本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，更具體地說，涉及一株能夠裂解etec的噬菌體pes-1、基于該噬菌體的生物消毒劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：：在發(fā)展中國家和不發(fā)達國家，主要的食源性致病菌廣泛流行，對人類健康構(gòu)成重大威脅，尤其是發(fā)展中國家4歲以下的兒童，每年腹瀉人數(shù)大約14億，其中約3億是由大腸桿菌引起的。大腸桿菌即腸埃希氏菌(escherichiacoli，e.coli)，廣泛分布在自然界中，是人和動物腸道中常見的一種細菌。1885年由德國科學(xué)家escherich首次從嬰兒腹瀉物中分離出來。國內(nèi)外研究人員根據(jù)不同的致病機理將致瀉性大腸桿菌主要分為6類：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenice.coli，etec)、腸致病性大腸桿菌(enteropathogenice.coli，epec)、腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagee.coli，ehec)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasivee.coli，eiec)、腸黏附性大腸桿菌(enteroadhesivee.coli，eaec)和擴散黏附性大腸桿菌(diffuselyadherente.coli，daec)。各國針對致病性大腸桿菌引起疾病的治療方法主要是使用各種抗生素類藥物。然而，近年來，從水果、蔬菜、肉類中分離得到的抗性致病菌已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)、人類、獸醫(yī)學(xué)中的主要問題。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenice.coli，etec)是引起仔豬腹瀉的最主要致病菌之一。腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌是致病性大腸桿菌中的一種，屬于腸桿菌科(enterobacteriaceae)、埃希氏菌屬(escherichia)。菌體大小為(0.4-0.7)×(1.0-3.0)μm。大多周身有鞭毛，能運動，某些菌株有菌毛，無芽孢，兼性厭氧，在普通培養(yǎng)基上生長良好，菌落直徑2-3mm。腹瀉的致病過程為細菌通過菌毛黏附小腸上皮細胞，大量增殖后產(chǎn)生腸毒素，引起一系列的級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生腹瀉。etec致病因子主要是腸毒素和菌毛，腸毒素一般只有耐熱性腸毒素和不耐熱性腸毒素兩種，但是菌毛種類較多，隨地區(qū)不同而改變。etec性腹瀉發(fā)病癥狀為仔豬糞便稀度高且呈黃色，肛門有糞便殘留甚至紅腫；普遍脫水嚴重、體重下降；皮毛稀疏凌亂、皮膚澀白沒有紅潤光澤。初染腹瀉仔豬體溫一般不會升高，精神尚好，有食欲，如不及時治療，病情可逐漸加重，精神萎靡、拱背、怕冷，嚴重時糞便失禁，發(fā)病3-5d后死亡。由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起的仔豬黃痢和白痢危害性極大，已使養(yǎng)豬業(yè)蒙受巨大經(jīng)濟損失。常用于防治此病的抗生素因耐藥與殘留問題而備受爭議，尋找抗生素替代品尤為必要。噬菌體作為一種新型“抗菌劑”已得到各國科學(xué)家的認可。噬菌體是一種感染細菌的病毒，廣泛分布在淡水、海洋環(huán)境、土壤表層、食物、糞便、人和動物以及其他環(huán)境。噬菌體對真核生物細胞(例如動物或植物)無害，并且很少引起人類的副作用。噬菌體是裂解性或溶源性的，但只有被證明安全和具有廣泛宿主范圍的裂解性噬菌體可以用于食品的生物防控。噬菌體及其內(nèi)溶素可以以幾種方式摻入食品系統(tǒng)中，例如噴霧、浸漬、固定、單獨或制成“噬菌體雞尾酒”使用。使用噬菌體的一個優(yōu)點是可以選擇性地控制細菌群體，而不干擾天然微生物群，并且對食物的物理化學(xué)和感官性質(zhì)沒有顯著的影響。大腸桿菌作為一種致病性較高的細菌，用噬菌體作為其抗菌劑具有天然、安全、高效、無殘留等優(yōu)點，具有廣闊的發(fā)展前景，因此受到越來越廣泛的關(guān)注。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種etec噬菌體，基于該噬菌體制備一種新型生物消毒劑，以控制導(dǎo)致仔豬腹瀉的主要病原菌產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，用于防治由etec引發(fā)的仔豬腹瀉，同時凈化養(yǎng)殖環(huán)境、設(shè)施。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種etec噬菌體，該噬菌體pes-1于2016年12月08日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為：cgmccno.13382，分類命名為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌裂解性噬菌體。本發(fā)明所述etec噬菌體pes-1號用于防治產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌。本發(fā)明etec噬菌體pes-1可以裂解多株etec。本發(fā)明還提供了一種基于上述etec噬菌體pes-1號的生物消毒劑，有效成分為etec噬菌體pes-1號。優(yōu)選方式下，上述生物消毒劑按體積百分比計，具體組成為：etec噬菌體pes-1號菌液60％-70％，0.003m十二烷基磺酸鈉(sds)10％-20％，sm緩沖液5％-10％，0.1m蔗糖5％-10％；所述生物消毒劑中etec噬菌體pes-1號總噬菌體有效量≥1010pfu/ml。所述的消毒劑輔料為：sds作為一種助溶劑，為市面上常用的陰離子表面活性劑；sm緩沖液作為一種噬菌體穩(wěn)定劑，可以在保存過程中維持噬菌體效價，配方：每50ml1mtris-hcl(ph7.5)中加入明膠0.1g，mgso4·7h2o2g，nacl5.8g；蔗糖為市面上常見的二糖，和sm緩沖液聯(lián)合使用，可以更好地穩(wěn)定噬菌體效價，當sm緩沖液與0.1m蔗糖的體積比為1:1時效果最優(yōu)。本發(fā)明生物消毒劑可以在養(yǎng)殖環(huán)境中應(yīng)用，從而降低養(yǎng)殖環(huán)境中仔豬的發(fā)病率，具體應(yīng)用方法為，將效價≥1×1010pfu/ml的所述生物消毒劑以100ml/m3的劑量噴灑于養(yǎng)殖環(huán)境中，以殺滅養(yǎng)殖環(huán)境中的etec。與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點是：1、本發(fā)明所涉及的裂解性噬菌體pes-1在養(yǎng)殖場的污水和糞便中分離獲得，且對etec具有廣譜殺菌作用，特異性強，其輔料中的sm緩沖液和蔗糖可以保護噬菌體效價的穩(wěn)定性，這有利于該消毒劑的長期使用和保存；2、養(yǎng)殖場常用化學(xué)消毒劑的種類包括：含氯消毒劑，過氧化物類消毒劑，醛類和醇類消毒劑，含碘消毒劑和酚類消毒劑，化學(xué)消毒劑氧化能力強，高濃度可刺激、損害皮膚黏膜，腐蝕物品。本發(fā)明的生物消毒劑對環(huán)境和人安全無毒，且克服了化學(xué)消毒劑的腐蝕性和刺激性氣味。保藏說明本發(fā)明涉及的生物材料樣品的保藏信息：參據(jù)的微生物(株)為pes-1，分類命名為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌裂解性噬菌體，于2016年12月8日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)保藏，保藏編號cgmccno.13382。cgmcc地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。附圖說明圖1.產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌lt凝膠電泳圖圖2.產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌st凝膠電泳圖圖3.pes-1一步生長曲線圖4.噬菌體pes-1體外抑菌實驗圖5.保存一個月后噬菌體pes-1效價變化圖6.噬菌體pes-1電鏡圖片具體實施方式以下結(jié)合優(yōu)選實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細地闡述。以下實施例僅僅用于說明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明技術(shù)方案的限制。實施例1產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的分離在不同超市、菜市場采集豬肉樣品，在養(yǎng)豬場采集豬糞樣品，豬肉樣品首先在腦心浸出液肉湯(brainheartinfusionbroth，bhi)中37℃培養(yǎng)3h，隨后在雙倍磷酸胰蛋白胨肉湯(double-strengthtryptonephosphate，tp)中44℃培養(yǎng)20h；糞便樣品在42℃的bhi中培養(yǎng)20h。取液體培養(yǎng)液，稀釋后涂布于麥康凱平板培養(yǎng)基上生長12h后，紅色菌落形態(tài)呈表面隆起、邊緣整齊、光滑、圓潤等特征。依據(jù)麥康凱固體選擇培養(yǎng)基的化學(xué)特性，初步判斷紅色菌落為大腸桿菌，挑取疑似大腸桿菌菌落純化后劃線培養(yǎng)，挑取的紅色單菌落經(jīng)純培養(yǎng)后，在麥康凱平板上依然呈現(xiàn)出大腸桿菌的典型特征，樣品保存留作后續(xù)實驗。鑒定etec主要測定大腸桿菌腸毒素，腸毒素有耐熱性腸毒素(heat-stableenterotoxin，st)和不耐熱性腸毒素(heat-labileenterotoxin，lt)兩種，二者單獨或共同存在于所有etec中。因此，設(shè)計并合成兩種腸毒素基因，進行特異性pcr反應(yīng)，能夠擴增出目的條帶的即為目標etec單菌落，如圖1、2所示。實施例2產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌噬菌體的分離、擴增及純化1.水樣的處理取養(yǎng)殖場污水，加入cacl2至終濃度為1mol/l，8000rpm離心10min，去除污水中的沉淀顆粒。取上清用0.22μm濾膜濾過除菌。取濾液20ml，與20ml2×lb培養(yǎng)基混合，按1％的接種量，接種400μl的etec，37℃富集培養(yǎng)12h。取5ml的上述菌液，4℃，5000rpm離心10min，取上清用0.22μm濾膜濾過除菌，即得噬菌體原液。2.噬菌體的分離采用雙層瓊脂平板法分離噬菌體，具體方法如下：將噬菌體原液10倍梯度稀釋，分別取300ul稀釋液與300ul相應(yīng)的對數(shù)期etec混合，37℃孵育15min，與5ml55℃保溫的完全熔化上層瓊脂(瓊脂濃度為0.5％)混合，均勻鋪在下層瓊脂(瓊脂濃度1.5％)平皿上，冷卻15min后倒置37℃過夜培養(yǎng)。次日，觀察噬菌斑的出現(xiàn)情況。挑取單個噬菌斑，重復(fù)3次雙層瓊脂平板實驗，得到單一的噬菌體。再挑取單個噬菌斑溶解在1ml的sm緩沖液中。3.噬菌體的擴增挑取etec單個菌落，接種于50ml液體lb培養(yǎng)基中，37℃、150rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期早期；加入1ml含有噬菌斑的sm緩沖液，37℃、150rpm振蕩培養(yǎng)待菌液澄清后，4℃、5000rpm離心10min，取上清。反復(fù)擴增，使用0.22μm濾膜過濾，得到所要體積的噬菌體裂解液。4.噬菌體的純化向噬菌體裂解液中加入nacl，終濃度為1mol/l，冰浴1h后，4℃、8000rpm離心10min，沉淀菌體碎片，收集上清；根據(jù)上清的體積，加入peg8000，終濃度為10％(m/v)，4℃、10000g離心10min，去上清，用等體積sm緩沖液溶解沉淀的噬菌體，即得到初步純化的噬菌體裂解液。實施例3噬菌體的生物學(xué)特性1.噬菌體的電鏡觀察取超速離心提純的噬菌體懸液滴于覆有聚乙烯甲醛膜的銅網(wǎng)上少許，以2％磷鎢酸(ph7.0)染色5-10min，將銅網(wǎng)放于干燥濾紙上，自然干燥。然后用日立jem2100c型電鏡觀察，如圖6所示。2.噬菌體的一步生長曲線加入噬菌體及對數(shù)早期的宿主菌使moi＝0.1，37℃孵育15min后，8000rpm離心10min，棄上清，lb培養(yǎng)基懸浮菌體，再次離心、懸浮沉淀，洗滌2次后，用5ml預(yù)熱的lb培養(yǎng)基混懸沉淀并充分混勻，迅速置于37℃搖床(150rpm)中培養(yǎng)，開始計時，于0時刻和每隔10min取樣100μl，8000rpm離心5min，吸取上清，10倍梯度稀釋測定噬菌體滴度。各時間點均作雙份復(fù)管取平均值，同時以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體為對照，實驗重復(fù)3次，如圖3所示。實驗結(jié)果表明，噬菌體pes-1的潛伏期為20min，裂解期為40min，裂解量為267pfu/infectedcell。申請人在養(yǎng)豬場分離得到9株etec，在養(yǎng)殖場污水中分離到4株etec噬菌體，其中的pes-1對9株噬菌體都有裂解作用，因此選作此生物消毒劑的主要成分，于2016年12月08日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為：cgmccno.13382，分類命名為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌裂解性噬菌體。實施例4噬菌體pes-1的噬菌譜分析分別取大腸桿菌9株，銅綠假單胞菌1株，副溶血性弧菌1株，金黃色葡萄球菌1株，無乳鏈球菌1株(菌株來源見表1)，將菌株復(fù)蘇，培養(yǎng)，取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液100μl均勻涂布于lb平板，待其干燥后分別取10μl實施例2制備的噬菌體pes-1分別點樣于菌苔表面，并以生理鹽水點樣作對照，每個樣品做3個重復(fù)，待液滴干燥后倒置于37℃或28℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12～16h于第二天觀察效果。pes-1能夠裂解養(yǎng)殖場分離到的多株etec，但是不能裂解其它屬的細菌。說明pes-1既有針對etec的廣譜性，又有針對不同屬細菌的特異性。結(jié)果如表1所示：表1.噬菌體pes-1裂解譜本發(fā)明噬菌體pes-1是長尾噬菌體，相比于其他etec噬菌體的裂解譜更廣。實施例5噬菌體消毒劑的制備將本實驗室保藏的純化后的噬菌體pes-1進行活化，使其濃度≥1010pfu/ml，然后按照以下體積比加入各種輔料進行混合，混合均勻，配方組成如下：(1)etec噬菌體pes-160％；十二烷基磺酸鈉(sds)溶液20％；sm緩沖液10％；0.1m蔗糖10％.(2)etec噬菌體pes-170％；十二烷基磺酸鈉(sds)溶液20％；sm緩沖液5％；0.1m蔗糖5％.實施例6消毒劑主要成分pes-1的體外抑菌試驗取5瓶裝有100mllb液體培養(yǎng)基的錐形瓶，以1％的接種量接種etec，37℃、150rpm培養(yǎng)至對數(shù)前期(od600在0.3左右)。其中三瓶按照感染復(fù)數(shù)為0.1、1、10的比例加入噬菌體，另外兩瓶分別加入等體積的pbs和硫酸鏈霉素作為陰性對照與陽性對照?；靹蚝笤?7℃、150rpm條件下培養(yǎng)，每隔1h取樣觀察混合液在od600條件下的吸光度。檢測結(jié)果如圖4所示，從實驗結(jié)果可以看出，噬菌體在不同moi條件下，都可以將菌液od600的值控制在0.5以下，且與硫酸鏈霉素的抑菌效果相當。實施例7噬菌體消毒劑對養(yǎng)豬場環(huán)境的消毒效果在養(yǎng)殖場隨機選取10個點(每個點均為1m2×20cm)作為試驗區(qū)，并做標記，將9株濃度為1×108cfu/ml的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的混合液均勻噴灑于養(yǎng)殖場試驗區(qū)，然后以實施例4獲得的噬菌體消毒劑(效價為1×1010pfu/ml)以100ml/m3的劑量對試驗區(qū)噴灑消毒，2h后檢測產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌殘留，發(fā)現(xiàn)其中2個試驗區(qū)仍有產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌殘留，4h后檢測產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌殘留，10個試驗區(qū)均未檢測到產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌。說明該消毒劑可以有效殺滅養(yǎng)殖環(huán)境中的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌。實施例8sm緩沖液和蔗糖對噬菌體效價的保護作用將噬菌體原液分為四組，每組100ml，測定第一組的效價為1×1010pfu/ml作為對照，其余三組分別加入50mlpbs緩沖液，50mlsm緩沖液，50mlsm緩沖液+0.1m蔗糖(兩者比例1:1)，將后三組噬菌體4℃放置一個月后，分別測定其效價，檢測結(jié)果分別為1×107pfu/ml，1×108pfu/ml，1×109pfu/ml，如圖5所示?？梢缘贸觯?0mlsm緩沖液+0.1m蔗糖(兩者比例1:1)對噬菌體效價的保護作用最好。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
：的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12當前第1頁12