本發(fā)明具體涉及一種青枯雷爾氏菌菌株。
背景技術(shù)：
青枯雷爾氏菌(ralstoniasolanacearum)是一種具有破壞性的土傳性植物病原菌，地理分布廣泛，寄主范圍廣，從單子葉植物到雙子葉植物，從喬木到灌木，可侵染50多個(gè)科的200多種植物，包括重要的經(jīng)濟(jì)作物如番茄，馬鈴薯等。該病原菌從寄主植物的根部，入侵木質(zhì)部導(dǎo)管，通過維管束系統(tǒng)迅速擴(kuò)張到植物的地上部分，大量定殖引起導(dǎo)管功能喪失，引發(fā)植物萎蔫，導(dǎo)致植物死亡。青枯雷爾氏菌是造成農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)損失第二嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，常用的防治方法為農(nóng)用鏈霉素，效果不好并給環(huán)境造成污染，病菌易產(chǎn)生耐藥性而不能最終控制青枯病的發(fā)生，因此生防技術(shù)的研究和開發(fā)成為目前防治青枯病的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
青枯雷爾氏菌的致病性機(jī)制較復(fù)雜，在寄主植物細(xì)胞存在的情況下，青枯雷爾氏菌激活細(xì)胞壁降解酶、過敏反應(yīng)以及由ⅲ型分泌系統(tǒng)組分編碼的致病基因，其一旦進(jìn)入植物組織中，高密度青枯雷爾氏菌大量表達(dá)毒力因子、胞外蛋白以及主要致病決定因子。為了避免經(jīng)濟(jì)作物因遭受青枯雷爾氏菌侵染而導(dǎo)致萎蔫或枯死的現(xiàn)象，從業(yè)人員一直在致力于對(duì)青枯雷爾氏菌的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，在于提供一種青枯雷爾氏菌菌株。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種青枯雷爾氏菌菌株，所述菌株為青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199(ralstoniasolanacearum)，于2016年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.11995。
進(jìn)一步地，所述青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199(ralstoniasolanacearum)的phca基因含有一個(gè)插入序列，所述插入序列如seqidno：5所示。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：提供了一種無致病力的青枯雷爾氏菌菌株，為防治因青枯雷爾氏菌的致病性而造成的植株萎蔫或死亡的生物防治提供可能植物疫苗。
具體實(shí)施方式
一種無致病力的青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199是從福建省南平市建甌市番茄病株植株莖部分離并篩選得到的菌株。
1、菌株fjat-15199的分離：
(1)稱取發(fā)病初期番茄的莖部5g并用清水沖洗干凈，且將沖洗后的莖部剪成小塊組織；接著在無菌操作條件下，將小塊組織依次采用70％酒精處理30s，10％次氯酸鈉消毒10min，無菌水漂洗3遍；之后采用榨汁機(jī)將小塊組織打碎以獲得組織液，然后吸取1ml組織液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7；
(2)取上述各稀釋液100μl涂布于ttc培養(yǎng)基平板上，然后將ttc培養(yǎng)基平板置于28℃下培養(yǎng)3d；
(3)將步驟(2)培養(yǎng)獲得的菌株重新劃線接種于ttc培養(yǎng)基上，并將ttc培養(yǎng)基置于28℃條件下培養(yǎng)72h，獲得青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199。
2.青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的鑒定：
初步鑒定：
將上述所獲得的菌株的菌落置于leicam165fc高級(jí)電動(dòng)熒光體視顯微鏡下進(jìn)行鏡檢觀察，觀察結(jié)果顯示，菌落形態(tài)為表面較干燥，無流動(dòng)性，中間為暗紅色，且白邊較窄的菌株，因此，可初步認(rèn)定為青枯雷爾氏菌。
進(jìn)一步鑒定：
(1)菌株活化：用接種環(huán)將所獲得青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199劃線于ttc培養(yǎng)基上，并將ttc培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h，培養(yǎng)溫度為30℃；
(2)制備種子液：將步驟(1)所獲得的單菌落接種于20ml的種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)24h，恒溫振蕩搖床的溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為170rpm/min；
(3)基因組dna的提?。喝〔襟E(2)所獲得的種子液1ml于已滅菌的1.5ml離心管中，并按照promega試劑盒說明書操作以提取青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的基因組dna；
(4)青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的16s鑒定：用原核生物通用引物27f：agagtttgatcmtggctcag(如seqidno：1所示)和1492r：tacggytaccttgttacgactt(如seqidno：2所示)擴(kuò)增后，將pcr產(chǎn)物測序，通過blast分析，確認(rèn)菌株fjat-15199為青枯雷爾氏菌。
pcr反應(yīng)體系(25μl總體積)如下：
反應(yīng)程序如下：
(5)pcr鑒定：采用青枯雷爾氏菌的特異性引物phcaf：ggtacgacaacgagtgggg(如seqidno：3所示)和引物phcar：gtaatcgagcggaatcagc(如seqidno：4所示)為引物對(duì)，青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的基因組dna為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，并以現(xiàn)有公認(rèn)的青枯雷爾氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株gmi1000為陽性對(duì)照；
pcr反應(yīng)體系(25μl總體積)如下：
反應(yīng)程序如下：
上述pcr反應(yīng)結(jié)束后，采用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr反應(yīng)的產(chǎn)物，上樣量為6μl，電壓為100v，電泳時(shí)間50min，并用uvp凝膠成像儀進(jìn)行檢測；檢測結(jié)果表明，青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的phca基因比青枯雷爾氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株gmi1000大，通過測序分析，青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的phca基因插入了一個(gè)is序列，序列如seqidno：5所示。
3.青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的致病性鑒定：
(a)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)組中，制備青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的菌液，以107cfu/ml的接菌量，并采用剪葉的方式處理每株番茄苗(番茄苗的生長狀態(tài)為5-6葉期)，共接種番茄苗20株，每株苗分別處理3個(gè)刀口；而陰性對(duì)照組以清水代替青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的菌液；陽性對(duì)照組以現(xiàn)有強(qiáng)致病性青枯雷爾氏菌fjat-91的菌液代替青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的菌液；然后將各組處理后的番茄苗放置于溫度30℃、濕度保持在70％恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并早晚進(jìn)行澆水，每天統(tǒng)計(jì)各組番茄苗死亡率，共觀察5d；
(b)分別取步驟(a)中存活番茄植株的根部、莖基部、莖部和葉片少許，其中根部取5mm，并在中部切斷；莖基部以橫切的方式，每段長度為3mm；莖部的處理同莖基部的一樣；葉片剪至3mm2大小；將處理后的根部、莖基部、莖部和葉片分別先在75％乙醇處理30s后，放入10％次氯酸鈉消毒8min，接著采用無菌水漂洗3次，從而完成根部、莖基部、莖部和葉片的表面消毒；然后將表面消毒后的根部、莖基部、莖部和葉片分別放入ttc培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
(c)將步驟(b)培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接到新鮮的ttc培養(yǎng)基進(jìn)行劃線培養(yǎng)，并觀察菌落形態(tài)；
(d)將陰性對(duì)照組與陽性對(duì)照組同樣進(jìn)行步驟(b)、(c)處理。
(2)致病性鑒定結(jié)果
其中，步驟(a)的觀察結(jié)果如表1所示，即強(qiáng)致病性青枯雷爾氏菌菌株fjat-91在剪葉接種1-3d內(nèi)不發(fā)病，接種5d后發(fā)病率達(dá)到75.40％，植株萎蔫，死亡；本發(fā)明青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199在剪葉接種1-5d內(nèi)植株均不發(fā)?。魂幮詫?duì)照組即以清水進(jìn)行剪葉處理的植株在1-5d內(nèi)均不發(fā)病。
表1各組剪葉接種番茄發(fā)病情況
為了驗(yàn)證通過剪葉方式接種的菌株是否進(jìn)入到番茄植株內(nèi)，本申請人進(jìn)行了步驟(b)、步驟(c)的操作，步驟(c)的觀察結(jié)果顯示，經(jīng)過步驟(b)、步驟(c)處理后分離得到的菌株在ttc培養(yǎng)基上的形態(tài)與接菌前菌株的形態(tài)一致，表明通過剪葉方式接種的菌株確實(shí)進(jìn)入到番茄植株內(nèi)。
青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的菌液接入番茄植株內(nèi)并未導(dǎo)致番茄植株死亡，即本發(fā)明的青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199無致病性，為研究避免因青枯雷爾氏菌的致病性而造成的植株萎蔫或死亡的現(xiàn)象提供了可能。
sequencelisting
<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所
<120>一種青枯雷爾氏菌菌株
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<213>人工序列
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<211>2032
<212>dna
<213>青枯雷爾氏菌菌株fjat-15199的is序列（ralstoniasolanacearum）
<400>5
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