本發(fā)明涉及基因工程及蛋白質(zhì)改造技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種鹽適應(yīng)性改良的內(nèi)切木聚糖酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

木聚糖主鏈?zhǔn)怯赡咎蔷酆隙傻亩嗑厶?，?cè)鏈含有l(wèi)-阿拉伯糖等殘基。木聚糖是半纖維素中最豐富的一種多糖，廣泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麥麩、秸稈等作物資源中，最高可占植物細(xì)胞干重的三分之一。內(nèi)切木聚糖酶可降解木聚糖主鏈結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生木寡糖和/或木糖，可應(yīng)用于食品、釀酒、飼料、紡織及造紙等領(lǐng)域(collinsetal.femsmicrobiolrev,2005,29:3–23.)。

耐鹽酶可應(yīng)用于高鹽食品和海產(chǎn)品加工及其它高鹽環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，如腌制食品加工、高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵、洗滌等；在高鹽環(huán)境下加工食品還可以防止微生物的污染、節(jié)省滅菌等所消耗的能源(margesin和schinner,extremophiles,2001,5:73–83.)。但由于高鹽濃度下的鹽析作用，大部分的酶在高鹽濃度下不具有良好的催化活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鹽適應(yīng)性改良的內(nèi)切木聚糖酶突變體s35h04，所述突變體s35h04的氨基酸序列如seqidno.1所示。

進(jìn)一步的，所述突變體s35h04的最適ph為5.0，最適溫度為65℃，50℃時(shí)的半衰期為30min，在20.0-25.0％(v/v)的nacl中具有62-69％的活性，在10.0-30.0％(w/v)的kcl中具有103-112％的酶活。

本發(fā)明的第二目的是提供一種鹽適應(yīng)性改良的內(nèi)切木聚糖酶突變體s35h04的編碼基因s35h04，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明的第三目的是提供一種包含內(nèi)切木聚糖酶突變體s35h04編碼基因s35h04的重組載體。

本發(fā)明的第四目的是提供一種包含內(nèi)切木聚糖酶突變體s35h04編碼基因s35h04的重組菌。

本發(fā)明的第五目的是提供一種鹽適應(yīng)性改良的內(nèi)切木聚糖酶突變體s35h04在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種鹽適應(yīng)性改良的內(nèi)切木聚糖酶突變體s35h04的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

1)將s35h04和表達(dá)載體peasy-e2相連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21-gold(de3)，獲得包含s35h04的重組菌株；

2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組突變內(nèi)切木聚糖酶表達(dá)；

3)回收并純化所表達(dá)的突變內(nèi)切木聚糖酶s35h04。

4)活性測(cè)定。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：與野生酶相比，突變內(nèi)切木聚糖酶s35h04的鹽適應(yīng)性發(fā)生了改變。純化的突變酶s35h04、野生酶rxynagn16l和rxynahj3的最適ph分別為5.0、5.5和6.0，最適溫度分別為65℃、50℃和75℃；內(nèi)切木聚糖酶rxynahj3在50℃時(shí)穩(wěn)定，rxynagn16l在50℃時(shí)極不穩(wěn)定，s35h04在50℃時(shí)的半衰期約為30min。在10.0mm的β-mercaptoethanol、cocl2和feso4中，突變體s35h04的酶活比野生酶rxynahj3的酶活分別高24％、25％和37％；在20.0–25.0％(w/v)的nacl中，突變體s35h04的酶活比野生酶rxynahj3和rxynagn16l的酶活高18-33％；在10.0–30.0％(w/v)的kcl中，突變體s35h04的酶活比野生酶rxynahj3的酶活高15–30％，比野生酶rxynagn16l的酶活高25–55％。本發(fā)明的突變內(nèi)切木聚糖酶s35h04可應(yīng)用于食品行業(yè)、海產(chǎn)品加工和高鹽環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1：在大腸桿菌中表達(dá)的重組內(nèi)切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突變體s35h04的sds-page分析，其中，ck：蛋白質(zhì)marker；

圖2：重組內(nèi)切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突變體s35h04的ph活性；

圖3：重組內(nèi)切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突變體s35h04的ph穩(wěn)定性；

圖4：重組內(nèi)切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突變體s35h04的熱活性；

圖5：重組內(nèi)切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突變體s35h04的熱穩(wěn)定性；

圖6：重組內(nèi)切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突變體s35h04在nacl中的活性；

圖7：重組內(nèi)切木聚糖酶rxynagn16l、rxynahj3及其突變體s35h04在kcl中的活性。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

試驗(yàn)材料和試劑

1、菌株及載體：大腸桿菌escherichiacolibl21-gold(de3)和表達(dá)載體peasy-e2購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；節(jié)桿菌(arthrobactersp.)和列舍瓦里爾菌(lechevalieriasp.)由云南師范大學(xué)提供。

2、酶類及其它生化試劑：dna聚合酶及dntp購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，山毛櫸木聚糖購自sigma公司，玉米芯木聚糖購自上海源葉生物科技有限公司，易錯(cuò)pcr試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒購自genestar公司，popculture^tm細(xì)胞裂解液購自德國(guó)默克集團(tuán)有限公司，其它都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。

3、培養(yǎng)基：

lb培養(yǎng)基：peptone10g，yeastextract5g，nacl10g，加蒸餾水至1000ml，ph自然(約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0％(w/v)瓊脂。

說明：以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

實(shí)施例1：突變文庫的構(gòu)建

①按照genestar公司細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取節(jié)桿菌(arthrobactersp.)和列舍瓦里爾菌(lechevalieriasp.)基因組。

②根據(jù)genbank記錄的節(jié)桿菌(arthrobactersp.)內(nèi)切木聚糖酶核苷酸序列jq863105(seqidno.3)，設(shè)計(jì)引物5'gtgcagccggaggaaaaacg3'和5'gatgaaggcaggatccggggt3'，以節(jié)桿菌(arthrobactersp.)基因組為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得內(nèi)切木聚糖酶基因xynagn16l；另根據(jù)genbank記錄的列舍瓦里爾菌(lechevalieriasp.)內(nèi)切木聚糖酶核苷酸序列jf745868(seqidno.4)，設(shè)計(jì)引物5'gtctcggccccgccggacgt3'和5'ggctcgcttcgccagcgtgg3'，以列舍瓦里爾菌(lechevalieriasp.)基因組為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得內(nèi)切木聚糖酶基因xynahj3。

③pcr反應(yīng)參數(shù)為：94℃變性5min；然后94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，30個(gè)循環(huán)后72℃保溫10min。

④以上述pcr產(chǎn)物為模板，利用易錯(cuò)pcr試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行基因突變。

⑤用超聲打斷儀biorupter對(duì)易錯(cuò)pcr產(chǎn)物進(jìn)行超聲隨機(jī)打斷，打斷產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化。

⑥純化后的小片段dna自身互為引物和模板進(jìn)行dna家族改組(dnafamilyshuffling)pcr，pcr反應(yīng)參數(shù)為：96℃變性1min30sec；然后94℃變性30sec，依次65℃退火90sec、62℃退火90sec、59℃退火90sec、56℃退火90sec、53℃退火90sec、50℃退火90sec、47℃退火90sec、44℃退火90sec、41℃退火90sec，72℃延伸1min30sec，35個(gè)循環(huán)后72℃保溫7min。

⑧以純化的dna家族改組pcr產(chǎn)物為模板，用內(nèi)切木聚糖酶基因xynahj3和xynagn16l擴(kuò)增引物和反應(yīng)條件進(jìn)行序列全長(zhǎng)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物含突變序列和未突變序列。

⑨將序列全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體peasy-e2相連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21-gold(de3)，經(jīng)過夜培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化平板中挑取單菌落于含有150μl液體lb培養(yǎng)液(含100μgml^-1amp)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃，快速振蕩培養(yǎng)約16h后，每孔加入40％(w/w)的甘油50μl，混勻后于-70℃保存。

實(shí)施例2：突變體的篩選

1)從保存突變文庫的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中取2μl菌液，接種于含200μl/孔液體lb培養(yǎng)液(含100μgml^-1amp)的96深孔板中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至od600>1.0(約20h)，加入含2mmiptg和100μgml^-1amp的200μl液體lb培養(yǎng)液，于20℃，160rpm過夜誘導(dǎo)。

2)誘導(dǎo)結(jié)束后加入40μl/孔的popculture^tm細(xì)胞裂解液，在25℃下，震蕩裂解細(xì)胞30min。

3)取50μl含1.0％(w/v)山毛櫸木聚糖的mcilvaine緩沖液(ph＝7.0)及50μl細(xì)胞裂解產(chǎn)物，在96深孔板中于70℃恒溫箱中反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后加入150μldns試劑終止反應(yīng)，于140℃恒溫箱中保溫20min以上并冷卻至室溫，使用酶標(biāo)儀讀取od540nm的值，以只含有peasy-e2空載體的e.colibl21-gold(de3)菌株裂解液反應(yīng)組作為對(duì)照。

4)取有內(nèi)切木聚糖酶活性的突變體細(xì)胞裂解產(chǎn)物10μl，另取90μl含0.5％(w/v)山毛櫸木聚糖的mcilvaine緩沖液(ph＝7.0)，加入10％(w/v)和25％(w/v)的nacl，在96深孔板中于70℃恒溫箱中反應(yīng)10min。

5)反應(yīng)結(jié)束后加入150μldns試劑終止反應(yīng)，于140℃恒溫箱中保溫20min以上并冷卻至室溫，使用酶標(biāo)儀讀取od540nm的值，以不含nacl的對(duì)應(yīng)突變體裂解液反應(yīng)組作為對(duì)照。

6)比較突變體與野生重組酶rxynagn16l和rxynahj3的酶活大小，獲得在10％(w/v)和25％(w/v)nacl中酶活提高的1個(gè)突變體，編號(hào)為s35h04，該突變體氨基酸序列如seqidno.1所示，其是兩個(gè)野生酶的改組雜合體，該突變體核苷酸序列如seqidno.2所示。

實(shí)施例3：突變體s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的酶制備

將含突變體s35h04、野生酶rxynagn16l和rxynahj3的重組菌株以0.1％的接種量分別接種于lb(含100μgml^-1amp)培養(yǎng)液中，37℃快速振蕩16h。

然后將此活化的菌液以1％接種量接種到新鮮的lb(含100μgml^-1amp)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2–3h(od600達(dá)到0.6-1.0)后，加入終濃度0.1mm的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，于20℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h。12000rpm離心5min，收集菌體。用適量的ph＝7.0tris–hcl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮的粗酶液經(jīng)13,000rpm離心10min后，吸取上清并用nickel-ntaagarose和0–500mm的咪唑分別親和和純化目的蛋白。

sds-page結(jié)果(圖1)表明，突變酶s35h04、野生酶rxynagn16l和rxynahj3都獲得了純化，產(chǎn)物為單一條帶。

實(shí)施例4：突變體s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的純化酶的性質(zhì)測(cè)定

1)突變體s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的純化酶的活性分析

活性測(cè)定方法采用3,5－二硝基水楊酸(dns)法：將底物溶于緩沖液中，使其終濃度為0.5％(w/v)；反應(yīng)體系含100μl適量酶液，900μl底物；底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后，加入酶液后再反應(yīng)10min，然后加1.5mldns終止反應(yīng)，沸水煮5min，冷卻至室溫后在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定od值；1個(gè)酶活單位(u)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生1μmol還原糖(以木糖計(jì))所需的酶量。

2)突變體s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的純化酶的ph活性和ph穩(wěn)定性測(cè)定：

酶的最適ph測(cè)定：將酶液置于37℃下和ph＝4.0–12.0的緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的ph穩(wěn)定性測(cè)定：將酶液置于ph＝3.0–12.0的緩沖液中，在37℃下處理1h，然后在ph＝7.0及37℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對(duì)照。緩沖液為：mcilvainebuffer(ph＝3.0–8.0)和0.1mglycine–naoh(ph＝9.0–12.0)。以山毛櫸木聚糖或玉米芯木聚糖為底物，反應(yīng)10min，測(cè)定純化的內(nèi)切木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：突變酶s35h04、野生純化酶rxynagn16l和rxynahj3的最適ph分別為5.0、5.5和6.0(圖2)；在ph＝5.0時(shí)，s35h04和rxynahj3穩(wěn)定而rxynagn16l不穩(wěn)定，但在ph＝11.0時(shí)，s35h04不穩(wěn)定而rxynagn16l和rxynahj3穩(wěn)定(圖3)。

3)突變體s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的純化酶的熱活性及熱穩(wěn)定性測(cè)定：

酶的熱活性測(cè)定：在ph＝7.0的緩沖液中，于0–90℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定：將同樣酶量的酶液置于37℃處理0–60min后，在ph＝7.0及37℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對(duì)照。以山毛櫸木聚糖或玉米芯木聚糖為底物，反應(yīng)10min，測(cè)定純化的內(nèi)切木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：s35h04、rxynagn16l和rxynahj3的最適溫度分別為65℃、50℃和75℃，在70℃分別具有81.1％、17.7％和97.7％的酶活(圖4)；rxynahj3在50℃時(shí)穩(wěn)定，rxynagn16l在50℃時(shí)極不穩(wěn)定，s35h04在50℃時(shí)的半衰期約為30min(圖5)。

4)不同金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)突變體s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的純化酶活力的影響：

在酶促反應(yīng)體系中加入10.0mm的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對(duì)酶活性的影響。在37℃及ph＝7.0條件下，以山毛櫸木聚糖或玉米芯木聚糖為底物測(cè)定酶活性。結(jié)果(表1)表明：10.0mm的hgcl2可完全抑制s35h04、rxynagn16l和rxynahj3；在10.0mm的β-mercaptoethanol、cocl2和feso4中，突變體s35h04的酶活比野生酶rxynahj3的酶活分別高24％、25％和37％。

表1.金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)突變體s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3活力的影響

5)突變體s35h04及野生酶rxynagn16l和rxynahj3的純化酶在nacl和kcl中的活性：

酶在nacl中的活性測(cè)定：在酶促反應(yīng)體系中加入3.0–30.0％(w/v)nacl，于ph7.0及37℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)。以山毛櫸木聚糖或玉米芯木聚糖為底物，反應(yīng)10min，測(cè)定純化的內(nèi)切木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：在20.0–25.0％(w/v)的nacl中，突變體s35h04的酶活比野生酶rxynahj3和rxynagn16l的酶活高18-33％(圖6)。

酶在kcl中的活性測(cè)定：在酶促反應(yīng)體系中加入3.0–30.0％(w/v)kcl，于ph7.0及37℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)。以山毛櫸木聚糖或玉米芯木聚糖為底物，反應(yīng)10min，測(cè)定純化的內(nèi)切木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：在10.0–30.0％(w/v)的kcl中，突變體s35h04的酶活比野生酶rxynahj3的酶活高15–30％，比野生酶rxynagn16l的酶活高25–55％(圖7)。

6)蛋白酶抗性測(cè)定：

酶的蛋白酶抗性：用相當(dāng)于重組酶10倍(w/w)的胰蛋白酶(ph＝7.5)和蛋白酶k(ph＝7.5)在37℃對(duì)重組酶處理1h，然后在ph＝7.0及37℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以置于蛋白酶對(duì)應(yīng)ph緩沖液中但未加蛋白酶的酶液作為對(duì)照。結(jié)果表明：經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶k在37℃下處理1h，s35h04、rxynagn16l和rxynahj3的酶活幾乎無損失。

本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會(huì)用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

sequencelisting

<110>云南師范大學(xué)

<120>一種鹽適應(yīng)性改良的內(nèi)切木聚糖酶改組突變體及其制備方法和應(yīng)用

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>344

<212>prt

<213>雜合序列

<400>1

valseralaproproaspvalserglyhislysglnthrleuargser

151015

alaalaprolysglyphehisileglythralavalalaglyglygly

202530

hishisgluasnglnprotyrproaspprophethrseraspserglu

354045

tyrarglysvalleualaalaglupheasnservalserprogluasn

505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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145150155160

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210215220

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gluglnleugluglnglnalaasptyrtyrglnargalaleugluala

275280285

cysleuservalalaaspcysasnserphethriletrpglyphethr

290295300

asplystyrsertrpvalprovalphepheglnglyglnglyalaala

305310315320

thrvalmettrpasnasppheglyarglysglnalatyrtyrthrleu

325330335

argserthrleualalysargala

340

<210>2

<211>1032

<212>dna

<213>雜合序列

<400>2

gtctcggccccgccggacgtgagcggccacaaacagacgttgcgctcggcagcgcccaag60

ggtttccacatcggcacggccgtcgcgggcggcggccaccacgagaaccagccgtacccg120

gaccccttcacctcggacagcgagtaccggaaggtgctggccgcggagttcaactcggtc180

tcgcccgagaaccagatgaagtgggagtacatccacccggagcgcggccggtacaacttc240

ggcatggccgacgccatcgtccggttcgccaagcagaaccggcaggtggtccgcgggcac300

accctgatgtggcacagccagaatcctcagtggctggagcagggaaacttctccaaagaa360

gaactgcgcggaatcctcaaagaccacgtccagactgtagtgggcaggtacgccggcaaa420

atccagcagtgggacgtcgccaacgaaatcttcaatgatgacggaaccctgcgcgccacc480

gagaacatttggcttcgtgaactgggcccggacatcattgccgacgttttccgctgggcg540

cacgaggccgaccccaaggccaagctgttcttcaatgatttcggcgttgaggacattaat600

gccaagagtgatgcctacctcgaactcatcccccggcttcaggcacagggcgtgcaggtt660

gacgggtttgccatccagggccatctgagcacccgctacggtttcccttcagggctgcag720

gccaacctgcagcgctttgacgacctggggctggaaaccgccattacggaaatagacgtc780

cgcatggatattgcagccggcacggagccgacggccgagcagcttgagcagcaggcggac840

tactaccagcgcgcccttgaggcctgcctgtccgttgcagactgcaattcgttcaccatt900

tggggcttcaccgacaagtactcgtgggtgccggtcttcttccaggggcagggtgcggcc960

acggtgatgtggaacgacttcggtcgcaagcaggcgtactacacgctgcggtccacgctg1020

gcgaagcgagcc1032

<210>3

<211>3639

<212>dna

<213>節(jié)桿菌（arthrobactersp.）

<400>3

atgaaggttccgcgtttattaaccgctctggctgtaacctcggcgctgctgctgccggcg60

gttccggcgcttgccgtgcagccggaggaaaaacgtcctccgggccagtccaaacaggac120

acgctgcgccgtgcagcccccaaagacttcaagattggttccgccgttgcgggcggaggc180

catcatgaggcccaggactaccccgatccttttacgttcgataaggaataccgccggcaa240

ctggccgccgagttcaattcggtgtcaccggagaaccagtcgaagtgggaattcatccac300

ccggaaaaggatgtctaccgcttcacggaaatggacgccattgtccgctccgcccaaaaa360

aacaagcaggtggtgcgcggccacaccctcttttggcacagccagaatcctcagtggctg420

gagcagggaaacttctccaaagaagaactgcgcggaatcctcaaagaccacgtccagact480

gtagtgggcaggtacgccggcaaaatccagcagtgggacgtcgccaacgaaatcttcaat540

gatgacggaaccctgcgcgccaccgagaacatttggcttcgtgaactgggcccggacatc600

attgccgacgttttccgctgggcgcacgaggccgaccccaaggccaagctgttcttcaat660

gatttcggcgttgaggacattaatgccaagagtgatgcctacctcgaactcatcccccgg720

cttcaggcacagggcgtgcaggttgacgggtttgccatccagggccatctgagcacccgc780

tacggtttcccttcagggctgcaggccaacctgcagcgctttgacgacctggggctggaa840

actgccattacggaaatagacgtccgcatggatattgcagccggcacggagccgacggcc900

gagcagcttgagcagcaggcggactactaccagcgcgcccttgaggcctgcctgtccgtt960

gcagactgcaattcgttcaccatttggggcttcacggacaagtactcgtgggttccggtc1020

ttctttgccggcgagggcgaggcgacagtcatggaggaagacttcacgcgcaagcctgcc1080

tactttgccctgcgggaaacactgaagcgtccggtgccgaagcccgacgacggcggcccg1140

tcccagccaaccccggatcctgccttcatccccggcggcgccgccaacccgacagcgacg1200

ccgatcgcagcatcccgcggcaccggcaactccgtggcgctcaccttcgatgacgggccc1260

gagcccggcgaaaccacagctgtcctcgatttcctcaaggacaagggcatcactgccacc1320

ttctgcgtcatcggagcgaacatccaggcccccggcggagccgagctggtgaagcgcatg1380

gtcgaggagggccacacgctgtgcaaccacggcaccacgtatgcggacatgggttcgtgg1440

acccaggaacagattaaggccgacctggtggaaaacctccgcatcatccgtgaagccgcc1500

ggcacgcctgatctgcaggtcccctatttccgggcaccgaacggaagctggggagtcacg1560

ggcgaagtagccgcagcgcttggtatgcagccgctgggcctgggcaatgtcatctttgac1620

tgggacggcaatgacctcagcgaagccaccctcacggcaaacctccgtgccgcgttcacc1680

cccggcgcggtggtgctggcgcacgtcggcggcggtgaccggaccaacacagtgaaggca1740

gttacgacggtcgtgaccgaaaagctcgcccaggggtggacgttcgcccttccgcagggc1800

ggtgccccggaggaaccttccggcggtgtgccctcggacttcgagaccggaaccgacggc1860

tggaccgcgcgcggggactcagtggcggtcaacctcagctccgacgcccgcaccggatcc1920

ggaagcctgctggtcacgaaccggacccaggactggcacggtgccgcactcgacgtcacg1980

ggcgccctaccggtcggctcggccgtaaagatgtccgtctgggccaagctcgcccccggg2040

cagcagccggcggcactgaaaatgtccgttcagcgggacaacggcggcgggagtgcctat2100

gaaggcgttgccggagccggggcttcggtcaccgccgacggctggaccgaacttgccggg2160

acttacaccctcggcgcagcagcggacaaagcccaggtgtacatcgaaggtgctgtcggc2220

gtggggttcctgctcgatgacttcagcctcgccgcatatgttgagcctccccttcaggag2280

gacatacccgggttgaaagacgtccttggcctgcagggcatcgagcacgtgggagcagca2340

atcgacgcacgcgagacagcgggcaccgcagcgaacctcctgcggaaacacttcaatgcc2400

ttcactcccgagaacgccggcaggcccgagagcgtgcagccggtggagggtcagttcacc2460

cttacccagctggaccagctgctggacttcgcagccgccaacaatgtcaaggtgtacgga2520

catgtgctggtctggcattcccagacccctgagtggttcttcaaggacgggacccgggac2580

ctgaccggcaaccggtccgaccgggcgctgctgagggcacgcatggaggcacatatcaag2640

ggcatcgcagatcacatcaatgcccgctacccggagggggacagccccatttgggcctgg2700

gacgttgtcaacgagaccattgcggacggtgacacggccaacccgcacgacatgcgggac2760

agccgctggttccaggtcctcggtgaacgttttgtcgatgatgccttccgtctcgcggac2820

aagtacttcccggaggcaaagctcttcatcaacgactacaacaccgagatgccccagaaa2880

cgggccgactatctcgagctgattcgtgccctggaagcccggggcgtacccatcgacggc2940

gtgggccaccaggcgcacgtcgacgtggcacgtccggtgcagtggctcgaggactcgatc3000

aaggccgttgagaaggtcaatcctgacctgatgcaggcgatcactgagctcgacgtgaac3060

gcgtccaccgagaatcagggcgcggacgtggacggtgccccggtggatccgtaccagccg3120

gcattcgggaacgacggggacgccgccgcggaagtcggatactactaccgcgacttgttc3180

gccatgctgcgcaagcacagttcggctattgattcggtgaccgtctggggcatcagcaac3240

gcccgcagctggctgcggacctggccgatggcccggccctgggagcagccgcttccattc3300

gacgatgatctgcaggctgcaccggcctactggggaatcgtggatcccgcgaaactgccg3360

gcccggcctgccgacgtgctggcaccccgcatcgccgatcagccggacgtggtggccttt3420

tcaaagcgcgccggacgggtgaaggtggcttacccgttgccctcggcgatcgacaccctc3480

gacggcaaagtgccggtggactgttctccgcgccgcggcagcacctttgccgtggggacc3540

actgcggtcacctgcacggccacggatgccgccggcaacacgaggaccagcagcttcgac3600

gtggtggtgaagaagcaccggcaccacggaaggcactga3639

<210>4

<211>1104

<212>dna

<213>列舍瓦里爾菌（lechevalieriasp.）

<400>4

atgaggtcggctcgtctggtcatcgctttgttcgctgccgtggcgttgtcggcgccaccg60

gcttcggcggtctcggccccgccggacgtgagcggccacaaacagacgttgcgctcggca120

gcgcccaagggtttccacatcggcacggccgtcgcgggcggcggccaccacgagaaccag180

ccgtacccggaccccttcacctcggacagcgagtaccggaaggtgctggccgcggagttc240

aactcggtctcgcccgagaaccagatgaagtgggagtacatccacccggagcgcggccgg300

tacaacttcggcatggccgacgccatcgtccggttcgccaagcagaaccggcaggtggtc360

cgcgggcacaccctgatgtggcacagccagaacccggagtggctggagcagggcgacttc420

accgcggccgaactgcgcgagatcctgcgcgagcacatcatgaccgtggtcggccggtac480

aagggcaaggtccagcagtgggacgtggccaacgagatcttcaccgacgccggcgctctg540

cggaccacggagaacatctggatccgtgaactcggtccgggcatcgtggcggacgcgttc600

cgctgggcgcaccaggccgaccccaaggcgaagctgttcttcaacgactacaacgtcgaa660

agcgtcaacgcgaagagcgacgcgtactacgcgctgatcaaggagctgcgcgccgcgggt720

gtgcccgtgcacggcttctccgcccaggcgcacctcagcctggactacggcttcccggac780

gacctggagcgcaacctgaagcggttcgccgacctccggctggagaccgcgatcaccgag840

ctcgacgtgcggatgaccctgcccgcgagcggcgtgccgacggcggcccagctgcagcag900

caggccgactactaccagcgcacgctcgcggcctgcctgaaggtcaggacctgcaagtcg960

ttcaccatctggggcttcaccgacaagtactcgtgggtgccggtcttcttccaggggcag1020

ggtgcggccacggtgatgtggaacgacttcggtcgcaagcaggcgtactacgcgctgcgg1080

tccacgctggcgaagcgagcctga1104