīng)激過程中miR-208消除的效應(yīng)，發(fā)明人使野生型和miR-208KO動4勿才妾受才黃向主動月永帶纟益(transverseaorticbandconstriction,TAB)。TAB是心臟肥大及其相伴的肥大基因表達(dá)的強(qiáng)力誘因。雖然野生型動物顯示出J3-MHC表達(dá)劇烈升高，但是KO動物沒有顯示出此誘導(dǎo)作用。圖8。表3-TAB后3周的KO對WT<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>總之，這些數(shù)據(jù)表明a-MHC基因的表達(dá)進(jìn)一步誘導(dǎo)一種miRNA的表達(dá)，這種miRNA下調(diào)快速骨骼肌基因程序的表達(dá)。miR-208嵌入在a-MHC基因中，該a-MHC基因受到發(fā)育、生理、和發(fā)育信號的調(diào)節(jié)。a-MHC是快速收縮性的主要決定因素。miR-208在心臟中遏制快速骨骼肌基因，它的刪除可導(dǎo)致快速骨骼肌基因表達(dá)的顯著增加(圖13)。miR-208也是心臟中(3-MHC上調(diào)所需要的。由于微RNA起阻抑物的作用，我們提出這樣的假設(shè)，即miR-208可遏制(3-MHC表達(dá)的阻抑物，如圖9所例示的。在心臟應(yīng)激過程中，此miRNA負(fù)責(zé)(3-MHC在RNA水平和蛋白質(zhì)水平的誘導(dǎo)，而在miR-208缺失時，此誘導(dǎo)作用完全缺失，且a-MHC仍是唯一的肌球蛋白重鏈同等型。對衰竭的和未衰竭的人類心臟樣品中a-MHC表達(dá)的分析顯示，衰竭心臟中的a-MHC表達(dá)與未衰竭心臟中的a-MHC表達(dá)相比降低了(圖IO)。這些數(shù)據(jù)證明了miR-208是心臟收縮功能中的中樞調(diào)節(jié)物，而且似乎涉及心臟病過程中適應(yīng)不良的肌球蛋白轉(zhuǎn)換(maladaptivemyosinswitching)。4吏用miRanda庫欠件(可以乂人MemorialSloan-KetteringCancerCenter的ComputationalBiologyCenter獲得)和用于鑒定miRNA耙物的PicTar算法(Krek等，2005),確定了曱狀腺激素受體相關(guān)蛋白l(THRAPl)是miR-208的預(yù)測耙物。圖12顯示了miR-208與來自人、黑猩猩、小鼠、大鼠、犬、雞、河豚、和斑馬魚的THRAP13'UTR序列的比對。miR-208調(diào)節(jié)病理性心臟重塑。純合的miR-208刪除小鼠是可存活的，而且直到20周也不表現(xiàn)心臟尺寸、性狀或結(jié)構(gòu)方面的明顯異常。為了進(jìn)一步研究miR-208的潛在功能，發(fā)明人比較了野生型和miR-208突變型小鼠對胸主動脈帶縊(thoracicaorticbanding,TAB)的響應(yīng)，胸主動脈帶縊可通過升高心臟后負(fù)荷而誘導(dǎo)心臟肥大，而且伴有ccM/fC下調(diào)和y5M7fC上調(diào)(Hill等，2000)。ccM7/CmRNA表達(dá)如預(yù)期的那樣在TAB之后下降(圖14A),但是miR-208在TAB后21天仍然豐富地表達(dá)(圖14B)，這與其相對較長的半衰期一致。應(yīng)答于TAB，野生型小鼠顯示出心臟質(zhì)量的顯著增加，伴有有心肌細(xì)胞的肥大性生長和心室纖維化(圖15A)。相反，miR-208突變型動物幾乎不顯示應(yīng)答于TAB的心肌細(xì)胞肥大或纖維化(圖15A)。超聲心動圖顯象證實(shí)了miR-208一動物展示出變鈍(blunted)的肥大應(yīng)答和收縮性的降低(圖14C)。最值得注意的是，突變型動物不能上調(diào)PMHC。取而代之的是，在miR-208突變型心臟中aMHC蛋白表達(dá)應(yīng)答于TAB而升高，這可能反映了一種在沒有(3MHC上調(diào)時維持MHC表達(dá)的補(bǔ)充機(jī)制。其它應(yīng)激響應(yīng)性基因，諸如那些編碼鈉尿肽ANF和BNP的基因，在miR-208突變型動物中被強(qiáng)誘導(dǎo)(圖15B-C)。對來自野生型和miR-208一動物的心臟進(jìn)行的微陣列分析證實(shí)了miR-208缺失導(dǎo)致了對(3MHC表達(dá)的高度特異性阻斷(表4-5)。表4-對來自野生型和miR-208一動物的心臟組織的微陣列分析。顯示了每種類別中在miR208一中與野生型動物相比差異表達(dá)的前20種基因。___在miR-208KO動物中相對于野生型動物而言表達(dá)升高的基因_miR-208KO野生型Log倍數(shù)變化_^_349.18.36.378.8早期生長應(yīng)答2(Egr2)7920.41286.273.5小鼠肌鈣蛋白I,骨骼，快速2(Tnni2),mRNA731.39.15.648.5早期生長應(yīng)答2(Egr2)6298,8135.15.545.34546.491.95.339,4695.317.65.236.86580.9170.55.134.37772.6360.64.522.64665.2341.73.914.97909.7119.13.612.13490.1339.83.511.39451486.73.511.31206.8171.138.01277.2219.92.87.0586.2103.42.76.5695.4110.12.66.12313.5500.92.45.31291.9287.42.45.3174.7302.34.9170.4322.24.6熱休克蛋白，70kDa1(Hsp70-1)熱休克蛋白，70kDa3(Hsp70-3)小鼠肌4丐蛋白T3，骨骼，快速(Tnnt3),mRNA熱休克蛋白，70kDa1(Hsp70-1)熱休克蛋白，70kDa1(Hsp70-1)小鼠早期生長應(yīng)答l(Egrl),mRNA肌鈣蛋白I,骨骼，快速2(Tnni2)小鼠核受體亞家族4，A組，成員1(Nr4al),mRNA小鼠肌球蛋白輕鏈，堿性，快速骨骼肌(Mylf)FBJ骨肉瘤癌基因(Fos)溶質(zhì)載體系統(tǒng)ll成員l(天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1)激活轉(zhuǎn)錄因子3小鼠小白蛋白(Pva),mRNADnaJ(Hsp40)同系物，亞家族B,成員1小鼠垂體肺瘤轉(zhuǎn)化基因蛋白(PTTG)mRNA,完整cds遍在蛋白羧基末端水解酶L1(Uchll)小鼠骨調(diào)控蛋白(Omd),mRNA_TAB后3周在miR-208KO動物中相對于野生型動物而言表達(dá)降低的基因miR-208KO野生型Log倍數(shù)變化2.282.747.7142.9-6.4674.2517.5-5.1-3.5-78.8-34,3-11,3基因小鼠核定位的無活性的X特異性轉(zhuǎn)錄物(Xist)mRNAX(無活性的)特異性轉(zhuǎn)錄物，反義小鼠細(xì)胞色素P450,2a5(Cyp2a5),m認(rèn)A315.62607.7-3.4-10.6486.94827.9-3.3-9.834.9205.2-3.3-9.8870.5-3.2-9.223.8129.3-2.9-7.532.4196.2-2.8-7.08.349.3-2.7-6.52.121.5-2.7-6.5225.81498.4-2.7-6.51294.98588.1-2.7-6.5421.74127.3-2.6-6.190.5434.8-2.4-5.37,848.2-2.4-5.3269.31118.5-2.3-4,922.461.2-2.2-4.685469.8-2.2-4.6954.72196.7-2.1-4.3在心室中表達(dá)的小鼠肉堿缺陷相關(guān)基因1(Cdvl),mRNA在心室中表達(dá)的小鼠肉堿缺陷相關(guān)基因1(Cdvl),mRNA卩GlcNAcp1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，多肽2(b3Galt2)小鼠鈣粘著蛋白1(cdHl),mRNA小鼠卩珠蛋白mRNA,部分cds小鼠晶體蛋白，(3A4(Cryba4),mRNA小鼠高活動性組box蛋白(sox2)mRNA，完整cds(3GlcNAc卩1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，多肽2(b3Galt2)小鼠細(xì)胞色素P450,2G(Cyp2f2),mRNAClara細(xì)胞10kD(CC10)蛋白的小鼠m脂A,(Scgblal)小鼠UGRP1AmRNA,完整ces，(Scgb3a2)/PR0D=UGRP1A鉀門控通道，Shal相關(guān)家族，成員2,(Kcnd2)小鼠TNF應(yīng)答元件結(jié)合蛋白mRNA，完整cds,(Smarca3)鉀門控通道，Shal相關(guān)家族，成員2CKcnd2)富含亮氨酸，神經(jīng)膠質(zhì)瘤失活的l，(Lgil)鳥。票呤核普酸結(jié)合蛋白，a12,(Gnal2)小鼠熱休克蛋白25kDa2(心血管)Hsp25-2)，mRNA表5:對來自TAB后3周時的野生型和miR-208一動物的心臟組織的微陣列分析。顯示了每種類別中TAB手術(shù)后3周在miR208一中與野生型動物相比差異表達(dá)的前20種基因。TAB后3周時在miR-208KO動物中相對于野生型動物而言表達(dá)升高的基因miR-208KO野生型Log倍數(shù)變化基因7259.638.87.6194,0小鼠肌鈣蛋白I,骨骼，快速2(Tnm2),mRNA2455.411.87.6194.0小鼠肌鈣蛋白T3，骨骼，快速(Tnnt3),mRNA249.61.37,6194.0小鼠幾丁質(zhì)酶3樣3(CM313),mRNA5624.449.96.168.6X(無活性的)特異性轉(zhuǎn)錄物，反義(Tsix)4267.562.94.624.3肌鈣蛋白I，骨骼，快速2(Tnni2)427.931.83,713.0小鼠血清淀粉樣蛋白A3(Saa3),mRNA607.459.93.29.2小鼠S10(H丐結(jié)合蛋白A8(4丐粒蛋白A)(S100a8),mRNA63168.338.0小鼠小白蛋白(Pva),mRNA1023.2195.32.97.5小鼠整聯(lián)蛋白a9(Itga9),mRNA553.551.12.97.5小鼠S100鈣結(jié)合蛋白A9(釣粒蛋白B)(S100a9),mRNA1476205.12.87.0血小板反應(yīng)蛋白l(Thbsl)2697.7415.72.87.0小鼠肌集鈣蛋白1(Casql)，mRNA1172.3173.12.76.5小鼠賴氨酰氧化酶(Lox),mRNA32767.62.66.1小鼠嗜鉻粒蛋白B(Chgb)，mRNA1488.6241.72.55.7前膠原，III型，al(Col3al)1729.8308.22.45.3彈性蛋白(Eln)771.21282.45.3突觸核蛋白，a(Snca)914.2185.12.34.9小鼠潛伏轉(zhuǎn)化生長因子p結(jié)合蛋白2(Ltbp2),mRNA2753.4425.72.34.9小鼠絲氨酸蛋白酶抑制劑2-2(Spi2-2)，mRNA1509.5256.92.34.9前膠原，V型，a2(Col5a2)TAB后3周時在miR-208KO動物中相對于野生型動物而言表達(dá)降低的基因R-208KO野生型Log倍數(shù)變化基因1.4146.5-5.9-59.7三元基序蛋白12(TRIM12)2.7128.1-5.1-34.3RNA結(jié)合區(qū)(RNP1,RRM)包含(Rnpc2)485.29966.2-4,9-29.9小鼠肌球蛋白，重鏈多肽7，心肌，p(Myh7),mRNA9.8101-3.3-9.8小鼠jumonji(jmj),mRNA9.3144.5-3.2-9.2小鼠小型可誘導(dǎo)細(xì)胞因子Al1(Scyall),mRNA9.986.9-3.1-8.6小鼠鉀門控通道，Isk相關(guān)亞家族，成員1(Kcnd),mRNA7.567.1-3.1-8.6富含亮氨酸，神經(jīng)膠質(zhì)瘤失活的l(Lgil)128.5974.2-3.1-8.6小鼠垂體肺瘤轉(zhuǎn)化基因蛋白(PTTG)mRNA,完整cds300.92502-3.1-8.6熱休克蛋白，70kDa1(Hsp70-1)252.42016.7-3.1-8.6熱休克蛋白，70kDa3(Hsp70-3)7.9133.4-3.0-8.0小鼠前列腺素F受體(Ptgfr),mRNA423.93375.9-3.0-8.0垂體腫瘤轉(zhuǎn)化l(Pttgl)29.5211.8-2.9-7.5小鼠甘氨酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶(2-氨基-3-酮丁酸-輔酶A連接酶)(Gcat)3883048.8-2.9-7.5熱4水克蛋白，70kDa1(Hsp70-1)557.23734.4-2.8-7.0在心室中表達(dá)的小鼠肉堿缺陷相關(guān)基因l(Cdvl),mRNA302.61731.8-2.6-6.1在心室中表達(dá)的小鼠肉堿缺陷相關(guān)基因l(Cdvl),mRNA49.3211.2-2.5-5.712.356.6-2.5-5.742224.8-2.5-5.730.3165.1-2.4-5.3腎雄激素調(diào)節(jié)蛋白(Kap)小鼠絲氨酸羥曱基轉(zhuǎn)移酶mRNA,完全cds巨噬細(xì)胞激活2(Mpa2)過氧化物酶體增殖激活的受體，T共激活物l(Ppargcl)miR-208一小鼠對應(yīng)答于活化鈣依賴磷酸酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)而發(fā)生的纖維化和心肌細(xì)胞肥大也有抗性(圖15D)，活化4丐依賴磷酸酶是心臟肥大和心力衰竭的特別有力的刺激物。類似的，/M//CmRNA和蛋白質(zhì)在6周齡的miR-208一；CnA-Tg小鼠的心臟中沒有上調(diào)；而ANF和BNP^皮強(qiáng)誘導(dǎo)(圖15E-F)。由此可見，1^11-208是^1^/(^上調(diào)和細(xì)胞重塑所必需的，但不是其它心臟應(yīng)激標(biāo)志的表達(dá)所必需的。為了檢驗miR-208是pM7/C表達(dá)上調(diào)的充分條件，發(fā)明人創(chuàng)建了在"M7/C啟動子控制下過表達(dá)miR-208的轉(zhuǎn)基因小鼠。aM//C-mW-2朋轉(zhuǎn)基因小鼠是可存活的，而且以超過野生型心臟約3倍的水平表達(dá)miR-208(圖14D)。來自呈現(xiàn)平均的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系的心臟在2月齡時不顯示明顯的病理性重塑癥狀，但是，值得注意的是，展示出y5M/ZC表達(dá)的顯著上調(diào)(圖15G和圖14E)。miR-208的這種活性是特異性的，因為miR-214(其在心臟肥大過程中被誘導(dǎo))的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)對"M7/C表達(dá)沒有影響?？紤]到成年小鼠心臟中內(nèi)源水平的miR-208不足以上調(diào)y^M/fC表達(dá)，這些轉(zhuǎn)基因小鼠中miR-208表達(dá)升高3倍可導(dǎo)致(3MHC表達(dá)上調(diào)的發(fā)現(xiàn)，提示這種孩iRNA對(3MHC表達(dá)的控制有一個突變的(sharp)閾值。miR-208調(diào)節(jié)對/7W/C的T3依賴性遏制。T3信號傳導(dǎo)經(jīng)由一種正向T3應(yīng)答元件(TRE)誘導(dǎo)ccM/7C轉(zhuǎn)錄，而々M7/C基因的啟動子中的一個負(fù)向TRE介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄遏制(Ojamaa等，2000)。為了檢驗miR-208是否是AM7/C的T3依賴性調(diào)節(jié)所需要的，給突變型和野生型同窩仔畜投喂含PTU的食物2周以阻斷T3信號傳導(dǎo)。Northern印跡分析證實(shí)了miR-208在PTU處理2周后豐富存在(圖16A)。如預(yù)期的，PTU誘導(dǎo)心率和收縮性的降低及舒張的增加，在野生型與突變型動物之間沒有引人注目的差異(圖16B)。然而，雖然野生型動物如預(yù)期的那樣應(yīng)答于PTU而顯示出aM7/C降低和-Mi/C升高，miR-208一動物卻仍然表現(xiàn)出對^Vf/ZC上調(diào)有抗性，盡管可檢測到痕量的/M/ZC表達(dá)(圖17A-B)。PTU上調(diào)了miR-208一動物中的爿iVF和^V尸，這確證了miR-208在"M/ZC表達(dá)中的特異性作用(圖16C)。由于PTU通過僅僅干擾曱狀腺激素受體(TR)信號傳導(dǎo)來誘導(dǎo)從aM7/C到"M7/C的同等型轉(zhuǎn)換，因此這些發(fā)現(xiàn)提示了miR-208通過一種涉及TR的機(jī)制來加強(qiáng)^W7/C表達(dá)。miR-208把向TR相關(guān)蛋白l。在相對較少的miR-208預(yù)測靶物中，編碼曱狀腺激素受體相關(guān)蛋白l(THRAP1)，也稱作TRAP2W的mRNA被PicTar靶物預(yù)測程序(Krek等，2005)評價為最強(qiáng)的預(yù)測靶物。THRAP1是TR相關(guān)TRAP復(fù)合體的組分，通過募集RNA聚合酶II和通用起始因子來調(diào)控TR的活性(Ito和Roeder,2001)。7T77L4尸/m脂A的3'-UTR中的推定的miR-208結(jié)合位點(diǎn)顯示出與miR-208的5'臂——它是miRNA靶向以及進(jìn)化保守的最關(guān)鍵的決定子——的高互補(bǔ)性(圖18A)。根據(jù)miR-208與77/7M尸73'-UTR序列的不完全互補(bǔ)性，預(yù)期miR-208會抑制77/W/57的翻譯。為了檢驗77/WP73'-UTR中的推定的miR-208靶序列是否能介導(dǎo)翻譯遏制，發(fā)明人將77/W尸7轉(zhuǎn)錄物的全長3'-UTR插入螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)染入COS1細(xì)胞中。CMV驅(qū)動的miR-208的量提高導(dǎo)致螢光素酶活性的劑量依賴性降低，而作為對照的相當(dāng)量的miR-126則沒有影響(圖18B)。CMV-miR-208也劑量依賴性地消除與7Hi^P73'UTR結(jié)合序列連接的帶HA標(biāo)簽的丙二酰CoA脫羧酶(MCD)表達(dá)盒的翻譯，但突變型miR-208靶序列不然(圖18C)。另外，與野生型同窩仔畜相比，來自miR-208一小鼠的心臟蛋白質(zhì)溶胞物中的THRAP1蛋白質(zhì)表達(dá)升高(圖18D)，而兩種基因型的心臟中的THRAP1mRNA相當(dāng)(圖19),與miR-208在體內(nèi)起翻譯負(fù)調(diào)節(jié)物的作用的結(jié)論一致?？紤]到新近研究顯示應(yīng)激通過促進(jìn)miRNA與Argonaute的結(jié)合來提升miRNA的遏制作用(Leung等，2006),我們認(rèn)為在應(yīng)激的情形中，miR-208對THRAP1蛋白質(zhì)表達(dá)的負(fù)影響可能還要更大。miR-208是miR-499的表達(dá)所需要的。為了進(jìn)一步探索miR-208在心臟中的作用機(jī)制，發(fā)明人通過微陣列分析確定了來自野生型和miR-208缺失小鼠的心臟中的微RNA表達(dá)樣式。在突變型心臟中上調(diào)和下調(diào)的數(shù)種微RNA中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR-499是在正常心臟中高度豐富的，但是在miR-208突變體中的表達(dá)沒有超過背景水平。這些發(fā)現(xiàn)得到了Northem印跡的證實(shí)(圖21)。對miR-499基因的基因組定位的分析顯示了它被包含在Myh7b基因的第20個內(nèi)含子內(nèi)，Myh7b是a-Mhc基因的同系物(Myh7b)(圖22)。Myh7b基因在脊推動物中是保守的，而且只在心臟和慢速骨骼肌(比目魚肌)中表達(dá)(圖23)。另外，miR-499在心臟肥大過程中下調(diào)(圖24)。MEF2調(diào)節(jié)心臟和骨骼肌中的miR-499表達(dá)。在Myh7基因的5'側(cè)翼區(qū)內(nèi)，發(fā)明人鑒定出一個在物種間保守的潛在MEF2共有序列。此序列在凝膠遷移率變動測定中緊密地結(jié)合MEF2,而且此序列的突變可消除轉(zhuǎn)基因小鼠中l(wèi)acZ報道物的表達(dá)。MEF2位點(diǎn)與保守的E盒序列(CANNTG)并列，后者充當(dāng)以MEF2驅(qū)動骨骼月幾基因表達(dá)的bHLH蛋白的MyoD家族成員的結(jié)合位點(diǎn)。事實(shí)上，MyoD與遍在的bHLH蛋白E12—起結(jié)合來自啟動子的E盒。此序列的突變阻止骨骼肌中l(wèi)acZ轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，但是不影響心臟中的表達(dá)。靶物ID。總之，本文所報告的數(shù)據(jù)指明了受MEF2調(diào)節(jié)的Myh7b基因表達(dá)進(jìn)一步誘導(dǎo)一種慢速肌肉和心臟特異性的miRNA的表達(dá)，而這種miRNA可下調(diào)快速骨骼肌基因程序的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)提供了miRNA499作為骨骼肌纖維類型中的中樞調(diào)節(jié)物的證據(jù)。miR-208與miR-499高度同源，而且值得注意的是這兩種微RNA都是由Mhc基因的內(nèi)含子來編碼的，這提示它們享有共同的調(diào)節(jié)機(jī)制。由于miRNA以序列特異性方式負(fù)影響基因表達(dá)，因此，由于靶基因的交疊，高度的同源性使miR-208和miR-499傾向于發(fā)揮類似的功能。發(fā)明人已經(jīng)鑒定出Mhc表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，它們似乎充當(dāng)miR-499的靶物。發(fā)明人還顯示了miR-499表達(dá)在心臟中受到miR-208的控制，使得miR-208敲低可消除miR-499表達(dá)。由于發(fā)明人先前的數(shù)據(jù)證明了miR-208基因破壞可導(dǎo)致心臟中特異性快速骨骼肌基因的強(qiáng)誘導(dǎo)，因此有可能的是miR-499在骨骼肌中具有相似的功能而且可以起纖維類型的顯性調(diào)節(jié)物的作用。與此假設(shè)相符的是，對此轉(zhuǎn)錄物的啟動子分析表明，miR-499及其宿主轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)受到生肌轉(zhuǎn)錄因子MEF2(骨骼肌纖維類型和慢速纖維基因表達(dá)的一種中樞調(diào)節(jié)物)的調(diào)節(jié)。發(fā)明人已經(jīng)證明了MEF2活性可促進(jìn)肌肉持久力和預(yù)防長時間運(yùn)動后的肌肉疲勞。如此，他們提出MEF2的這些作用至少部分依賴于miR-499表達(dá)的直接激活(圖25)?？傊?，這些數(shù)據(jù)指明了受MEF2調(diào)節(jié)的Myh7b基因表達(dá)進(jìn)一步誘導(dǎo)一種慢速肌肉和心臟特異性miRNA的表達(dá)，而這種miRNA可下調(diào)快速骨駱肌基因程序的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)提供了miRNA499作為骨骼肌纖維類型中的中樞調(diào)節(jié)物的證據(jù)。miR-208和-499高度同源而且這兩種微RNA都由Mhc基因的內(nèi)含子來編碼這一值得注意的事實(shí)提示了它們享有共同的調(diào)節(jié)機(jī)制。由于miRNA以序列特異性方式負(fù)影響基因表達(dá)，因此由于靶基因的交疊，高度的同源性使miR-208和miR-499傾向于發(fā)揮相當(dāng)?shù)墓δ?。發(fā)明人已經(jīng)鑒定出Mhc表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，它們似乎充當(dāng)miR-499的靶物，他們還顯示了miR-499表達(dá)在心臟中受到miR-208的控制，使得miR-208敲低可消除miR-499表達(dá)。應(yīng)激響應(yīng)性miRNA對心臟肥大和心力衰竭的調(diào)節(jié)。根據(jù)它們在細(xì)胞表型調(diào)控中的作用，我們假設(shè)miRNA可能在調(diào)節(jié)心臟對心臟應(yīng)激的應(yīng)答中發(fā)揮作用，已知心臟應(yīng)激可導(dǎo)致基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯變化。為了考察miRNA在心臟肥大中的潛在角色，發(fā)明人在2種已建立的心臟肥大小鼠模型中實(shí)施了并行(side-by-side)miRNA微陣列分析。該分析使用了代表186種不同miRNA的微陣列(Babak等，2004)。對小鼠施加胸主動脈帶縊(TAB)(該處理可通過升高心臟后負(fù)荷而誘導(dǎo)肥大)(Hill等，2000),將這樣的小鼠與偽手術(shù)小鼠進(jìn)行比較。在第二種模型中，將在心臟中表達(dá)激活的鈣依賴磷酸酶(CnA)(這導(dǎo)致一種熟知的嚴(yán)重肥大形式)(Molkentin等，1998)的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型的同窩小鼠進(jìn)行比較(圖26A)。自經(jīng)受TAB的小鼠的心臟分離的RNA顯示出27種miRNA與偽手術(shù)對照相比表達(dá)升高，而且CnATg小鼠顯示出33種miRNA與非轉(zhuǎn)基因同窩小鼠對照相比表達(dá)升高，其中21種在兩種模型中都上調(diào)。類似的，TAB和CnA誘導(dǎo)的肥大分別伴有15種和14種miRNA的表達(dá)降低，其中7種miRNA共同下調(diào)(圖26B)。對這些mi脂A的Northem分析(我們未發(fā)表的數(shù)據(jù))和先前的微陣列分析(Barad等，2004;Sempere等，2004;Shingara等，2005;Liu等，2004)指明了它們在廣泛的組織中表達(dá)。根據(jù)它們的相對表達(dá)水平，人類、大鼠和小鼠序列的保守性，及肥大過程中的表達(dá)水平，發(fā)明人著重關(guān)注ll種上調(diào)的miRNA和5種下調(diào)的miRNA(圖26C)。對來自WT和canTg小鼠的心臟RNA的Northern印跡分析證實(shí)了miR-21,-23,-24,-125b,-195,-199a和-214表達(dá)升高,而miR-29c,-93,畫150和-181b表達(dá)降低(圖26C和圖27)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明在心臟肥大過程中不同的miRNA受到調(diào)節(jié)，提示了它們可能發(fā)揮該過程的調(diào)控物的功能。miR-29家族作為miR-208調(diào)節(jié)作用的下游把物。發(fā)明人對來自野生型和miR-208缺失小鼠的心臟實(shí)施了miRNA微陣列以圖鑒定可能介導(dǎo)miR-208作用的下游miRNA(圖28)。他們發(fā)現(xiàn)了miR-29家族的多個成員在miR-208缺失小鼠中上調(diào)(圖29)。耙物預(yù)測表明miR-29家族成員靶向編碼多種膠原酶和其它胞外基質(zhì)成分的mRNA(圖30)。因此，miR-208缺失小鼠中miR-29家族成員的上調(diào)有可能是這些動物中發(fā)現(xiàn)的纖維化被阻斷的原因(圖31)?？偨Y(jié)。miR-29在患病心臟中下調(diào)，并且靶向編碼膠原酶和胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，這些發(fā)現(xiàn)提示了增強(qiáng)miR-29的表達(dá)或增強(qiáng)其與靶mRNA的結(jié)合的策略有可能在病理性心臟重塑和纖維化的背景下對心臟產(chǎn)生有益效應(yīng)。此外，miR-29表達(dá)或功能的提高有可能預(yù)防諸如肝、肺、腎等組織中與許多疾病有關(guān)的纖維化。另外，miR-28遏制miR-29表達(dá)和miR-208上調(diào)miR-29表達(dá)的事實(shí)表明miR-29是miR-208對心臟的作用的下游介導(dǎo)物。實(shí)施例3-討論這些結(jié)果證明了由aM/ZC基因的內(nèi)含子編碼的miR-208可調(diào)節(jié)應(yīng)激依賴性心肌細(xì)胞生長和基因表達(dá)。在miR-208缺失時，〃^/(:的表達(dá)在成年心臟中應(yīng)答于壓力過度負(fù)荷、鈣依賴磷酸酶激活、或曱狀腺機(jī)能減退等而嚴(yán)重鈍化，提示了這些刺激因素對"M/C轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)途徑享有共同的miR-208敏感性組分(圖9)。相反，ySM/ZC表達(dá)在新生miR-208^小鼠的心臟中沒有改變，證明miR-208作用機(jī)制的一個線索來自miR-208—〃心臟與曱狀腺機(jī)能亢進(jìn)心臟的類似性，二者都展現(xiàn)出(3MHC表達(dá)的阻斷、應(yīng)激應(yīng)答基因的上調(diào)(Wei等,2005;Pantos等，2006)、和針對病理性肥大和纖維化的保護(hù)(Yao和Eghbali,1992;Chen等，2000)。miR-20^心臟中的快速骨骼肌基因的上調(diào)也與曱狀腺機(jī)能亢進(jìn)狀態(tài)中快速骨骼肌纖維的誘導(dǎo)類似(Vadaszova等，2004)。T3信號傳導(dǎo)遏制出生后心臟中的"M/ZC表達(dá)，而可引起曱狀腺機(jī)能減退的PTU則可誘導(dǎo)^M7/C(Morkin，2000;Schuyler和Yarbrough，1990)。PTU不能在miR-208一心臟中誘導(dǎo)"MJ7C表達(dá)，進(jìn)一步暗示miR-208涉及T3信號傳導(dǎo)途徑。這些結(jié)果提示了miR-208至少部分地通過遏制TR共調(diào)節(jié)物THRAP1的表達(dá)來起作用，THRAPl可發(fā)揮對轉(zhuǎn)錄的正和負(fù)效應(yīng)(Pavri等，2005;Park等,2005)。TR通過負(fù)TRE來起作用，以遏制成年心臟中的"MZ/C表達(dá)(Morkin，2000)。因此，在miR-208缺失時THRAPl表達(dá)的升高預(yù)期會增強(qiáng)TR對/M7/C表達(dá)的遏制活性，這miR-208一心臟中^M/ZC表達(dá)的阻斷相呼應(yīng)。相反，發(fā)育過程中對aMi/C和/M7/C表達(dá)的調(diào)節(jié)獨(dú)立于T3信號傳導(dǎo)(Morkin，2000)，而且不受miR-208影響。值得注意的是，其它TR靶基因，諸如受磷蛋白(PLB)和肌(內(nèi))質(zhì)網(wǎng)4丐ATP酶(SERCA)h和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)4在miRJ0S一小鼠中正常表達(dá)(圖20)。有人已提出"M/ZC基因可能應(yīng)答特異性TR同等型(Kinugawa等.，2001;Mansen等，2001;Kinugawa等，2001)?？赡躎HRAP1經(jīng)由于TR依賴性基因的一個子集。因為miRNA—般通過多種下游靶物來發(fā)揮它們的效應(yīng)，別的靶物也有可能有助于miR-208對心臟生長和基因表達(dá)的效應(yīng)。PM/C組成的相對輕微增加，正如心臟肥大和心力衰竭過程中所發(fā)生的，可降低肌纖維ATP酶活性和收縮功能(Abraham等，2002)。如此，對miR-208表達(dá)或與其mRNA靶物的相互作用的治療性操作可能能夠通過遏制PMHC表達(dá)來增強(qiáng)心臟功能。根據(jù)miR-208對心臟應(yīng)激應(yīng)答的突出影響及對患病心臟中眾多miRNA的調(diào)節(jié)(vanRooij等，2006),發(fā)明人預(yù)期miRNA會被證實(shí)是對成年心臟和可能其它器官的功能和對疾病的應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。根據(jù)本申請的公開內(nèi)容，無需過度實(shí)驗就可以制備和實(shí)施本文中公開的和要求保護(hù)的所有組合物和方法。盡管已經(jīng)以優(yōu)選實(shí)施方案中描述了本發(fā)明的組合物和方法，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對本文所述組合發(fā)明的觀念、精神和范圍。更具體的說，顯而易見的是，可以用化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的某些藥劑替換本文所述藥劑，卻會實(shí)現(xiàn)相同或相似的結(jié)果。認(rèn)為對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有此類相似的替代和改良在本發(fā)明的精神、范圍和概念的范圍內(nèi)，其由所附權(quán)利要求來限定。XI.參考文獻(xiàn)將下列參考文獻(xiàn)明確通過提及收入本文，但限于為本文給出的方法等細(xì)節(jié)提供進(jìn)一步補(bǔ)充。美國專利4，873,191美國專利5,604，251美國專利5，844，107美國專利5,877,302美國專利5，972,900美國專利5,972,901美國專利6,008，336美國專利6,077,835美國專利6,200,801美國公開文本20020150626美國公開文本20030032615美國公開文本20030203865美國/〉開文本20040048787Abraham等，MolMed.,8:750-760，2002.Ambros，Cell,113(6):673-676,2003.Angel等，Cell,49:729,1987b.Angel等，MolCell.Biol,7:2256,1987a.Atchison和Perry，Cell,46:253，1986.Atchison和Perry，Cell,48:121,1987.Babak等，RNA10:1813-1819,2004.Baichwal和Sugden,《GeneTransfer》，Kucherlapati編,PlenumPress,NY,117-148,1986.Baldwin和Haddad，J.ApplPhysiol"90:345-357，2001.Banerji等，Cell,27(2Ptl):299-308,1981.Banerji等，Cell,33(3):729-740，1983.B&r&6t等.，GenomeRes.14:2486-2494,1997.Bames等,J.Biol.Chem.,272(17):11510-11517，1997.Benvenisty和Neshif，Proc.Natl.Acad.Sd.USA,83(24):9551-9555,1986.Berkhout等，Cell,59:273-282,1989.Bhavsar等，Genomics,35(1):11-23,1996.BU匿等，EMBOJ"8:1139，1989.Bodine和Ley，EMBOJ.，6:2997,1987.Boshart等，Cell,41:521，1985.Bosze等，EMBOJ"5(7)1616-1623，1986.Braddock等，Cell,58:269,1989.Brennecke等.，Cell,113:25-36,2003.Brinster等.，Proc.Natl.Acad.SciUSA,82(13):4438-4442,1985.Bristow,Cardiology,92:3-6，1999.Bulla和Siddiqui,J.Virol,62:1437,1986.Calin等，Proc.Natl.Acd.SciUSA,99:15524-15529,2002.Campbell和Villarreal，Mol.Cell.Biol,8:1993,1988.Campere和Tilghman,GenesandDev.,3:537,1989.Campo等，Nature,303:77，1983.Carrington等Science,301(5631):336-338，2003.Celander和Haseltine,J.Virology,61:269,1987.Celander等,J.Virology,62:1314,1988.Chandler等，Cell,33:489，1983.Chang和Karin，Nature,410(6824):37-40，2001.Chang等，Biochim.Biophys.Acta,1092(2):153-160,1991.Chang等,Mol.CellBiol,9:2153，1989.Chang等，Nature,430(7001):785-789，2004.Chatterjee等，Proc.Natl.Acad.SciUSA,86:9114，1989.Chen和Okayama，Mo/.CellBiol,7(8):2745-2752,1987.Chen等，MolCellEndocrinol,162:45-55,2000.Chen等，Science,303(5654):83-86,2004.Choi等，Cell,53:519,1988.Coffin,In:Virology,Fields等編，RavenPress,NY,1437-1500,1990.Cohen等,J.CellPhysiol,5:75,1987.Costa等，MolCell.Biol,8:81，1988.Couch等，Am.Rev.Resp.Dis.，88:394-403,1963.Coupar等，Gene,68:1-10,1988.Cripe等，EMBOJ.,6:3745,1987.Culotta和Hamer，MolCell.Biol,9:1376,1989.Dandolo等.，J.Virology,47:55-64,1983.OeViUiers等.，Nature,312(5991):242-246,1984.Deschamps等，Science,230:1174-1177,1985.Dubensky等，jProc.Natl.Acad.SciUSA,81:7529-7533,1984.Durand等，Ann.Med.,27:311-317，1995.Edbrooke等，Mol.Cell.Biol,9:1908,1989.Edgerton和Roy，J.ApplPhysiol,89:1224-1231,2000.Edlund等，Science,230:912-916,1985.Eichhom和Bristow,Circulation,94:2285-2296,1996.EPO0273085Fechheimer，等，ProcNatlAcad.Sci.USA,84:8463-8467，1987.Feng和Holland,Nature,334:6178，1988.Ferkol等,FASEBJ"7:1081-1091,1993.Firak和Subramanian,MolCell.Biol,6:3667,1986.Fitts等，J.ApplPhysiol,89:823-839,2000.Foecking和Hofstetter，Gene,45(1):101-105，1986.Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348-3352，1979.Franz等，Cardioscience,5(4):235-43,1994.Friedman等，GenesDevel,3:1314，1989.Fujita等，Cell,49:357,1987.Ghosh和Bachhawat,《LiverDiseases,TargetedDiagnosisandTherapyUsingSpecificReceptorsandLigands》，Wu等編，MarcelDekker,NY,87-104,1991.Ghosh-Choudhury等，EMBOJ"6:1733-1739，1987.Gilles等，Cell,33:717,1983.Gloss等，EMBOJ,6:3735,1987.Godbout等，MolCell.Biol,8:1169,1988.Gomez-Foix等，J.Biol.Chem.，267:25129-25134,1992.Goodboum和Maniatis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:1447,1988.Goodbourn等，Cell,45:601，1986.Gopal,Mol.CellBiol，5:1188-1190，1985.Gopal陽Srivastava等，J.Mol.CellBiol15(12):7081-7090，1995.Graham和Prevec,《MethodsinMolecularBiology:GeneTransferandExpressionProtocol》，Murray編，HumanaPress,Clifton,NJ,7:109-128，1991.Graham和VanDerEb，Virology,52:456-467,1973.Graham等，J.Gen.Virl，36(l):59-74,1977.Greene等,ImmunologyToday,10:272，1989Grishok等,Cell,106:23-34,2001.Grosschedl和Baltimore,Cell,41:885,1985.Grunhaus和Horwitz,SeminarinVirology,3:237-252,1992.Harland和Weintraub，J.CellBiol,101(3):1094-1099,1985.Haslinger和Karin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:8572,1985.Hauber和Cullen，J.Virology,62:673,1988.Hen等，Nature,321:249，1986.Hensel等，LymphokineRes.，8:347,1989.He畫nat和Muzycska，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466-6470，1984.Herr和Clarke,Cell,45:461，1986.Hersdorffer等，DNACellBiol,9:713-723，1990.Herz和Gerard，Proc.NatlAcad.Sci.USA,90:2812-2816,1993.Hill等，Circulation,101:2863-2869,2000.Hirochika等，J.Virol,61:2599,1987.Hirsch等，MolCellBiol,10:1959，1990.Holbrook等，Virology,157:211，1987.Horlick和Benfield,MolCell.Biol，9:2396,1989.Horwich等.J.Virol，64:642-650,1990.Huang等，Cell,27:245，1981.Hug等，MolCell.Biol,8:3065，1988.Hutvagner等，PLoSBiol,2(4):E98，2004.Hwang等,MolCell.Biol,10:585,1990.Imagawa等，Cell,51:251，1987.Imbra和Karin,Nature,323:555,1986.lrnler等,Mol.CellBiol,7:2558,1987.Imperiale和Nevins，MolCell.Biol,4:875,1984.Ito和Roeder,TrendsEndocrinol.Metab.,12:127-134，2001.Jakobovits等，MolCell.Biol，8:2555,1988.Jameel和Siddiqui，MolCell.Biol，6:710,1986.Jaynes等，MolCell.Biol,8:62,1988.Joh歸n等,MolCellBiol,9:3393,1989.Jones和Shenk,Cell,13:181-188，1978.Kadesch和Berg,MolCell.Biol,6:2593,1986.Kaneda等，Science,243:375-378，1989.Karin等，Mol.Cell.Biol，7:606,1987.Karin等，Mol.Cell.Biol,7:606,1987.Karlsson等，EMBOJ.，5:2377-2385,1986.Katinka等,Cell,20:393，1980.Katinka等，Nature,290:720,1981.Kato等，J.BiolChem.,266:3361-3364，1991.Kawamoto等，Mol.CellBiol,8:267,1988.Kelly等，J.CellBiol，129(2):383-396,1995.Kiledjian等，Mol.CellBiol,8:145，1988.Kimura等，Dev.GrowthDiffer.39(3):257-265，1997.Kinugawa等，Circ.Res.,89:591-598，2001.Kinugawa等，J.Clin.EndocrinolMetab.,86:5089-5090,2001.Kiriazis和K腦ias,Annu.Rev.Physiol,62:321-351,2000.Klamut等,MolCellBiol,10:193，1990.Klein等，Nature,327:70-73,1987.Koch等，MolCellBiol，9:303，1989.Krek等，Nat.Genet"37:495-500,2005.Krek等，NatureGenetics,37:495-500,2005.Krenz和Robbins,J.Am.CollCardiol,44:2390-2397，2004.Kriegler和Botchan，《EukaryoticViralVectors》，Gluzman編,ColdSpringHarbor:ColdSpringHarborLaboratory,NY,1982.Kriegler和Botchan，MolCell.Biol,3:325,1983a.Kriegler等,Cell,38:483,1984.Kriegler等，Cell,53:45,1988.Kriegler等，《GeneExpression》，AlanLiss編,Hamer和Rosenberg,NewYork,1983b.Kmtzfeldt等，Nature,438:685-689，2005.Kuhl等，Cell，50:1057,1987.Kunz等，NuclAcidsRes"17:1121,1989.Lagos-Quintana等，Science,294(5543):853-858，2001.LaPointe等，Hypertension27(3Pt2):715-22,1996.LaPointe等，J.Biol.Chem.，263(19):9075-8,1988.Lavsen等，ProcNatl.Acad.SciUSA.，83:8283,1986.Laspia等，Cell,59:283，1989.Lai3mer等，Mol.Cell.Biol"10:760,1990.Lau等，Science,294(5543):858-862，2001.LeGalLaSalle等，Science,259:988-990,1993.Lee和Ambros,Science,294(5543):862-864，2001.Lee等，Nature,294:228，1981.Lee等，NucleicAcidsRes"12:4191-206,1984.Leung等,Proc.Natl.Acad.SciUSA,48:18125-18130，2006.Levi垂n等，Nature,295:79,1982.Levrero等，Gene,101:195-202，1991.Lin等,Mol.Cell.Biol"10:850,1990.Liu等，ProcNatlAcadSciUSA101:9740-9744,2004.Luria等，EMBOJ.,6:3307,1987.Lusky和Botchan,Proc.Natl.Acad.SciUSA,83:3609,1986.Lusky等，MolCell.Biol,3:1108，1983.Macejak和Sarnow，Nature,353:90-94，1991.Majors和Varmus，Proc.NatlAcad.SciUSA,80:5866，1983.Mann等，Cell,33:153-159,1983.Mansen等，MolEndocrinol,15:2106-2114,2001.Markowitz等，J.Virol,62:1120-1124，1988.McNeall等，Gene,76:81，1989.Meister和Tuschl，Nature,431:343-9,2004.Miksicek等，Cell,46:203，1986.Molkentin等，Cell93:215-228，1998.Mordacq和Linzer,GenesandDev.,3:760,1989.Moreau等，NuclAcidsRes.，9:6047,1981.Morkin,Microsc.Res.Tech.，50:522-531,2000.Moss等，Biol.Chem.，271(49):31688-31694,1996.Muesing等，Cell,48:691，1987.Naya等，JBiolChem,275(7):4545-4548，2000.Ng等，Nuc.AcidsRes.,17:601,1989.Nicolas和Rubinstein,《Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses》，Rodriguez和Denhardt(編)，Stoneham:Butterworth,494-513,1988.Nicolau和Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982.Nicolau等.，MethodsEnzymol.,149:157-176，1987.Ojamaa等.，Endocrinology,141:2139-2144,2000.Ondek等，EMBOJ，6:1017,1987.Ornitz等,Mol.Cell.Biol,7:3466,1987.Palmiter等，Nature,300:611,1982.Pantos等，Horm.Metab.Res.，38:308-313,2006.Park等，MolCell.,19:643-653，2005.Paskind等，Virology,67:242-248,1975.Pasquinelli和Ruvkun，Ann.Rev.CellDev.Biol"18:495-513,2002.Pavri等，Mol.Cell"18:83-%,2005.PCT7/^開文本W(wǎng)O0071096PCT公開文本W(wǎng)O84/03564PCT公開文本W(wǎng)O98/33791Pech等.,Mol.Cell.Biol，9:396，1989.Pelletier和Sonenberg,Nature,334(6180):320-325,1988.Perales等，Proc.Natl.Acad.SciUSA,91:4086-4090,1994.Perez-Stable和Constantini,MolCell.Biol，10:1116,1990.PhysiciansDeskReferencePicard和Schaffner，Nature,307:83,1984.Pinkert等，GenesandDev.,1:268,1987.Ponta等.，Proc.Natl.Acad.SciUSA,82:1020，1985.Porton等，Mol.Cell.Biol，10:1076，19%.Potter等,Proc.Natl.Acad.SciUSA,81:7161-7165,1984.Queen和Baltimore,Cell,35:741,1983.Quinn等.，Mol.Cell.Biol，9'A1U，1989.Racher等,BiotechnologyTechniques,9:169-174,1995.Ragot等，Nature,361:647-650,1993.Redondo等，Science,247:1225，1990.Reisman和Rotter,Mol.Cell.Biol，9:3571，1989.《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第15版，第1035-1038和1570-1580頁，MackPublishingCompany,Easton,PA，1980.Re謹(jǐn)，Radiother.Oncol,19:197-218，1990.ResendezJr.等，MolCell.Biol,8:4579,1988.Rich等，Hum.GeneTher.,4:461-476,1993.Ridgeway,《Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses》，Rodriguez等編，Stoneham:Butterworth，467-492，1988.Ripe等，Mol.Cell.Biol,9:2224,1989.Rippe,等，Mol.CellBiol，10:689-695,1990.Rittling等，Nuc.AcidsRes"17:1619,1989.Rosen等，Cell,41:813，1988.Rosenfeld等，Science,252:431-434,1991.Rosenfeld，等，Cell,68:143-155,1992.Roux等.，Proc.NatlAcad.SciUSA,86:9079-9083，1989.Sakai等,GenesandDev.,2:1144，1988.Sambrook和Russell，《MolecularCloning:ALaboratoryManual》第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001.Satake等，J.Virology,62:970,1988.Schaffner等,J.MolBiol，201:81，1988.Schuyler和Yarbrough,BasicRes.Cardiol，85:481-494，1990.Searle等，MolCell.Biol,5:1480,1985.Sempere等，GenomeBiol5:R13，2004.Sharp和Marciniak,Cell,59:229,1989.Shaul和Ben-Levy,EMBOJ.，6:1913,1987.Sherman等,MolCell.Biol,9:50,1989.Shingara等.,RNA11:1461-1470,2005.Sleigh和Lockett,JEMBO,4:3831,1985.Spalholz等，Cell,42:183,1985.Spandau和Lee，J.Virology,62:427，1988.Spandidos和Wilkie,EMBOJ.，2:1193，1983.Stephens和Hentschel,Biochem.J，248:1，1987.Stratford-Perricaudet和Perricaudet,《HumanGeneTransfer》,Cohen-Haguenauer和Boiron編,JohnLibbeyEurotext，F(xiàn)rance,51-61，1991.Stratford-Perricaudet等，Hum.Gene.Ther"1:241-256,1990.Stuart等,Nature,317:828，1985.Sullivan和Peterlin,MolCell.Biol，7:3315，1987.Swartzendmber和Lehman,J.Cell.Physiology,85:179,1975.Takebe等,MolCell.Biol，8:466,1988.Tavemier等，Nature,301:634，1983.Taylor和Kingston,MolCell.Biol,10:165,1990a.Taylor和Kingston，Mol.Cell.Biol,10:176,1990b.Taylor等，J.Biol.Chem.，264:15160,1989.Temin，《GeneTransfer》，Kucherlapati編，NY，PlenumPress,149-188，1986.TheMerckIndex,第8版Thiesen等，J.Virology,62:614,1988.Top等,J.Infect.Dis.,124:155-160,1971.Treisman,Cell，46(4):567-174,1986Tranche等.，MolBiol.Med.,7:173，1990.Tranche等，Mol.CellBiol,9(ll):4759-4766,1989.Trudel和Constantini，GenesandDev.,6:954,1987.Tsika等，Am.J.PhysiolCellPhysiol,283:C1761-C1775，2002.Tur-Kaspa等，MolCellBiol，6:716-718,1986.Tyndell等，Nuc.Acids.Res.，9:6231,1981.Vadaszova等，Physiol.Res.53(1):S57-61，2004.vanRooij等，Proc.NatlAcad.SciUSA,103(48):18255-18260,2006.Vannice和Levinson，J.Virology,62:1305，1988.Va匪s等,Cell,25:23-36,1981.Vasseur等，ProcNatl.Acad.SciUSA,77:1068,1980.Wagner等，Proc.NatlAcad.SciUSA87(9):3410匿3414,1990.Wang和Calame,Cell,47:241,1986.Weber等，Cell,36:983，1984.Wei等，J.EndocrinolInvest"28:8-11，2005.Weinberger等MolCell.Biol,8:988,1984.Winoto和Baltimore，Cell,59:649，1989.Wong等，Gene,10:87-94，1980.Wu和Wu,Adv.DrugDeliveryRev.，12:159-167,1993.Wu和Wu,Biochemistry,27:887-892，1988.Wu和Wu，J.BiolChem.,262:4429-4432,1987.Xu等，CumBiol,13:790-795,2003.Yamauchi-Takihara等，Proc.Natl.Acad.SciUSA,86(10):3504-3508,1989.Yang和Russell，Proc.NatlAcad.SciUSA,87:4144-4148，1990.Yao和Eghbali,Circ.Res.71:831-839,1992.Young等，《HandbookofAppliedTherapeutics》，7.1-7.12和9.1-9.10,1989.Yutzey等Mol.Cell.Biol,9:1397,1989.Zelenin等，F(xiàn)EBSLett.，287(1-2):118-120，1991.Zeng等，CancerRes"62(13):3630-3635,2002.Ziober和Kramer，J.Bio.Chem.，271(37):22915-22,1996.權(quán)利要求1.治療病理性心臟肥大或心力衰竭的方法，包括(a)鑒定具有心臟肥大、心力衰竭、或心肌梗死后重塑的患者；并(b)抑制所述患者心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。2.權(quán)利要求l的方法，其中抑制包括給所述患者施用miR-208的antagomir。3.權(quán)利要求2的方法，其中施用包括靜脈內(nèi)施用或直接注射入心臟組織。4.權(quán)利要求2的方法，其中施用包括口服、經(jīng)皮、持續(xù)釋放、受控釋放、延遲釋放、栓劑、或舌下施用所述miR-208的antagomir。5.權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括給所述患者施用第二心臟肥大療法。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第二療法選自卩阻滯劑、肌力藥(ionotr叩e)、利尿藥、ACE-I、AII拮抗劑、BNP、0&++-阻滯劑、內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑、或HDAC抑制劑。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述第二療法與miR-208的抑制同時施用。8.權(quán)利要求5的方法，其中所述第二療法在miR-208的抑制之前或之后施用。9.權(quán)利要求l的方法，其中治療包括改善病理性心臟肥大或心力衰竭的一種或多種癥狀。10.權(quán)利要求l的方法，其中治療包括延遲從心臟肥大到心力衰竭的轉(zhuǎn)化。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種改善的癥狀包括升高的運(yùn)動能力、升高的心臟射血體積、降低的左心室舒張末期壓、降低的肺毛細(xì)血管楔壓、升高的心排血量、或心排血指數(shù)、降低的肺動脈壓、降低的左心室收縮和舒張末期內(nèi)徑、降低的左右心室壁壓、降低的管壁張力、提高的生活質(zhì)量、及降低的疾病相關(guān)發(fā)病率或死亡率。12.預(yù)防病理性肥大或心力衰竭的方法，包括(a)鑒定有風(fēng)險發(fā)生病理性心臟肥大或心力衰竭的患者；并(b)抑制所述患者的心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。13.權(quán)利要求12的方法，其中抑制包括給所述患者施用miR-208的antagomir。14.權(quán)利要求13的方法，其中施用包括靜脈內(nèi)施用或直接注射入心臟組織。15.權(quán)利要求13的方法，其中施用包括口服、經(jīng)皮、持續(xù)釋放、受控釋放、延遲釋放、栓劑、或舌下施用miR-208。16.權(quán)利要求12的方法，其中有風(fēng)險的患者可表現(xiàn)包括下述的一系列風(fēng)險因子中的一種或多種長期不受控制的高血壓、未矯正的瓣膜病、慢性咽峽炎、新近的心肌梗死、心臟病的先天素因或病理性肥大。17.權(quán)利要求12的方法，其中有風(fēng)險的患者可被診斷為具有心臟肥大的遺傳素因。18.權(quán)利要求12的方法，其中有風(fēng)險的患者可具有心臟肥大的家族史。19.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其細(xì)胞未表達(dá)功能性miR-208。20.權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中所述哺乳動物是小鼠。21.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其細(xì)胞包含在異源啟動子控制下的miR-208編碼22.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中所述哺乳動物是小鼠。23.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中所述啟動子是組織特異性啟動子。24.權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中所述組織特異性啟動子是肌肉特異性啟動子。25.權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中所述組織特異性啟動子是心臟肌肉特異性啟動子。26.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物細(xì)胞，其缺乏一個或兩個天然miR-208等位基因。27.權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞缺乏兩個所述天然miR-208等位基因。28.治療心肌梗死的方法，包括抑制所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。29.預(yù)防心臟肥大和擴(kuò)張型心肌病的方法，包括抑制所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。30.抑制心臟肥大進(jìn)展的方法，包括抑制所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。31.提高患有心力衰竭或心臟肥大的受試者中的運(yùn)動耐量的方法，包括抑制所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。32.減少患有心力衰竭或心臟肥大的受試者的入院治療的方法，包括抑制所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。33.改善患有心力衰竭或心臟肥大的受試者的生活質(zhì)量的方法，包括抑制所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。34.降低患有心力衰竭或心臟肥大的受試者的發(fā)病率的方法，包括抑制所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。35.降低患有心力衰竭或心臟肥大的受試者的死亡率的方法，包括抑制所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-208的表達(dá)或活性。36.在受試者中治療或預(yù)防肌肉骨骼病癥的方法，包括(a)鑒定患有肌肉骨骼病癥衰竭或有肌肉骨骼病癥衰竭風(fēng)險的患者；并(b)提高所述患者的骨骼肌細(xì)胞中miR-208的表達(dá)和/或活性。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述病癥選自失用性萎縮、應(yīng)答抗重力的肌肉消耗和失神經(jīng)支配。38.權(quán)利要求36的方法，其中提高miR-208的表達(dá)和/或活性包括給所述受試者施用miR-208。39.權(quán)利要求36的方法，其中提高miR-208的表達(dá)和/或活性包括給所述受試者施用表達(dá)miR-208的表達(dá)載體。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述表達(dá)載體是病毒表達(dá)載體。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒表達(dá)載體是腺病毒表達(dá)載體。42.權(quán)利要求39的方法，其中所述表達(dá)載體是非病毒表達(dá)載體。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述非病毒表達(dá)載體被包含在脂質(zhì)媒介內(nèi)。44.權(quán)利要求38的方法，其中miR-208被包含在脂質(zhì)媒介內(nèi)。45.權(quán)利要求36的方法，進(jìn)一步包括非miR-208療法。46.鑒定miR-208的調(diào)控劑的方法，包括(a)使細(xì)胞接觸候選化合物；(b)評估m(xù)iRJOS活性或表達(dá)；并(c)比較步驟(b)中的活性或表達(dá)與不存在候選化合物時的活性或表達(dá)，其中測得的活性或表達(dá)之間的差異指示該候選化合物是miR-208的調(diào)控劑。47.權(quán)利要求46的方法，其中在體外使細(xì)胞接觸候選化合物。48.權(quán)利要求46的方法，其中在體內(nèi)使細(xì)胞接觸候選化合物。49.權(quán)利要求46的方法，其中miR-208的調(diào)控劑是miR-208的激動劑。50.權(quán)利要求46的方法，其中miR-208的調(diào)控劑是miR-208的拮抗劑。51.權(quán)利要求46的方法，其中候選化合物是肽、多肽、多核苦酸、或小分子。52.權(quán)利要求46的方法，其中評估m(xù)iR-208活性或表達(dá)包括評估m(xù)iR-208的表達(dá)。53.權(quán)利要求52的方法，其中評估m(xù)iR-208的表達(dá)包括Northern印跡或RT-PCR。54.權(quán)利要求46的方法，其中評估m(xù)iR-208活性或表達(dá)包括評估m(xù)iR-208的活性。55.權(quán)利要求54的方法，其中評估m(xù)iR-208的活性包括評估受miR-208調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)或活性。56.權(quán)利要求55的方法，其中受miR-208調(diào)節(jié)的基因是(3-肌球蛋白重鏈。57.權(quán)利要求55的方法，其中受miR-208調(diào)節(jié)的基因是快速骨骼肌蛋白質(zhì)基因。58.權(quán)利要求57的方法，其中快速骨骼肌蛋白質(zhì)基因是心臟肌4丐蛋白I、肌鈣蛋白T3、肌球蛋白輕鏈、或a骨骼肌動蛋白。59.權(quán)利要求54的方法，其中評估m(xù)iR-208的活性包括評估a-肌球蛋白重鏈表達(dá)水平對(3-肌球蛋白重鏈表達(dá)水平的比率。60.藥物組合物，其包含miR-208功能或表達(dá)的抑制劑。61.權(quán)利要求60的藥物組合物，其中所述抑制劑是與miR-208具有同源性的核酸。62.治療病理性心臟肥大或心力衰竭的方法，包括(a)鑒定患有心臟肥大或心力衰竭的患者；并(b)給所述患者施用miRJ08抑制劑。63.在所述患者中預(yù)防肌肉纖維化的方法，包括(a)鑒定有病理性肌肉纖維化的風(fēng)險的患者；并(b)給患者施用miRJOS抑制劑。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述病理性纖維化是肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、心臟纖維化或糖尿病纖維化。65.治療月幾肉骨骼病癥的方法，包括(a)鑒定患有肌肉骨骼病癥或有風(fēng)險發(fā)生肌肉骨骼病癥的患者；并(b)給所述患者施用miRJOS激動劑。全文摘要本發(fā)明涉及誘導(dǎo)β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)表達(dá)且遏制快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的微RNA，miR-208的鑒定。對此功能的抑制被建議作為心臟纖維化、肥大和/或心力衰竭的治療方法，而且對此功能的提升可用于在肌肉骨骼病癥的治療中遏制慢速纖維基因和激活快速纖維基因。文檔編號A61K48/00GK101522222SQ200780036783公開日2009年9月2日申請日期2007年7月31日優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日發(fā)明者伊娃·范魯伊杰,埃里克·奧爾森申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)董事會