本發(fā)明屬于生物醫(yī)學
技術領域：
，具體涉及一種樹鼩肝細胞永生化細胞系及其構建方法與應用。
背景技術：
：樹鼩(treeshrew，tupaiabelangeri)是一種生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)的哺乳綱攀鼩類的小型動物，形態(tài)酷似松鼠，是靈長類動物的近親。由于樹鼩具有體型小，經(jīng)濟易得，易馴養(yǎng)，繁殖能力強，飼養(yǎng)管理成本低、對人類病毒易感等優(yōu)點，常常用于替代或減少一些非人靈長類動物的使用，所以很早就被用作靈長類目(包括人類)的疾病動物模型。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、腫瘤等疾病的研究中得到廣泛的應用。肝臟疾病是一種嚴重危害人類健康的疾病，合適的動物模型仍然為許多藥物篩選和疫苗開發(fā)所急需。相對于小鼠、大鼠等嚙齒類動物，樹鼩是一種與靈長類親緣關系更為接近的小型動物，因此具有其獨特的應用價值，樹鼩肝細胞具備了與人肝細胞很多相似的特點。然而，肝臟是一種處于分化末端的器官，即使經(jīng)過較為費時費力的操作獲得原代肝細胞，細胞在體外培養(yǎng)數(shù)天后就會死亡，很難進行耗時較長的基因導入或基因編輯等實驗研究。若可以將樹鼩肝細胞永生化，使其具有了無限增殖潛能，不僅能為細胞生物學的研究提供性狀穩(wěn)定、源源不斷的樹鼩肝細胞模型，在嗜肝病毒的研究、肝細胞移植、基因治療、生物人工肝以及藥理、毒理學等研究方面也具有潛在的應用價值。由于目前還沒有建立樹鼩永生化肝細胞系的先例，因此本研究以建立永生化樹鼩肝細胞系為目的，通過向體外樹鼩原代肝細胞導入外源性基因，成功建立了樹鼩肝細胞永生化的方法。樹鼩永生化細胞系的建立不僅為樹鼩動物肝病模型的優(yōu)化提供了一種更為穩(wěn)定的體外預實驗分析系統(tǒng)，減少了實驗動物的使用量，有利于樹鼩動物模型的推廣。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術的不足，提供了一株永生化樹鼩肝細胞系ith6.1及其構建方法，用本方法可穩(wěn)定獲得永生化的樹鼩肝細胞系。本發(fā)明的ith6.1永生化樹鼩肝細胞系可連續(xù)傳代100次后，仍然保持二倍體核型，具備極強的增殖能力，真正實現(xiàn)了永生化。該細胞有著較強的增殖能力，進一步對ith6.1進行蛋白表達、生化指標等特性分析，結果顯示了ith6.1具有典型的樹鼩肝細胞特性。同時致瘤性實驗等安全性檢測也提示了該細胞系具有較好的生物安全性。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：樹鼩肝細胞永生化細胞系，該細胞系命名為ith6.1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心建株，保藏號為cctccno:c201740，保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學。上述樹鼩肝細胞永生化細胞系的構建方法，包括以下步驟：步驟(1)，含sv40tag基因的重組慢病毒的獲得：將表達sv40tag蛋白的慢病毒表達質粒和包裝質粒共轉染293t細胞，包裝出含sv40tag基因的重組慢病毒；步驟(2)，慢病毒感染：在pth貼壁培養(yǎng)基中將樹鼩原代肝細胞培養(yǎng)至其貼壁后，更換為pth維持培養(yǎng)基，以樹鼩原代肝細胞開始培養(yǎng)時計，24h后按照moi＝2的比例接種步驟(1)得到的含sv40tag基因的重組慢病毒，24小時后更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，得到ith6細胞；步驟(3)，傳代：當步驟(2)培養(yǎng)得到的ith6細胞接近匯片時進行傳代，將ith6單細胞懸液計數(shù)后按5×104個細胞/cm2的接種密度接種至包被了鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，用完全培養(yǎng)基于37℃、5％co2孵箱中靜置培養(yǎng)3-5天，經(jīng)有限稀釋法挑選單克隆細胞株后，得到樹鼩肝細胞永生化細胞系ith6.1；其中所述的pth貼壁培養(yǎng)基包含如下組分：以1號灌流液為溶劑，ii型膠原酶50mg/l、iv膠原酶50mg/l、質量濃度為17％氯化鈣水溶液1ml/l；所述的1號灌流液包含如下組分：氯化鈉160.8mmol/l、氯化鉀3.15mmol/l、磷酸氫二鈉0.7mmol/l、hepes33mmol/l。進一步，優(yōu)選的是，所述的pth維持培養(yǎng)基包含如下組分：williamse培養(yǎng)基95％(v/v)，insulin-transferrin-seleniumsupplement(100×)1％(v/v)，glutamaxtm-i(100×)1％(v/v)，humanegf10ng/ml(m/v)，humanhgf10ng/ml(m/v)，地塞米松40ng/ml(m/v)，氫化可的松20ug/ml(m/v)，dmso0.2％(v/v)，胰島素30ug/ml，青霉素/鏈霉素雙抗溶液1％(v/v)。進一步，優(yōu)選的是，所述的完全培養(yǎng)液包含如下組分：胎牛血清10％(v/v)，青霉素/鏈霉素雙抗溶液1％(v/v)，dmem培養(yǎng)基89％(v/v)。進一步，優(yōu)選的是，包被了鼠尾膠原的培養(yǎng)皿的制備方法是將濃度為50ug/ml大鼠鼠尾i型膠原包被液加入細胞培養(yǎng)皿中，使得加入包被液的量剛好覆蓋細胞培養(yǎng)皿的底部，之后在細胞超凈臺內放置1小時后，吸走包被液，晾干，再用pbs洗細胞培養(yǎng)皿兩遍后，將細胞培養(yǎng)皿再次晾干；最后用封口膜將細胞培養(yǎng)皿再封好，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆茫黄渲?，所述的濃度?0ug/ml大鼠鼠尾i型膠原包被液包含如下組分：乙酸0.02mol/l、大鼠鼠尾i型膠原50ug/ml，溶劑為0.22um過濾器過濾除菌的離子水。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其有益效果為：1.建立了一種高效建立樹鼩永生化肝細胞的方法，通過攜sv40tag基因(gi:443428122)的重組慢病毒感染樹鼩原代肝細胞后，成功建立了永生化樹鼩肝細胞系ith6。用有限稀釋法，成功挑選到ith6的一株亞克隆細胞ith6.1，具有良好的增殖能力，迄今已在體外成功傳代超過100次，依然保留著良好的增殖特性和細胞狀態(tài)。應用本發(fā)明方法所建立的永生化樹鼩肝細胞系可以方便，快速的獲得大量具有二倍體核型的樹鼩肝細胞。2.染色體分析結果顯示其染色體數(shù)目為62條與中緬樹鼩相符，證實了ith6.1是樹鼩來源的細胞系。通過rt-pcr檢測到了ck18、alb等一系列標志性肝細胞功能基因在ith6.1中的表達，證實了ith6.1的肝細胞屬性。3.在此之前，由于沒有永生化的樹鼩細胞系，很多細胞水平的實驗都不方便開展，只能直接開展動物實驗，這對樹鼩動物資源是種很大的浪費，ith6.1樹鼩肝細胞系的成功建立，為樹鼩動物實驗開展之前，提供了開展細胞水平實驗的條件，根據(jù)得出的有效的數(shù)據(jù)后再開展動物實驗，有利于樹鼩動物福利的實現(xiàn)。此外，ith6.1樹鼩肝細胞系的成功建立，提供了方便的基因獲取方式，不需要再處死樹鼩，使得實驗室對一些樹鼩基因的獲得比以往方便很多，有利于樹鼩資源的推廣，對樹鼩試劑的研究，各種樹鼩實驗資料的完善起到推動作用。4.ith6.1的建立成功，也為其他樹鼩細胞系的建立，提供了很好的借鑒，有利于改善目前樹鼩細胞系匱乏的研究現(xiàn)狀，有利于樹鼩資源的推廣使用。并且，隨著對ith6.1的深入研究，它更多的潛在利用價值也將日益被挖掘。由于樹鼩和靈長類動物具有更近的親緣關系，樹鼩肝細胞具備了與人肝細胞很多相似的特點，樹鼩永生化細胞系的建立不但減少了實驗動物的使用量，提供了一種更為穩(wěn)定的實驗研究對象，同時也將為樹鼩動物肝病模型的優(yōu)化提供更為方便快捷的體外預分析系統(tǒng)。附圖說明圖1是ith6細胞在顯微鏡下的形態(tài)觀察結果。ia(bar＝100um)中顯示的是樹鼩原代肝細胞剛接種入細胞培養(yǎng)皿，細胞呈圓形，透亮，可見大核，狀態(tài)良好；ib(bar＝100um)為接種后4h，細胞已基本貼壁，開始在培養(yǎng)皿上生長。iia(bar＝100um)和iib(bar＝200um)顯示的是樹鼩原代肝細胞接種后24h的細胞生長情況，細胞呈上皮細胞樣生長，扁平的細胞呈多角形，胞質近中央處有圓形或橢圓形的細胞核，細胞之間緊密連接，細胞膜及核膜分布基本清晰；iic(bar＝100um)和iid(bar＝200um)顯示的是樹鼩原代肝細胞接種后48h的細胞生長情況，細胞開始匯合，細胞間可見明亮的界限(膽小管)，屬于肝細胞之間特征性結構。圖2是ith6.1細胞的生長曲線圖。圖3是應用rt-pcr檢測ith6.1細胞(p50)肝細胞功能相關基因ck18、alb表達情況的瓊脂糖凝膠電泳圖。以樹鼩原代肝細胞(pth)為陽性對照。圖4是ith6.1細胞染色體分析圖。本發(fā)明樹鼩肝細胞永生化細胞系，該細胞系命名為ith6.1，已于2017年3月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心建株，保藏號為cctccno:c201740，保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學。具體實施方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。主要試劑:1)牛血清白蛋白(bsa)，美國sigma公司；2)williamse培養(yǎng)基，lifetechnology公司；3)dmem高糖培養(yǎng)基，hyclone公司；4)二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，dmso)，sigma公司；5)胎牛血清(fetalbovineserum)，bi公司；6)4-經(jīng)乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，美國hyclone公司；8)膠原酶ii型(collagenaseii)，invitrogen公司；9)膠原酶iv型(collagenaseiv)，美國sigma公司；10)肝細胞生長因子(hgf)、表皮細胞生長因子(egf)、胰島素、地塞米松，sigma公司；11)聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)，invitrogen公司；12)胰島素轉鐵蛋白-硒添加劑its(insulin-transferrin-seleniumsupplement)(100x)，lifetechnology公司；13)鼠尾膠原rattail，collageni；14)雜交瘤無血清培養(yǎng)基(sfm培養(yǎng)基)gibico；15)dmem培養(yǎng)基gibico；16)青霉素/鏈霉素雙抗溶液(100×)gibco；17)胰蛋白酶sigma；18)磷酸鹽緩沖液pbshyclone；19)genegreen核酸染料天根生物；20)瓊脂糖biowest；21)opti-memgibco；22)lipofectmin2000invitrogen公司；23)trnzol-a+總rna提取試劑天根生物主要溶液：1)1號灌流液：氯化鈉160.8mmol/l、氯化鉀3.15mmol/l、磷酸氫二鈉0.7mmol/l、hepes33mmol/l。2)2號灌注液：以1號灌流液為溶劑，ii型膠原酶(invitrogen)50mg/l、iv膠原酶(sigma)50mg/l、質量濃度為17％氯化鈣水溶液1ml/l。3)pth貼壁培養(yǎng)基：以1號灌流液為溶劑，ii型膠原酶(invitrogen)50mg/l、iv膠原酶(sigma)50mg/l、質量濃度為17％氯化鈣水溶液1ml/l。4)pth維持培養(yǎng)基：williamse培養(yǎng)基95％(v/v)，insulin-transferrin-seleniumsupplement(100×)1％(v/v)，glutamaxtm-i(100×)1％(v/v)，humanegf10ng/ml(m/v)，humanhgf10ng/ml(m/v)，地塞米松(dexamethasone)40ng/ml(m/v)，氫化可的松(hydrocordisone)20ug/ml(m/v)，dmso0.2％(v/v)，胰島素30ug/ml，青霉素/鏈霉素雙抗溶液1％(v/v)。，dmem培養(yǎng)基89％(v/v)。(青霉素/鏈霉素雙抗溶液為商品化液體產(chǎn)品，按照1％體積比使用即可，已在主要試劑中列出廠家。)5)完全培養(yǎng)液：胎牛血清10％(v/v)，青霉素/鏈霉素雙抗溶液1％(v/v)，dmem89％(v/v)6)0.25％胰蛋白酶：0.25g的胰蛋白酶溶于100ml的pbs。7)大鼠鼠尾i型膠原包被液：乙酸0.02mol/l、大鼠鼠尾i型膠原50ug/ml、溶劑采用0.22um過濾器過濾除菌的離子水，4℃保存。8)40ug/ml秋水仙溶液：秋水仙素0.004g的秋水仙素溶于100ml去離子水。9)固定液：甲醇75％(v/v)，冰醋酸25％(v/v)。10)giemsa染液：稱giemsa粉末0.5克，加幾滴甘油研磨，再加入甘油(使加入的甘油總量為33ml)。56℃中保溫90-120分鐘。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此為giemsa原液。使用時用pbs10倍稀釋后使用。11)50×tae溶液：tris-base2mol/l，na2edta·2h2o0.1mol/l，冰乙酸5.71％(v/v)。質粒與載體:表達sv40tag蛋白的慢病毒表達質粒由addgene公司購買，包裝質粒lenti-xpackagingsingleshots購買自寶生物。細胞株：293t細胞為表達sv40t抗原的人腎上皮細胞，kmb17細胞為人胚肺二倍體細胞，hela細胞為人宮頸癌細胞，以上細胞均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所保存和提供。1.樹鼩原代肝細胞的分離1.1固定樹鼩并進行深度麻醉后，從股靜脈處注射肝素，進行抗凝處理，切開腹腔，剝離門靜脈和下腔靜脈，穿刺門靜脈，用150-200ml1號灌流液在20分鐘以內灌流至肝臟血色褪去，肝臟顏色呈現(xiàn)赭黃色。繼續(xù)進行2號灌注液灌注，當用止血鉗輕壓后出現(xiàn)一個需2-3秒才能恢復的小窩時，即可停止灌注，一般采用2號灌注液灌注時間需維持在15min到20min。將肝臟取下，撕破肝包膜，梳刮肝組織，抖落肝細胞至灌流液中，大量細胞隨著肝組織被撕開口釋放出來。1.2將以上組織液通過細胞篩網(wǎng)過濾，室溫下靜置20min使活細胞沉降，棄上清液后重懸，以1200轉/鐘(rpm)離心3分鐘，重復兩次，用pth貼壁培養(yǎng)基重懸細胞，以5×105個/ml細胞密度接種細胞培養(yǎng)皿，4小時以后，換液為pth維持培養(yǎng)基。顯微鏡下樹鼩原代肝細胞(primarytupaiahepatacyte，pth)形態(tài)進行觀察并記錄，觀察圖像見圖1。1.3倒置顯微鏡觀察新鮮分離后的樹鼩原代肝細胞，細胞透亮，且細胞呈圓形或類圓形，邊界清晰，多呈單個散在均勻的分布；一般接種2h后細胞就開始貼壁，部分細胞伸出突起，4h左右，細胞基本完成貼壁，此時，通過換液去除貼壁不牢、貼壁細胞以及崩解的細胞碎片；24h大部分肝細胞已完全貼壁，細胞完全伸展，形態(tài)逐漸不規(guī)則，呈鋪路石樣，光鏡下可見肝細胞呈六邊形、三角形或不規(guī)則型，排列整齊，細胞界限清晰，胞漿豐富透亮。細胞核有單核、雙核，呈圓形或橢圓形，48h后貼壁肝細胞已完全鋪張開來，呈現(xiàn)出“鋪路石樣”形態(tài)特征，細胞開始匯合相互融合形成島嶼狀結構，細胞之間緊密連接，細胞膜及核膜分布清晰可見。顯微鏡下觀察圖像見圖1。2.含sv40tag基因重組慢病毒的獲得：2.1表達sv40tag蛋白的慢病毒表達質粒pbabe-purosv40lt與慢病毒包裝質粒lenti-xpackagingsingleshots共轉染293t細胞：293t細胞于轉染前更換為雜交瘤無血清培養(yǎng)基(sfm)培養(yǎng)基，表達質粒pbabe-purosv40lt與慢病毒包裝質粒lenti-xpackagingsingleshots各1ug和200ul的opti-mem與含20ullipofectmin2000的200ul的opti-mem混勻后靜置20分鐘，加入長成單層的293t細胞(購買自atcc)，于37℃、5％co2條件下靜置培養(yǎng)。2.2慢病毒的收集：分別于轉染后24h和48h收集步驟2.1的細胞培養(yǎng)上清，72000g、120分鐘超速離心收集病毒，并重懸于雜交瘤無血清培養(yǎng)基，-80℃貯存?zhèn)溆谩?.含sv40tag基因重組慢病毒感染樹鼩原代肝細胞——ith6細胞的獲得在培養(yǎng)皿中以5×104個細胞/cm2的接種密度接種樹鼩原代肝細胞，加入pth貼壁培養(yǎng)基，待細胞貼壁后，更換為pth維持培養(yǎng)基，在細胞接種的24h后，將步驟2中獲得的慢病毒按照moi＝2(multiplicityofinfection，moi，感染復數(shù))的比例接種樹鼩原代肝細胞，24小時后更換為完全培養(yǎng)液，此細胞標記為ith6細胞。4.鼠尾膠原包被液包被細胞培養(yǎng)皿步驟濃度為50ug/ml大鼠鼠尾i型膠原包被液加入細胞培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)板中，使得加入包被液的量剛好覆蓋細胞培養(yǎng)皿(板)的底部。將加入了包被液的細胞培養(yǎng)皿(板)在細胞超凈臺內放置1小時后，吸走包被液，并晾干細胞培養(yǎng)皿(板)，再用pbs洗細胞培養(yǎng)皿(板)兩遍后，將細胞培養(yǎng)皿(板)再次晾干。最后用封口膜將其封好，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.ith6細胞的傳代、凍存和復蘇1)細胞傳代：當步驟3中得到的細胞接近匯片時進行傳代，傳代時，取含有ith6細胞的培養(yǎng)皿(直徑＝100mm，細胞密度沒有要求)，棄去舊培養(yǎng)基，pbs清洗一次，加入1-2ml的0.25％(m/v)胰蛋白酶消化液，消化貼壁細胞1-2分鐘，棄除胰酶消化液，加入完全培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打瓶壁使細胞分散成為單細胞懸液，按照5×104個細胞/cm2的接種密度接種至包被了鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2孵箱，靜置培養(yǎng)。2)細胞的凍存：取步驟3獲得的處于對數(shù)期生長旺盛的含有ith6細胞的培養(yǎng)皿(直徑＝100mm，細胞密度沒有要求)，棄培養(yǎng)基，pbs洗兩遍，加入1-2ml的0.25％(m/v)胰蛋白酶消化液至細胞面成空洞狀，用dmem培養(yǎng)基重懸吹打分散細胞，300g離心3分鐘后去掉上清，用凍存液(dmso:pth維持培養(yǎng)基:胎牛血清比例為1：2：7)(v:v:v)以2×106個/ml的密度重新懸浮細胞并分裝到凍存管中，放入程序凍存盒-80℃過夜后轉移到液氮中保存。3)細胞復蘇：取出保存在液氮中的ith6細胞，迅速放入37-42℃水浴中快速融化，然后以300g離心3分鐘去上清，再加入pth貼壁培養(yǎng)基使細胞充分懸浮后轉移到提前包被了鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，放37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)。6.有限稀釋法挑選單克隆細胞株選取步驟5中1)步驟靜置培養(yǎng)3-5天且生長狀態(tài)良好的細胞，進行細胞計數(shù)后分別以1×105個細胞/皿、1×104個細胞/皿、1×103個細胞/皿的細胞接種量接種于三個直徑為10cm細胞培養(yǎng)皿，待觀察到細胞貼壁后(大約接種后4小時)，將pth貼壁培養(yǎng)基換為pth維持培養(yǎng)基，之后每天鏡下觀察細胞生長情況，每隔3天換一次pth維持培養(yǎng)基。當出現(xiàn)克隆增生的細胞團時，挑選成簇增生單細胞團，吸取培養(yǎng)皿內舊培養(yǎng)基，將克隆環(huán)放到相應的細胞克隆團的位置，向環(huán)內加入1-2ml的0.25％的胰蛋白酶消化，以正好蓋住細胞為宜，在倒置顯微鏡下觀察，待細胞間隙增大后，立即加入新的完全培養(yǎng)液，用槍頭吸吹環(huán)內的細胞，使細胞脫離培養(yǎng)皿形成懸液并將懸液接種到96孔細胞培養(yǎng)板的一個孔內，然后用完全培養(yǎng)液逐漸擴大培養(yǎng)，以獲得單克隆細胞株，并按照步驟5中的方法凍存。得到ith6.1細胞系。7.ith6.1的生長曲線的繪制(計數(shù)法)取生長狀態(tài)良好的ith6.1細胞，制成1×104個/ml的細胞懸液，接種于12孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時后開始計數(shù)，以后每隔24小時計數(shù)一次，每次取3孔細胞分別進行計數(shù)，連續(xù)計數(shù)6天。根據(jù)細胞計數(shù)結果，以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸，繪制細胞生長曲線。按patter-son公式：td＝logtn×tlolgo2gno(t：培養(yǎng)時間；n0：接種后起始細胞數(shù)；nt：培養(yǎng)t小時后的細胞數(shù))通過計數(shù)法得到每天ith6.1的細胞數(shù)后，繪制ith6.1的細胞生長曲線，如圖1所示，從可知，ith6.1于培養(yǎng)第3天開始進入快速增長期，于5天達到峰值并開始進入增殖抑制期。繪制的生長曲線見圖2。8.ith6.1種屬來源鑒定實驗應用rt-pcr檢測到了ith6.1(p50)在mrna水平表達的肝細胞功能相關基因ck18(gi:34036)、alb(gi:947208389)，ck18基因編碼的細胞角蛋白ck18和alb編碼的白蛋白均是肝實質細胞特異性標志物。8.1)引物序列如下：表18.2)rna抽提取ith6.1細胞，棄培養(yǎng)液后加入trnzol-a+總rna提取試劑嚴格按照說明書操作提取ith6.1細胞總rna；8.3)逆轉錄反應獲取cdna1)嚴格按照primescript1ststrandcdnasynthesiskit(購買自寶生物)說明書進行實驗操作。按下表2配置反應液。表2試劑使用量random6mers(50um)1uldntpmixture(10mmeach)1ultemplaterna8ul2)65℃保溫5分鐘后，冰上急速冷卻，得到變性后的反應液。3)按照下表配置20ul反應液表34)按照下列條件進行逆轉錄反應：30℃，10分鐘42℃，60分鐘。5)95℃放置5分鐘使酶失活，冰上放置。8.4)pcr反應體系:1)在pcr反應管中加入反應體系:cdna2ull0xpcr緩沖液2.5uldntp(2.5mmol/l)4ul上游引物(l0lummol/l)lul下游引物(l0umol/l)lultaqdna聚合酶(5u/ml)0.2ul無核酸酶水14.3ul總體積25ul2)擴增條件及反應參數(shù)：a.預變性94℃5min；b.變性94℃30sec；c.復性55℃或58℃30sec；d.延伸72℃90sec；e.延伸72℃5min；其中b-d步驟循環(huán)35次。8.5)pcr反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳:1)于三角燒瓶中，稱取1g瓊脂糖，加入100mltae溶液，配成1％的瓊脂糖膠溶液，置于微波爐中，中火加熱3min至瓊脂糖融化，冷卻至60℃時，加入5ulgenegreen核酸染料混勻。2)將洗凈的電泳版和梳子擦干，將電泳板放入制膠槽中，插入梳子，倒入膠溶液，使膠的厚度達到0.5cm，室溫下放置至少40min以上。3)膠凝好后，緩慢地拔出梳子，將電泳板連同膠一起取出制膠槽，放入電泳槽，倒入1×tae，使液面高出膠平面1mm。4)取pcr產(chǎn)物5ul與1μl的6×loadingbuffer(購買自寶生物)混勻，后緩慢地加入電泳孔中。5)電泳儀電壓設置為100v，恒壓電泳，20min左右觀察結果。6)將電泳后的膠從膠板上取下，置于紫外透射反射儀上進行觀察。結果可見肝細胞功能標志性的基因ck18、alb有明顯的特異性條帶，結果見圖3。9.ith6.1染色體核型分析1)秋水仙素處理取生長于直徑＝100mm的細胞培養(yǎng)皿且狀態(tài)良好的ith6.1細胞(細胞的密度沒有要求)，在培養(yǎng)皿的完全培養(yǎng)液中加入秋水仙素溶液(40ug/ml，購買自sigma)，使其終濃度為40ng/ml，在37℃、5％co2的細胞培養(yǎng)箱中靜置2小時。2)低滲處理秋水仙素處理好的ith6.1細胞，棄培養(yǎng)基用pbs洗兩次后，加入0.5ml0.25％胰蛋白酶消化，加入1ml完全培養(yǎng)液懸起，用吸管轉移到15ml離心管，1200rpm離心5分鐘，收集細胞。然后加入7ml的0.075mol/l的kcl水溶液，用吸管吹打成細胞懸液，置于37℃水浴放置20分鐘。3)固定滴加1ml的固定液進行固定3分鐘。4)滴片固定后，1200rpm/min離心5分鐘，棄上清，加入0.5ml固定液重懸細胞，距離載玻片30cm滴加于玻璃載玻片上。5)把載玻片移入烘箱75℃烤3小時，即得到ith6.1細胞的涂片。6)染色和觀察。將烤好的ith6.1細胞涂片放入giemsa染液進行染色，保證染液充分覆蓋細胞面，5分鐘后，用水沖洗片子，加上蓋玻片后顯微鏡下觀察。先用低倍鏡尋找良好的分裂相，然后，在油鏡下觀察拍照。7)觀察結果：選取第50代ith6.1進行核型分析，計數(shù)了20個細胞分裂相，結果顯示ith6.1的染色體數(shù)為62條，與樹鼩chinesetreeshrew(tupaiabelangerichinensis)的染色體條數(shù)相同。染色體形態(tài)較好，能見到樹鼩特征性的8號端著絲粒長染色體(如圖4中箭頭所示)，這一點也再次驗證了ith6.1細胞是樹鼩細胞。結果見圖4。10.永生化樹鼩肝細胞系ith6.1的安全性研究--裸鼠致瘤實驗1)實驗分組和裸鼠接種：20只雌性balb/c-nu裸鼠(南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供)依次編號1-20，實驗分為ith6.1p50組(接種第50代ith6.1細胞)、ith6.1p80組(接種第80代ith6.1細胞)、hela細胞組(陽性對照組)、kmb17組(陰性對照組)共4組，按隨機數(shù)目表法完全隨機分配，每組裸鼠4只(n＝5)。收集第50代和第80代永生化人樹鼩細胞ith6.1，加dmem調至細胞密度為5xl08個/ml，每只裸鼠注射0.2ml，即注射數(shù)量為1.0x107個，注射部位為右腋皮下；陽性對照組hela細胞組，陰性對照組kmb17組細胞的處理方式、裸鼠的注射方式和注射細胞數(shù)量同上。2)實驗動物日常觀察每3天稱量裸鼠體重、觀察瘤體形成情況(形成時間、大小)、測量一次瘤體大小，待瘤體直徑接近1cm時即處死該只裸鼠切取腫瘤組織以中性福爾馬林液固定。3)實驗結果永生化樹鼩肝細胞ith6.1接種裸鼠后，同陰性對照組kmb17組裸鼠一樣，動物生長情況良好，細胞接種部位右腋下直至實驗終點(接種后三個月)均無腫物形成，三組動物一直生長狀態(tài)良好。hela組接種細胞1周后在每只裸鼠的注射部位就都能觀察到腫瘤形成，致瘤率為100％；腫瘤生長迅速，一月以內，5只裸鼠的腫瘤直徑均超過1cm。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。sequencelisting<110>中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所<120>樹鼩肝細胞永生化細胞系及其構建方法與應用<130><160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1actgctgtgcgaagcaagaacc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2attcaagcaggtcaccgtggca22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gcatccagaacgagaaggag20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4cactgtggtgctctcctcaa20當前第1頁12