專利名稱：Atp生物發(fā)光法在快速評估消毒劑消殺效果的應用的制作方法
專利說明ATP生物發(fā)光法在快速評估消毒劑消殺效果的應用 本發(fā)明涉及快速評估消毒劑消殺效果的方法及試劑，尤其涉及ATP生物發(fā)光法在快速評估消毒劑消殺效果的應用。按照“消毒與滅菌的評價方法與標準”(GB15981-1995)和2002年衛(wèi)生部頒布的《消毒技術規(guī)范》，在評價或測試消毒劑殺滅微生物能力的試驗中一般包括三個步驟。試驗微生物先經(jīng)消毒液處理，再中和去除消毒劑的作用，最后轉到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后觀察濁度變化(定性)或轉到固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后計數(shù)菌落(定量)，從而計算出殺菌效率。由于采用培養(yǎng)法計數(shù)，需用1～5天才能觀察結果。這樣采用常規(guī)方法評估一個消毒劑的殺菌效果需要一周以上的時間，且工作量非常大。因此建立新的快速評估方法是當前消毒劑行業(yè)的迫切要求。
為了實現(xiàn)對消毒劑消毒效果的快速評估，Best等人嘗試以五種不同類型的微生物混合液作為試驗菌懸液，通過消毒劑對該混合液的殺菌譜來劃分消毒劑類型，取得了較好的效果。郇政山報道了發(fā)酵法與快檢紙片法在餐具檢測中消毒效果的評價，此法以其快速、便捷的優(yōu)點得以推廣。細菌的快速培養(yǎng)定量方法如微滴菌落計數(shù)法以及用于實驗室篩選消毒產(chǎn)品的微生物生長分析儀等皆有報道。這些快速評價方法有其實用的一面，然而這些都是通過培養(yǎng)法計數(shù)，改善的程度不大。
ATP生物發(fā)光技術是目前有望實現(xiàn)即時檢測微生物最快的方法，它的原理是螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)以熒光素(D-Luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2為底物，在Mg2+存在時，能將化學能轉化為光能。反應式表示為
ATP既是熒光素酶催化發(fā)光的必需底物，又是所有生物生命活動的能量來源，在熒光素酶催化的發(fā)光反應中，ATP在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強度呈線性關系。D’Eustachio和Levin的研究表明，各生長時期的細菌均有較恒定水平的ATP含量，一般為每個細胞含ATP0.28×10-10～8.9×10-10μg(即0.054～1.76×10-18mol)，平均為3×10-10μg ATP/cell(0.594×10-18molATP/cell)，酵母細胞大約是細菌細胞的100倍，每個酵母細胞的ATP含量也比細菌細胞多100倍左右。因此，提取細菌的ATP，利用生物發(fā)光法測出ATP的含量后，即可推算出樣品中的含菌量，整個過程僅為幾分鐘。本發(fā)明的目的在于提供一種快速評估消毒劑消殺效果的方法及試劑。
本發(fā)明所提供的ATP生物發(fā)光法在快速評估消毒劑消毒效果中的應用，主要是將ATP生物發(fā)光法這種微生物數(shù)量快速檢測技術替換傳統(tǒng)真菌和細菌的平板培養(yǎng)計數(shù)法，進行消毒劑處理前后的活菌數(shù)量快速測定。評估一種消毒劑的消毒效果僅需要1～3h，極大提高了評估的效率，大幅度縮短了評估時間。
本發(fā)明最主要的技術特征是首次將ATP生物發(fā)光法這種微生物數(shù)量快速檢測技術用于消毒劑消毒效果的評估；其次是采用ATP清除劑結合濾膜過濾的辦法，有效地克服了非目標細胞ATP對測定的干擾。本發(fā)明按照GB15981，在消毒劑消毒效果評估中主要采用4種標準菌株大腸桿菌(Escherichia coli)8099、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538、枯草桿菌黑色變種(Bacillus subtilis var.niger)ATCC 9372和白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231。具體操作方法如下(1)標準菌株ATP含量與細胞數(shù)量的換算系數(shù)(K)測定a.制備4種標準指示菌株菌懸液在37℃下，用胰蛋白胨(TSA)培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372標準菌株18～24h，用沙堡弱氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)ATCC 10231菌株40～48h，通過接種針刮下斜面上的菌苔，用生理鹽水制成菌懸液，經(jīng)8000r/min室溫下離心5min，棄上清后的菌泥用生鹽水懸浮，使細菌指示菌的數(shù)量為1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的數(shù)量為1×107～5×107cells/mL，作為測試用的標準菌懸液(簡稱A液)。
b.菌懸液的活菌含量平板培養(yǎng)計數(shù)按10倍稀釋法進行傾注平板培養(yǎng)計數(shù)，培養(yǎng)和計數(shù)方法按GB15981。
c.標準菌懸液的生物發(fā)光法測定獲得上述4種標準菌株8099、ATCC 9372、ATCC 6538和ATCC10231菌懸液(A液)后，用ATP提取劑Ec對4種菌懸液以及作為空白對照的生理鹽水和用生理鹽水配制的一系列標準ATP溶液在室溫下進行ATP提取1～5min，取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑劑的檢測緩沖液中，加上螢光素酶-熒光素試劑0.1mL通過生物發(fā)光儀檢測每分鐘發(fā)光值(CPM)。
d.標準菌株ATP含量與細胞數(shù)量的換算系數(shù)(K)測定通過對系列標準ATP濃度及其對應CPM值取對數(shù)后，進行線性回歸，獲得線性回歸方程Lg[ATP](mol/L)＝A+B×Lg(CPM)。然后將標準菌懸液測得的CPM值代入回歸方程，求出其ATP濃度，再通過與平板培養(yǎng)計數(shù)結果對照，可獲得各標準菌株的ATP含量--細胞數(shù)量換算系數(shù)K。ATP含量--細胞數(shù)量換算系數(shù)K＝懸液平板計數(shù)菌數(shù)(cfu/mL)×103/菌懸液的ATP濃度(mol/L)。
(2)消毒劑處理后生物發(fā)光法對照值測定采用目的消毒劑處理指示菌懸液，以平板法驗證，達到100％殺滅指示菌株，將處理液用微孔濾膜過濾并用ATP清除劑進一步去除非目的ATP的干擾，提取殘留細胞中的ATP后進行發(fā)光檢測，并用系列標準ATP和配制ATP的無菌純水進行同樣的ATP提取的發(fā)光檢測，通過系列標準ATP及其對應的CPM值取對數(shù)后的回歸方程，換算成相當于原液中的ATP濃度，比較100％殺滅樣品的ATP濃度和空白溶液中的ATP濃度，對不同類型的指示菌進行經(jīng)驗處理后，使100％殺滅樣品經(jīng)ATP生物發(fā)光換算成的活菌總數(shù)結果能較好地和平板培養(yǎng)結果相對應。
(3)利用換算系數(shù)進行消毒劑消殺效果快速評估a.消毒效果初始評估用菌懸液的制備在37℃下用胰蛋白胨(TSA)培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372標準菌株18～24h，用沙堡弱氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)ATCC 10231菌株40～48h，用接種針刮下斜面上的菌苔后，用生理鹽水制成菌懸液。經(jīng)8000r/min室溫下離心5min，棄上清后的菌泥用生理鹽水懸浮，通過血球計數(shù)板初步估計，使細菌指示菌的數(shù)量為1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的數(shù)量為1×107～5×107cells/mL，直接作為不加有機物的評估用菌液(簡稱A液)，加有機物的評估用菌液則將離心后的菌泥用生理鹽水懸浮，再與30g/L的BSA(牛血清白蛋白)無菌溶液按1∶1比例混合后即成，(簡稱B液)。
b.消毒處理前標準菌懸液活菌總數(shù)的ATP生物發(fā)光法測定取1mL評估用標準菌懸液，加入1mL細胞ATP提取劑Ec振勻，于室溫作用適當時間(1-5min)，取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑劑的pH7.8，為25mmol/L的Tricine緩沖液中，加入0.1mL熒光素酶-熒光素試劑，立即搖勻，置生物發(fā)光檢測儀進行發(fā)光脈沖計數(shù)(發(fā)光CPM值)。進行空白和系列標準ATP的校正檢測，并做出ATP和CPM的對數(shù)線性回歸方程，換算成指示微生物的活菌數(shù)量(X)，活菌數(shù)量(X)(cfu/mL)＝樣品中的ATP濃度(mol/L)×K×10-3。
c.消毒作用后殘留活菌總數(shù)的ATP生物發(fā)光法測定配制高于目標濃度50倍以上的消毒藥液，按小于總體積2％的數(shù)量加入到50～100mL的A液或B液中，使其達到作用的目標消毒劑濃度，在25℃±2℃條件下作用一定時間后，用評估消毒劑的專用中和劑中和，處理液在無菌條件下過直徑為47mm孔徑為0.22～0.45μm的濾膜，去真空后用1mL ATP清除劑(AE)原位處理濾膜2～10min，加30～50mL生理鹽水沖洗2次。在無菌條件下取下過濾膜，放入50mL無菌燒杯中，加入1mL無菌超純水和1mLATP提取劑Ec，振勻，于室溫(25℃)作用適當時間(1～2min)，取0.1mL ATP提取溶液，加入適量解抑劑和pH7.8，25mmol/L的Tricine緩沖液，使其體積為0.9mL，再加入0.1mL螢光素酶-熒光素試劑，立即置發(fā)光儀中檢測發(fā)光CPM值，同時進行空白和系列標準ATP的校正檢測，通過系列標準ATP及其對應的CPM值取對數(shù)后的回歸方程Lg[ATP](mol/L)＝A+B×Lg(CPM)，由樣品的CPM值，獲得樣品的ATP濃度，并通過ATP含量--細胞數(shù)量換算系數(shù)K轉化成標準微生物的活菌數(shù)量(Y)(cfu/mL)＝K×10(A+Blg(CPM))×10-3。
d.消毒劑消毒效果計算消毒劑的殺菌率(％)＝(X-Y)/X×100；殺滅對數(shù)值＝LgX-LgY。
本發(fā)明所提及的微生物細胞ATP釋放劑Ec含有1～30g/LTritonX-1000.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化銨(CTAB)0.1～3.0g/L二甲亞砜(DMSO)0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.01～0.1g/L硫酸鎂(MgSO4)制作過程為每升無菌超純水中加入1～30gTritonX-100、0.1～5.0gCTAB、0.1～3.0gDMSO、0.01～0.1gEDTA、0.01～0.1gMgSO4，加熱使其溶解，振勻即成，所有試劑采用分析純，可在室溫條件下1～5min內(nèi)完成微生物細胞ATP的提取，簡便、快速。
本發(fā)明所提及的解抑劑為內(nèi)含葡萄糖單元分別為6、7、8的環(huán)糊精等環(huán)狀化合物，具體制作過程為取0.1～15.0g分析純環(huán)糊精溶解于pH 7.8 Tricine緩沖液(內(nèi)含50mmol/LTricine、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使終體積為1000mL，0.22μm濾膜過濾除菌后分裝至5個滅菌的小瓶，于4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。該解抑劑可以排除陽離子、陰離子和兩性離子表面活性劑等物質(zhì)對分析的干擾。
本發(fā)明所提及中和消毒劑用的中和劑的使用方法為50g/L無水硫代硫酸鈉(Na2S2O3)的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)，用量為1∶0.9時具有中和過氧乙酸的作用；而每1mL的100mg/L的二氧化氯則采用50g/L的無水硫代硫酸鈉(Na2S2O3)溶液25μl。
本發(fā)明所提及的ATP清除劑AE，其具體成份和制作過程如下用50mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgSO4，1mmol/LEDTA，1mg/mlBSA，pH6.8的緩沖溶液配制焦磷酸酶0.1～10mg/mL，并通過0.22μm的濾膜過濾除菌。實施例1標準菌株ATP含量與細胞數(shù)量的換算系數(shù)(K)的測定(1)制備4種標準指示菌株菌懸液在37℃下，用胰蛋白胨(TSA)培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372標準菌株20h，用沙堡弱氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)ATCC 10231菌株45h，通過接種針刮下斜面上的菌苔，用生理鹽水制成菌懸液，在8000r/min室溫下離心5min，棄上清后的菌泥用生鹽水懸浮，使指示細菌數(shù)量為1×108～5×108cells/mL，指示真菌數(shù)量為1×107～5×107cells/mL，作為測試用的標準菌懸液(簡稱A液)。
(2)菌懸液的活菌含量平板培養(yǎng)計數(shù)按10倍稀釋法進行傾注平板培養(yǎng)計數(shù)，培養(yǎng)和計數(shù)方法按GB15981。4種標準指示菌株菌懸液8099、ATCC9372、ATCC6538和ATCC10231的活菌總數(shù)平板培養(yǎng)結果分別為4.9×108cfu/mL、1.3×108cfu/mL、1.5×108cfu/mL和1.0×107cfu/mL。
(3)標準菌懸液的生物發(fā)光法測定取1mL上述進行平板培養(yǎng)的4種標準菌株8099、ATCC 9372、ATCC 6538和ATCC10231菌懸液(A液)，加入1mL ATP提取劑Ec，振勻，于室溫(25℃)作用2min。取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8mL含解抑劑的pH7.8，25mmol/L的Tricine緩沖液，再加入0.1mL熒光素酶-熒光素試劑，立即搖勻，置生物發(fā)光檢測儀進行發(fā)光脈沖計數(shù)(發(fā)光CPM值)。同法檢測空白對照的生理鹽水和用生理鹽水配制的一系列標準ATP溶液的發(fā)光CPM值。
(4)標準菌株ATP含量與細胞數(shù)量的換算系數(shù)(K)測定通過對系列標準ATP及其CPM取對數(shù)后，進行線性回歸，獲得線性回歸方程Lg[ATP]＝-13.236+1.211Lg(CPM)，R＝0.998。
對樣品CPM值取對數(shù)后，就可求出樣品中的ATP濃度(moL/L)ATP濃度(moL/L)＝10-13.236+1.211Lg(CPM)再通過與平板培養(yǎng)計數(shù)結果對照，求出各標準菌株的ATP含量-細胞數(shù)量換算系數(shù)K(cells/moL ATP)K＝懸液平板計數(shù)菌數(shù)(cfu/mL)×103/10-13.236+1.211Lg(CPM)結果見表1
表1 ATP含量與細胞數(shù)量的換算系數(shù)(K)測定
*空白擬采用配制標準ATP的無菌純水。
實施例2消毒劑處理后生物發(fā)光法對照值測定用過氧乙酸消毒劑處理ATCC10231和8099菌懸液，經(jīng)平板培養(yǎng)驗證100％殺滅后，處理液用無菌的微孔濾膜(直徑為47mm，孔徑為0.22～0.45μm)進行真空抽濾，去真空后用ATP清除劑AE原位處理濾膜5min，取下濾膜用ATP提取劑Ec進行殘留細胞中的ATP提取后，吸取0.1mLATP提取液，加入0.8mL含解抑劑的pH7.8，25mmol/L的Tricine緩沖液和0.1mL螢光素酶-螢光素試劑，搖勻后立即做發(fā)光檢測，并用系列標準ATP和配制ATP的無菌純水進行同樣的ATP提取的發(fā)光檢測。通過系列標準ATP及其對應的CPM值取對數(shù)后的回歸方程，(Lg[ATP]＝13.838+1.269Lg(CPM)，R＝0.988)換算成相當于原液中的ATP濃度，空白對照的CPM值也同樣換算成ATP濃度，實驗結果見表2。
表2 消毒劑處理后生物發(fā)光法對應值測定
<p>表5
實施例9用菌株B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40生產(chǎn)L-異亮氨酸9.1制備菌株B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40將在實施例7.1中獲得的需要L-異亮氨酸的菌株B-3996kurΔtdh，借助于噬菌體Plkc轉導(Lennox，病毒學1，190-206(1955)；Miller，分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室1972)，并分離L-異亮氨酸原養(yǎng)型轉導體。
為此，將噬菌體Plkc在菌株MG1655上增殖(Guyer等，數(shù)量生物學冷泉港座談會45，135-140(1981)，及Blattner等，科學277，1453-1462(1997))，并將噬菌體裂解物用于轉導菌株B-3996kurΔtdh。感染復數(shù)為大約0.2。在含有2g/l葡萄糖和10mg/l L-蘇氨酸的基本培養(yǎng)基上選擇L-異亮氨酸原養(yǎng)型轉導體。分離L-異亮氨酸原養(yǎng)型轉導體，涂布于LB瓊脂上以純化或分離，并將其稱為B-3996kurΔtdhilvA+。
然后如實施例3所述，將菌株B-3996kurΔtdhilvA+的pckA基因由實施例1和2中制備的ΔpckA等位基因置換。所得菌株稱為B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA。
菌株B-3996kurΔtdhilvA+和B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA用分離自菌株B-3996的質(zhì)粒pVIC40轉化，并在補加20μg/ml鏈霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細胞。各自選擇的一個菌落稱為B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40和B-3996kurΔtdhilvA+/pVIC40。
9.2生產(chǎn)L-異亮氨酸
(4)過氧乙酸消毒劑消毒效果計算通過樣品CPM對數(shù)值換算成相當于原液中的ATP濃度后，參考消毒劑處理后生物發(fā)光法與平板培養(yǎng)對應值測定結果，并根據(jù)標準指示菌的ATP含量與細胞數(shù)量換算系數(shù)轉化為相當于原液中的活菌總數(shù)，計算過氧乙酸對ATCC10231和8099的殺菌率和對數(shù)殺滅值。實驗結果見表3。
表3 生物發(fā)光法快速評估過氧乙酸消毒及消毒后ATP量的計算結果
表中符號a為換成原液中ATP濃度＜CK的樣品，b為換成原液中ATP濃度＜1/10CK的樣品。
實施例4ATP生物發(fā)光法在快速評估二氧化氯消毒劑消殺效果的應用在評估中，采用8099、ATCC6538、ATCC9372和ATCC10231作為指示菌，消毒自處理時間采用1分鐘，其它所有的步驟與實例3的步驟一致。對于二氧化氯采用50g/L的無水硫代硫酸鈉(Na2S2O3)作為中和劑，用量為每1mL濃度為100mg/L的二氧化氯使用中和劑25μl，系列標準ATP的對數(shù)回歸方程為Lg[ATP]＝-13.236+1.211Lg(CPM)，R＝0.998，實驗結果見表4。
表4 生物發(fā)光法評估二氧化氯消毒劑的殺菌效果
注關于表中符號a為換成原液中ATP濃度＜CK的樣品，b為換成原液中ATP濃度＜1/10CK。
權利要求
1.一種ATP生物發(fā)光法在快速評估消毒劑消殺效果的應用，其特征在于首先制作標準菌懸液，用細胞ATP釋放劑Ec進行處理，加入螢光素酶-螢光素試劑后檢測發(fā)光值(CPM)；同法，將標準菌懸液用消毒劑作用后采用ATP清除劑結合微孔濾膜過濾，檢測濾膜發(fā)光值(CPM)，同時作系列標準ATP濃度及對應的CPM值取對數(shù)后的線性回歸方程，再利用標準菌株ATP含量與細胞數(shù)量的換算系數(shù)(K)求出消毒劑處理前后的標準微生物菌懸液的活菌數(shù)量，評估消毒劑的消殺效果。
2.權利要求1所述的應用，按下述步驟進行(1)標準菌株ATP含量與細胞數(shù)量的換算系數(shù)(K)測定a.制備4種標準指示菌株菌懸液在37℃下，用胰蛋白胨(TSA)培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372標準菌株18～24h，用沙堡弱氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)ATCC 10231菌株40～48h，通過接種針刮下斜面上的菌苔，用生理鹽水制成菌懸液，經(jīng)8000r/min室溫下離心5min，棄上清后的菌泥用生鹽水懸浮，使細菌指示菌的數(shù)量為1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的數(shù)量為1×107～5×107cells/mL，作為測試用的標準菌懸液(簡稱A液)；b.菌懸液的活菌含量平板培養(yǎng)計數(shù)按10倍稀釋法進行傾注平板培養(yǎng)計數(shù)，培養(yǎng)和計數(shù)方法按GB15981；c.標準菌懸液的生物發(fā)光法測定獲得上述4種標準菌株8099、ATCC 9372、ATCC 6538和ATCC10231菌懸液(A液)后，用ATP提取劑Ec對4種菌懸液以及作為空白對照的生理鹽水和用生理鹽水配制的一系列標準ATP溶液在室溫下進行ATP提取1～5min，然后加入適量的解抑劑搖勻，細胞ATP提取液通過生物發(fā)光儀檢測每分鐘發(fā)光值(CPM)；d.標準菌株ATP含量與細胞數(shù)量的換算系數(shù)(K)測定通過對系列標準ATP濃度及其對對應CPM值取對數(shù)后，進行線性回歸，獲得線性回歸方程Lg[ATP](mol/L)＝A+B×Lg(CPM)。將標準菌懸液測得的CPM值代入回歸方程，求出其ATP濃度，再通過與平板培養(yǎng)計數(shù)結果對照，可獲得各標準菌株的ATP含量--細胞數(shù)量換算系數(shù)K；ATP含量--細胞數(shù)量換算系數(shù)K＝懸液平板計數(shù)菌數(shù)(cfu/mL)×103/菌懸液的ATP濃度(mol/L)；(2)利用換算系數(shù)進行消毒劑消殺效果快速評估a.消毒效果初始評估用菌懸液的制備在37℃下用胰蛋白胨(TSA)培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372標準菌株18～24h，用沙堡弱氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)ATCC 10231菌株40～48h，用接種針刮下斜面上的菌苔后，用生理鹽水制成菌懸液；經(jīng)8000r/min室溫下離心5min，棄上清后的菌泥用生理鹽水懸浮，通過血球計數(shù)板初步估計，使細菌指示菌的數(shù)量為1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的數(shù)量為1×107～5×107cells/mL，直接作為不加有機物的評估用菌液(簡稱A液)，加有機物的評估用菌液則將離心后的菌泥用生理鹽水懸浮，再與30g/L的BSA(牛血清白蛋白)無菌溶液按1∶1比例混合后即成，(簡稱B液)；b.消毒處理前標準菌懸液活菌總數(shù)的ATP生物發(fā)光法測定取1ml評估用標準菌懸液，加入1ml細胞ATP提取劑Ec振勻，于室溫(25℃)作用適當時間(1-5min)，取0.1ml ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑劑的pH7.8，25mmol/L 的Tricine緩沖液和0.1mL熒光素酶—熒光素試劑，立即搖勻，置生物發(fā)光檢測儀進行發(fā)光脈沖計數(shù)(發(fā)光CPM值)；進行空白和系列標準ATP的校正檢測，并作出ATP和CPM的對數(shù)線性回歸方程，換算成指示微生物的活菌數(shù)量(X)；活菌數(shù)量(X)＝樣品中的ATP濃度(mol/L)×K×10-3；c.消毒作用后殘留活菌總數(shù)的ATP生物發(fā)光法測定配制消毒藥液，加入到A液或B液中，使其達到作用的目標消毒劑濃度，在25℃±2℃條件下作用一定時間后，用評估消毒劑的專用中和劑中和，處理液在無菌條件下過直徑為47mm、孔徑為0.22～0.45μm的濾膜，去真空后用ATP清除劑(AE)1mL原位處理濾膜2～10min后，加入30～50mL生理鹽水沖洗2次；在無菌條件下取下過濾膜，放入50mL無菌燒杯中，加入1mL無菌超純水和1mLATP提取劑(Ec)，振勻，于室溫下作用1～5min；取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑劑的pH7.8，25mmol/L的Tricine緩沖液和0.1mL熒光素酶—熒光素試劑，立即搖勻，檢測發(fā)光CPM值；同時進行空白和系列標準ATP的校正檢測，通過系列標準ATP濃度及其對應的CPM值取對數(shù)后的回歸方程，獲得樣品的ATP濃度，并利用ATP含量--細胞數(shù)量換算系數(shù)K轉化成標準微生物的活菌數(shù)量(Y)(cells/mL)＝K×10(A+Blg(CPM))×10-3；d.消毒劑消毒效果計算消毒劑的殺菌率(％)＝(X-Y)/X×100，殺滅對數(shù)值＝LgX-LgY。
3.權利要求1或2所述的應用，細胞ATP釋放劑Ec含有1～30g/L TritonX-1000.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化銨(CTAB)0.1～3.0g/L二甲亞砜(DMSO)0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.01～0.1g/L硫酸鎂(MgSO4)。
4.權利要求2所述的應用，解抑劑含有葡萄糖單元分別為6、7、8的環(huán)糊精等環(huán)狀化合物，其制作過程為取0.1～15.0g環(huán)糊精溶解于pH7.8的Tricine緩沖液(內(nèi)含50mmol/LTricine、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使終體積為1000mL。
5.權利要求2所述的應用，使用的消毒劑的中和劑含有無水硫代硫酸鈉。
6.權利要求5所述的應用，中和劑的使用方法為50g/L的無水硫代硫酸鈉(Na2S2O3)的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)，用量為1∶0.9時具有中和過氧乙酸的作用；而每1mL的100mg/L的二氧化氯則采用50g/L的無水硫代硫酸鈉(Na2S2O3)溶液25μl。
7.權利要求1或2所述的應用，使用的ATP清除劑(AE)，其具體成份和制作過程如下用50mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgSO4，1mmol/L EDTA，1mg/mLBSA，pH6.8的緩沖溶液配制焦磷酸酶0.1～10mg/mL，并通過0.22μm的濾膜過濾除菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及ATP生物發(fā)光法在快速評估消毒劑消殺效果的應用，首先根據(jù)消毒劑消毒效果評估時主要采用的標準菌株制作標準菌懸液，用細胞ATP釋放劑Ec進行處理后加入熒光素酶－熒光素試劑，檢測發(fā)光值(CPM)。同法，將標準菌懸液用消毒劑作用后采用ATP清除劑結合微孔濾膜過濾，檢測濾膜發(fā)光值(CPM)。同時作系列標準ATP濃度及對應的CPM值取對數(shù)后的線性回歸方程，再利用標準菌株ATP含量與細胞數(shù)量的換算系數(shù)(K)求出消毒劑處理前后的標準微生物菌懸液的活菌數(shù)量，評估消毒劑的消殺效果。利用本發(fā)明評估一種消毒劑的消毒效果僅需要1～3h，極大提高了評估的效率，大幅度縮短了評估時間，而且有效地克服了非目標細胞ATP對測定的干擾。
文檔編號G01N21/76GK1680803SQ20041002679
公開日2005年10月12日 申請日期2004年4月8日 優(yōu)先權日2004年4月8日
發(fā)明者吳清平, 吳慧清, 張菊梅, 李程思 申請人:廣東省微生物研究所, 廣州環(huán)凱生物技術有限公司