本發(fā)明涉及一種parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株的建立方法，本發(fā)明還涉及parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株的應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：乳腺癌的藥物治療已經(jīng)進(jìn)入了分子分型指導(dǎo)下的精準(zhǔn)化治療時(shí)代。通過組化四要素(er、pr、her2和ki67)而代替基因芯片檢測的簡易分子分型，已廣泛應(yīng)用于指導(dǎo)臨床藥物治療方案的制定。但三陰型乳腺癌(tnbc)因其er、pr以及her2均陰性，對靶向激素受體的內(nèi)分泌治療和靶向her2的系列藥物治療無效。曾被列為靶向治療的棄兒。而三陰型乳腺癌又較其他分子類型發(fā)病更年輕化，遺傳傾向更明顯，有更強(qiáng)的侵襲性，2年內(nèi)局部復(fù)發(fā)和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高。傳統(tǒng)的化療雖然顯示出較高的近期有效率，但緩解時(shí)間較短，總體生存差，亟待開發(fā)針對性強(qiáng)的靶向治療藥物。brca1/2的突變率在三陰型乳腺癌中波動(dòng)在9％到28％。因?yàn)閎rca1/2是dna同源重組修復(fù)(homologousrecombination,hr)的主要基因，其突變導(dǎo)致三陰型乳腺癌對dna損傷的藥物敏感性顯著增加。抑制parp1(polyadp-ribosepolymerasefamilymember1,聚腺苷二磷酸-核糖轉(zhuǎn)移酶1)抑制劑可使brca1/2基因突變的細(xì)胞選擇性凋亡，以parp1為靶點(diǎn)的分子治療可能成為三陰型乳腺癌新的治療手段，引領(lǐng)三陰型乳腺癌步入了靶向治療的里程。基于此理論，應(yīng)用parp1抑制劑聯(lián)合dna損傷化療藥物卡鉑治療brca1/2突變率相對較高的三陰性乳腺癌應(yīng)該具有更好的療效。然而，o’shaughnessy教授牽頭開展的國際多中心iii期臨床研究，并未顯示出parp1抑制劑iniparib聯(lián)合致dna損傷化療藥物卡鉑及吉西他濱治療三陰性乳腺癌的優(yōu)勢.隨后astrazeneca公布的另一個(gè)parp1抑制劑olaparib治療三陰性乳腺癌ii期臨床結(jié)果，也未達(dá)到預(yù)期的療效。因此，對于一種理論上對三陰性乳腺癌有效的藥物是否在實(shí)際中也同樣有效，目前缺乏一種有效的判斷機(jī)制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株的建立方法及其應(yīng)用，用以研究parp1抑制劑耐藥的問題，同時(shí)判斷藥物是否對三陰性乳腺癌有效。本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：一種parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟一：對b細(xì)胞感染puro-chek2載體，向b細(xì)胞中轉(zhuǎn)入puro基因，同時(shí)將細(xì)胞自身表達(dá)的背景chek2去掉；步驟二：感染后進(jìn)行puromycin篩選，篩選后得到chek2沉默的b細(xì)胞；步驟三：對chek2-null的b細(xì)胞感染帶有g(shù)fp的chek2y394c；步驟四：篩選帶有g(shù)fp標(biāo)記的細(xì)胞，得到parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株。作為優(yōu)選，本發(fā)明的parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株的建立方法，還包括：驗(yàn)證的步驟：對步驟四中得到的有g(shù)fp標(biāo)記的細(xì)胞分別使用順鉑、表柔比星和azd2281進(jìn)行驗(yàn)證，如果在上述三種藥物的刺激下，步驟四中得到的細(xì)胞的存活率比chek2wt細(xì)胞的存活率更高，說明成功得到了parp1抑制劑的耐藥細(xì)胞株。作為優(yōu)選，本發(fā)明的parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株的建立方法，還可以具有這樣的特征：其中，所述b細(xì)胞為eμ-mycp19arf-/-b細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種上述的耐藥細(xì)胞株的建立方法建立的parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株在藥物篩選中的應(yīng)用。作為優(yōu)選，上述的應(yīng)用，還包括建立野生型和空載體對照組的步驟，具體步驟是：除了將chek2-null的b細(xì)胞帶有g(shù)fp的chek2y394c之外，另取兩組chek2-null的b細(xì)胞，分別感染chek2wt以及chek2vec。作為優(yōu)選，上述的應(yīng)用，還包括：使用不同濃度梯度的抗癌藥物同時(shí)對chek2y394c細(xì)胞、chek2wt細(xì)胞以及chek2vec細(xì)胞進(jìn)行刺激，檢測三種細(xì)胞的存活率，然后判斷抗癌藥物是否對chek2y394c細(xì)胞有殺傷作用。發(fā)明的有益效果本發(fā)明的parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株的建立方法，chek2的y390c突變通過影響細(xì)胞周期阻滯和凋亡，導(dǎo)致parp1抑制劑的耐藥，而重新過表達(dá)野生型chek2后，細(xì)胞對parp1抑制劑的敏感性得到恢復(fù)。該細(xì)胞模型的建立對研究parp1抑制劑耐藥提供了體外細(xì)胞模型。另外，還可以利用此位點(diǎn)的基因突變來篩選抗腫瘤藥物。附圖說明圖1是chek2表達(dá)抑制后，細(xì)胞對表柔比星、順鉑以及parp1抑制劑均表現(xiàn)出耐藥的結(jié)果圖；圖2是chek2在使用shrna處理后表達(dá)下調(diào)的結(jié)果圖；圖3是chek2的y394c位點(diǎn)突變后的細(xì)胞對不同藥物的敏感性結(jié)果；圖4是使用azd2281處理后的細(xì)胞存活率結(jié)果；圖5是使用azd2281處理一段時(shí)間后再用其它藥物處理的細(xì)胞存活比例；圖6是y394c細(xì)胞對底物p53ser20的磷酸化結(jié)果；圖7是y394c細(xì)胞中cdc25a的磷酸化結(jié)果。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖來說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。需要說明的是，本發(fā)明中未詳細(xì)描述的實(shí)驗(yàn)，均按照生物化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程或者相應(yīng)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。實(shí)施例一：parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株的建立方法步驟一：首先采用逆轉(zhuǎn)錄rnai方法。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為pmscv-ires-gfp。重組的病毒由感染質(zhì)粒的phonix細(xì)胞產(chǎn)生。對eμ-mycp19arf-/-b細(xì)胞感染包含puro-chek2的shrna的質(zhì)粒，只含puromycin抗性，不含gfp，向b細(xì)胞中轉(zhuǎn)入puro基因，同時(shí)將細(xì)胞自身表達(dá)的背景chek2去掉。shrna感染后進(jìn)行嘌呤霉素(puromycin)篩選，篩選后得到chek2-null的bcell。chek2-null表示敲低或者沉默chek2。3’端chek2cdna的發(fā)卡目的片段序列為：ccagaaacacataatcattaa。步驟二：由于人的chek2y390位點(diǎn)在鼠中對應(yīng)的為y394位點(diǎn)，因此在本實(shí)施方式中構(gòu)建小鼠的chek2的cdna時(shí)，應(yīng)當(dāng)將394位點(diǎn)的酪氨酸堿基突變?yōu)榘腚装彼峒磘at→tgt；得到chek2y394c的cdna。對chek2-null的b細(xì)胞分別感染帶有g(shù)fp基因的chek2wt，chek2y394c和chek2vec，wt表示野生型，y394c表示394c位點(diǎn)突變，vec表示空載體，作為對照。對感染的chek2wt，chek2y394c和chek2vec進(jìn)行流式細(xì)胞分選，含gfp的細(xì)胞被篩選出來。含有g(shù)fp的細(xì)胞表示感染成功。步驟三：藥物敏感性檢測：使用順鉑濃度為3μm、表柔比星濃度為15nm和azd2281濃度為1nm分別對上述三種細(xì)胞進(jìn)行刺激。結(jié)果如圖3所示，圖3中的mlp即無chek2表達(dá)的空載體細(xì)胞。結(jié)果表明：chek2y394c和chek2wt細(xì)胞對parp1抑制劑在內(nèi)的藥物敏感性明顯不同，chek2y394c對azd2281耐藥，chek2wt對藥物敏感。步驟四：細(xì)胞存活率檢測：采用不同濃度的azd2281處理chek2y390c和chek2wt細(xì)胞48小時(shí)，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)和chek2wt相比，chek2y394c細(xì)胞存活率更高。圖4中azd2281的濃度梯度是：0.7nm，2.1nm，3.5nm，4.9nm和7nm。表1：細(xì)胞存活率檢測結(jié)果mockazd1azd2azd3azd4azd5chek-y394c88.87％61.02％58.83％40.02％18.91％0.87％chek2-wt88.87％52.70％22.62％17.31％0.88％0.77％control88.87％59.12％57.12％39.29％18.92％0.86％步驟五：細(xì)胞存活率檢測：使用parp1抑制劑azd2281對chek2y394c、chek2wt、chek2vec三種細(xì)胞處理6小時(shí)后。結(jié)果如圖5所示，不同chek2表達(dá)狀態(tài)的細(xì)胞存活比例不同，chek2y394c細(xì)胞存活比例大，而chek2wt細(xì)胞存活比例小。構(gòu)建chek2的shrna，進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)，選擇dna損傷的化療藥物順鉑cisplatin，表柔比星dox和parp1抑制劑。具體流程如下：采用順鉑cisp和表柔比星dox，用48孔板進(jìn)行試驗(yàn)，每孔加100μlb細(xì)胞培養(yǎng)基，0.2mb細(xì)胞和100μl的順鉑：20ug/ml，或者表柔比星：10ug/ml。結(jié)果提示chek2表達(dá)抑制后，細(xì)胞對表柔比星，順鉑以及parp1抑制劑azd2281均表現(xiàn)出耐藥，如圖1所示：驗(yàn)證了chek2y394位點(diǎn)突變確實(shí)對parp1抑制劑形成了耐藥性。對感染的shrna進(jìn)行puromycin篩選后，抽提rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，進(jìn)行real-timepcr結(jié)果如圖2所示：結(jié)果顯示chek2確實(shí)有下調(diào)。實(shí)施例二：parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株在研究parp1抑制劑抗藥性中的應(yīng)用舉例。如圖6所示，western的結(jié)果顯示y394c細(xì)胞對底物p53ser20的磷酸化大大降低。如圖7所示，表達(dá)y394c的細(xì)胞對底物cdc25a的磷酸化大大降低。dna雙鏈?zhǔn)艿綋p傷時(shí)，激活后的chek2可以磷酸化cdc25a，從而增強(qiáng)cdc25a的泛素化并導(dǎo)致其降解，這樣cdc25a不能去除cdk2上抑制其活性位點(diǎn)的磷酸基團(tuán)，使得cdk2沒有活性，發(fā)揮g1/s期檢測點(diǎn)效應(yīng)，阻斷dna合成。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示y394c突變降低了chek2對dna損傷藥物的修復(fù)功能。在parp1抑制劑azd2281作用下，y394c突變后細(xì)胞對p53的ser20的磷酸化水平降低，同時(shí)我們在研究中發(fā)現(xiàn)，azd2281處理6小時(shí)后，表達(dá)y394c的細(xì)胞對底物cdc25a的磷酸化大大降低。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示parp1抑制劑治療后，表達(dá)y394c突變的細(xì)胞的g1→s細(xì)胞阻滯受到明顯的影響?？傊?，通過以上實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了chek2y394c過表達(dá)的細(xì)胞對parp1抑制劑azd2281耐藥，而chek2野生型的細(xì)胞對parp1抑制劑敏感。通過該細(xì)胞模型，可以深入研究parp1抑制劑耐藥的機(jī)制，為parp1抑制劑更好應(yīng)用于臨床提供研究基礎(chǔ)。序列表<110>上海長海醫(yī)院<120>parp1抑制劑耐藥細(xì)胞株的建立方法及其應(yīng)用<130>jsp1712093<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1ccagaaacacataatcattaa21當(dāng)前第1頁12