專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水產(chǎn)品中主要過(guò)敏原的快速免疫磁珠層析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食物過(guò)敏原的檢測(cè)方法，特別是涉及一種檢測(cè)水產(chǎn)品中主要過(guò)敏 原的免疫磁珠層析方法，該方法主要是使用甲殼類(lèi)和貝類(lèi)的主要過(guò)敏原原肌球蛋白 (Tropomyosin，簡(jiǎn)稱(chēng)Tm)、魚(yú)類(lèi)主要過(guò)敏原小清蛋白(Parvalbumin，簡(jiǎn)稱(chēng)Pa)的免疫磁珠層 析檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
食物過(guò)敏是由食物引起的機(jī)體對(duì)免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)，近幾十年來(lái)，世界范圍內(nèi) 食物過(guò)敏反應(yīng)癥患者呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，據(jù)WHO報(bào)道，到2010年，全球可能有40%到50% 的人患有過(guò)敏癥，食物過(guò)敏現(xiàn)已成為一個(gè)新興的食品安全問(wèn)題。食物過(guò)敏原為食物中引發(fā) 或激起過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)，通常是在特定食物中含有的含量豐富、天然存在的蛋白質(zhì)。根據(jù)過(guò) 敏原反應(yīng)的速度、機(jī)制及臨床特點(diǎn)將致敏機(jī)制分為I型、II型、III型、IV型，其中大部分食物 過(guò)敏是由IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，一般癥狀包括嘔吐、腹痛、腹瀉等，也包括皮膚反應(yīng)及呼 吸道癥狀，嚴(yán)重情況下甚至?xí)霈F(xiàn)過(guò)敏性休克或死亡，目前尚無(wú)有效的治療方法。為了保 護(hù)易感者健康，部分國(guó)家和地區(qū)對(duì)食物過(guò)敏原的標(biāo)簽標(biāo)注進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定并列入了立法范 圍。魚(yú)類(lèi)和甲殼類(lèi)水產(chǎn)品及其制品是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織公認(rèn)的兩類(lèi)易引起食物過(guò)敏的 主要致敏食物。據(jù)調(diào)查，在我國(guó)15 M歲年齡段人群中，約6%的人有過(guò)食物過(guò)敏的經(jīng) 歷，在我國(guó)青少年過(guò)敏人群中對(duì)魚(yú)類(lèi)等海產(chǎn)品過(guò)敏的約占3-6%，位居其它致敏食物的首 位。水產(chǎn)品的主要過(guò)敏原可分為兩大類(lèi)，一為貝類(lèi)及蝦蟹等甲殼類(lèi)動(dòng)物中的原肌球蛋白 (Tropomyosin)，另外一種則是鱈魚(yú)等魚(yú)類(lèi)中的小清蛋白(Parvalbumin)。由于食物成分的 復(fù)雜性，加之食品加工過(guò)程中使用各種配料和添加劑，傳統(tǒng)的化學(xué)分析很難滿(mǎn)足食物過(guò)敏 原的檢測(cè)要求，因此，食物過(guò)敏原的快速檢測(cè)技術(shù)研究一直是國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的研究熱點(diǎn)。目前，食物過(guò)敏原的檢測(cè)技術(shù)以分析全蛋白或酶解后肽段氨基酸序列的質(zhì)譜技 術(shù)、檢測(cè)編碼過(guò)敏原DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù) 及分析過(guò)敏原性的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)為代表。質(zhì)譜技術(shù)能精確測(cè)定全蛋白或酶解后肽段的氨基酸序列，再根據(jù)相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)確 定致敏蛋白，但是質(zhì)譜技術(shù)存在著費(fèi)時(shí)、所用儀器昂貴、檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較高等缺點(diǎn)。PCR方法則在檢測(cè)過(guò)程中易因操作不當(dāng)受到污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，存在操作要 求技術(shù)性強(qiáng)、不能反映食物的真正過(guò)敏性即人們攝入該食物后會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)等缺陷。食物過(guò)敏原的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、生物傳感器法和免疫 層析法。其中ELISA法是目前技術(shù)較為成熟的方法，市場(chǎng)上已有杏仁、大豆、花生、甲殼類(lèi)、 芝麻、芥末、羽扇豆、牛奶等食物過(guò)敏原的ELISA檢測(cè)試劑盒，這些試劑盒可在30 60min 中內(nèi)實(shí)現(xiàn)定性或半定量檢測(cè)，但是存在假陽(yáng)性和假陰性反應(yīng)。此外，公開(kāi)號(hào)CN101285840A 專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了一種食品中過(guò)敏原的固相免疫檢測(cè)方法，采用可拆式酶標(biāo)板作為檢測(cè)載 體，利用雙抗夾心模式，直接在過(guò)敏原特異性單抗上標(biāo)記酶，再通過(guò)底物顯色反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該方法檢測(cè)原理同ELISA法，與雙抗夾心ELISA的唯一區(qū)別是不需要使用酶標(biāo)二抗。因 此雖然具有多樣本同時(shí)檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)，但也存在著假陰性或假陽(yáng)性反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果易于受到外 界因素的影響(如食品基質(zhì)，食品的加工程度等)等缺點(diǎn)。生物傳感器法是根據(jù)待測(cè)物質(zhì)和分子識(shí)別元件特異性結(jié)合，發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)， 產(chǎn)生的生物學(xué)信息通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為可以定量處理的電、光等信息，再經(jīng)儀表放大和 輸出，從而達(dá)到分析和檢測(cè)的目的。目前，微型SI^R生物檢測(cè)器已應(yīng)用于食品生產(chǎn)過(guò)程中花 生過(guò)敏原的檢測(cè)，該檢測(cè)器可實(shí)現(xiàn)在線定量檢測(cè)。但是生物傳感器法需要特定的設(shè)備和配 件，檢測(cè)成本高，對(duì)硬件設(shè)施要求極高。食品工業(yè)界需要的是快速、簡(jiǎn)便、高效、特異性強(qiáng)且 成本低廉的檢測(cè)方法，上述這些方法皆無(wú)法滿(mǎn)足食品工業(yè)界的需求。免疫層析技術(shù)是ELISA技術(shù)原理的擴(kuò)展應(yīng)用，一般使用乳膠顆粒、膠體硒、膠體金 以及脂質(zhì)體等作為著色標(biāo)記物。在層析時(shí)，標(biāo)記物與待測(cè)物之間形成的復(fù)合物可被相應(yīng)的 配體所捕獲而聚集于硝化纖維膜上的檢測(cè)線并呈現(xiàn)出標(biāo)記物所帶有的顏色，因此可以通過(guò) 纖維膜上顯色條的有無(wú)、顏色深淺和反射光線等從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的，具有操作簡(jiǎn)便、快速的 優(yōu)點(diǎn)。在目前公開(kāi)的報(bào)道中，大都以膠體金作為指示劑，因此又被稱(chēng)為膠體金檢測(cè)法。已公 開(kāi)文獻(xiàn)中涉及了一種檢測(cè)水產(chǎn)品食物過(guò)敏的免疫膠體金層析方法，可以實(shí)現(xiàn)過(guò)敏原的定性 檢測(cè)，但是難以進(jìn)行定量檢測(cè)，而且目視檢測(cè)使檢測(cè)結(jié)果不易記錄和保存。此外，在免疫層析檢測(cè)技術(shù)中，除了采用膠體金作為標(biāo)記物外，也有采用其它標(biāo)記 物作為指示劑的報(bào)道。專(zhuān)利號(hào)為US5753517的專(zhuān)利公開(kāi)了一種使用乳膠顆粒作為標(biāo)記物的 定量免疫層析方法和儀器。公開(kāi)號(hào)CN1480391A的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了一種在常溫下制備膠體 納米硒顆粒及其以此材料作為標(biāo)記物的免疫層析檢測(cè)方法，獲得了高于膠體金方法的靈敏 度的檢測(cè)方法。公開(kāi)號(hào)CN1645146A公開(kāi)了一種用熒光稀土納米顆粒作為標(biāo)記物的免疫層 析方法及其檢測(cè)試紙條，可用于定量的新型免疫層析檢測(cè)。近些年，以磁性納米顆粒作為標(biāo)記物的免疫層析檢測(cè)報(bào)道也陸續(xù)出現(xiàn)。如
發(fā)明者盧瑛, 王錫昌, 石良, 鄭誠(chéng) 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)