本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體的說，涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米事件gt1外源插入片段旁側(cè)序列以及用于檢測該序列的pcr引物，本發(fā)明還涉及利用該引物進行轉(zhuǎn)基因玉米檢測的方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

維生素e是一類人體所必需的脂溶性維生素，具有重要的生理功能。它能夠清除脂質(zhì)過氧化所產(chǎn)生的自由基而穩(wěn)定保護生物膜的脂雙層，使細胞免受過氧化物的傷害。因而被作為一種有效的抗氧化劑廣泛地應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)中。大量動物實驗證明，在每公斤飼料中添加40-100iu(國際單位)的維生素e，具有提高動物免疫力，改善肉質(zhì)，提高動物的繁殖性能，緩解其應(yīng)激反應(yīng)等顯著效果。另外，在飼料中添加維生素e能增加肉品的穩(wěn)定性，防止肉類腐敗、變味、變色，并延長上架時間。近20年來的臨床研究表明，維生素e對于人體健康更具有重要作用。每天吸收100－1000iu的維生素e則可提高機體免疫力，延緩人體衰老，降低或防治心血管疾病和癌癥的發(fā)生。

天然維生素e由8種生育酚異構(gòu)體組成。根據(jù)側(cè)鏈飽和度可分為生育酚(tocopherol)和三烯生育酚(tocotrienol)兩大類。每類依芳香環(huán)上甲基數(shù)目和位置的不同又分別分為α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚。這8種同系物在植物中的含量及相對活性均不盡相同，α-生育酚的生物活性最高(α、β、γ、δ相對活性分別為100％、50％、10％和3％，α-三烯生育酚約為30％，其他三烯生育酚為10％左右。國際上對于維生素e產(chǎn)品的質(zhì)量標準也主要以α-生育酚的含量和活性來判定。但是α-生育酚在植物種子中的含量很低，即使在用于提取維生素e的各油料作物種子中的含量也很低，僅為7％-20％，而 其生物合成前體γ-生育酚的含量可占總生育酚含量的50-70％。因此大幅度提高植物特別是油料作物中高活性α-生育酚的含量，改變其所占比例將會為改良作物品質(zhì)、提高其農(nóng)業(yè)附加值帶來啟示，具有良好的社會和經(jīng)濟效益。

研究植物維生素e合成途徑發(fā)現(xiàn)，通過甲基轉(zhuǎn)移作用將其前體γ-生育酚轉(zhuǎn)化為α-生育酚的γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-tmt)可提高α-生育酚的含量和比例，可使植物中的α-生育酚的含量由原來的10％提高到90％以上，由此可使植物中維生素e的生理活性大大提高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本申請的目的在于把gmtmt基因通過基因槍方法轉(zhuǎn)化到玉米中，獲得了一個富含α-生育酚的轉(zhuǎn)基因玉米株系，并確定了其旁側(cè)序列及特異性檢測方法。

本發(fā)明另一目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因玉米的pcr檢測方法和試劑盒。

1、將gmtmt基因構(gòu)建到pga1611載體，獲得了pga1611-gmtmt表達載體，啟動子為ubi，終止子為nos。

2、利用基因槍將gmtmt表達框和篩選基因表達框bar(來自pcambia3301載體)共轉(zhuǎn)化玉米，獲得轉(zhuǎn)基因玉米。

3、轉(zhuǎn)基因玉米中α-生育酚含量顯著提高。

4、獲得了gmtmt表達框在轉(zhuǎn)基因玉米插入位點的3’旁側(cè)序列。

5、根據(jù)插入位點的特異性基因組序列設(shè)計引物，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米株系的特異性檢測方法。特定的轉(zhuǎn)基因事件其旁側(cè)序列是特定的，因此，應(yīng)用旁側(cè)序列可以特異地檢測轉(zhuǎn)基因事件。如用包含至少部分旁側(cè)序列和至少部分外源插入片段的探針進行雜交，或設(shè)計用于特異性擴增包含至少部分旁側(cè)序列和至少部分外源插入片段的引物，進行pcr擴增，檢測特異條帶等?？梢愿鶕?jù)在5’旁側(cè)序列設(shè)計上游特異性引物，根據(jù)外源插入片段設(shè)計下游特異性引物，擴增特異性片段；或可以根據(jù)外源插入片段設(shè)計上游特異性引物，根據(jù)3’旁側(cè)序列設(shè)計下游特異性引物，擴增特異性片段。

6、本發(fā)明提供了上述引物、特異性檢測方法在制備檢測轉(zhuǎn)基因玉米試劑 盒中的應(yīng)用。

7、本發(fā)明提供了上述引物、特異性檢測方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過hi-tail-pcr擴增得到了轉(zhuǎn)基因玉米事件gt1的3’旁側(cè)序列，根據(jù)這該旁側(cè)序列的序列信息，設(shè)計pcr引物并建立針對gt1事件的鑒定方法，通過普通pcr擴增得到了新的即包含載體片段又包含玉米基因組信息的序列。本發(fā)明提供的旁側(cè)序列和引物適用于對轉(zhuǎn)基因玉米gt1(包括親本、雜種f1和后代)及其制品(包括植株、組織、種子及其制品)的檢測。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。附圖中：

圖1為表達載體p1611-gmtmt的載體圖譜；

圖2為轉(zhuǎn)基因玉米的pcr鑒定結(jié)果圖；

圖3為轉(zhuǎn)基因玉米中維生素e各組分的測定結(jié)果圖；

圖4為轉(zhuǎn)基因事件gt1的特異性pcr鑒定結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。

實施例1：pga1611-gmtmt表達載體構(gòu)建

以保存的pbi121-gmtmt質(zhì)粒dna作為模板，用引物進行pcr擴增全長的gmtmt基因(1062bp)。

1)引物序列如下：

gmtmt-pf：5’-ccaccatggccaccgtggtgaggatcc-3’；

gmtmt-pr：5’-cggggtaccccgttattcaggttttcgacatgt-3’。

2)pcr反應(yīng)條件：

在下游引物gmtmt-pr加有kpni酶切位點，使得擴增產(chǎn)物經(jīng)kpni酶切后，形成一個5′端為平末端，3′端為粘性末端的dna片段a。

植物表達載體pga1611先經(jīng)hindiii酶切后，用t4dna聚合酶補平，再用kpni酶切，形成一個一端為平末端、一端為粘性末端的載體片段b。將片段a和片段b進行連接反應(yīng)后，形成植物表達載體pga1611-gmtmt(圖1)。

實施例2：玉米遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建的pga1611-gmtmt和php17042-bar質(zhì)粒用smai和clai酶切，回收gmtmt基因表達盒片段與選擇標記bar基因表達盒片段(來自pcambia3301)，等摩爾混合用于微彈制備。

基因槍微彈制備方法：

1)吸取準備好的鎢粉(60mg/ml)200μl，放在旋渦器振蕩5min，使鎢粉均勻地分布。

2)在振蕩的同時，依次加入：20μl已純化dna(100ng/μl)、200μl2.5mcacl2和20μl0.1m亞精胺。

3)渦旋器上振蕩4min，靜止1min。

4)10000rpm離心30sec，棄上清。

5)加入200μl無水乙醇，超聲重懸。

6)重復(fù)步驟5。

7)吸取10μl放在載體膜中心。

微彈轟擊使用bio-rad公司的psd/1000hellium基因槍，氦氣壓力為650psi。轉(zhuǎn)化后的玉米愈傷轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中恢復(fù)2天后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基。

篩選培養(yǎng)基中加入basta作為選擇壓力，對被轉(zhuǎn)化的材料進行篩選培養(yǎng)，每兩周繼代一次。經(jīng)過兩個月的選擇培養(yǎng)后，抗性愈傷組織在選擇性培養(yǎng)基上生長迅速，顏色新鮮。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到再生培養(yǎng)基上，即可得到 成熟的胚狀體。將胚狀體放到ms培養(yǎng)基上生根，即得到再生玉米苗20株。

實施例3：轉(zhuǎn)基因玉米的檢測

3.1玉米基因組dna的提?。?/p>

1)試劑配制：玉米基因組dna提取buffer[tris-hcl(ph＝8.0)100mm；edta(ph＝8.0)50mm；sds2％；nacl100mm]；

2)取50～100mg植物材料，液氮中研磨成粉末。加入600μldna提取buffer，混勻后，置于65℃水浴半小時。

3)加入600μl酚：氯仿(v:v＝1:1)，顛倒混勻，10000rpm離心10min。

4)轉(zhuǎn)移上清450μl至干凈1.5ml離心管中，加入450μl異丙醇，顛倒混勻，10000rpm離心10min。

5)棄上清，75％乙醇洗滌沉淀，干燥后溶于40μl滅菌水中。

6)電泳檢測dna質(zhì)量。

3.2pcr鑒定：

1)pcr引物序列：

gmtmt-fw:5’-taacatggtgccacagggat-3’；

nos-70：5’-ccggcaacaggattcaatctta-3’；

2)pcr反應(yīng)條件：

共獲得pcr陽性植株9株(圖2)。

實施例4：轉(zhuǎn)基因玉米α-生育酚含量測定

4.1玉米種子生育酚的提?。?/p>

1)取轉(zhuǎn)基因玉米種子5-10粒，用研磨儀研磨成粉末后，取100mg粉末至1.5ml離心管中，冰浴10min。

2)加入600μl新配制的甲醇：氯仿溶液(v:v＝2:1)，顛倒混勻。

3)加入200μl氯仿，混勻。

4)加入250μl超純水，顛倒混勻，12000rpm，4℃離心20min。

5)吸取下層有機相溶液至新的1.5ml離心管中，用氮氣吹干或于干燥器中真空抽干。

6)溶于200μl甲醇中，過濾后測定。

4.2采用高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,hplc)檢測，測定條件為如下：

1)機器型號：島津lcms2010a型hplc；柱子型號：安捷倫tc-c18反相柱(4.6250mm)；流動相a：甲醇，b：二氯甲烷；流速0.8ml/min；

2)檢測器型號：prominencespd-20a/20avuv-vis；吸收波長：298nm；檢測波長：325nm。

3)樣品上樣量20μl。α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚標準樣品濃度為10ng/μl，上樣體積為10μl。

結(jié)果表明與未轉(zhuǎn)基因的對照相比，轉(zhuǎn)gmtmt玉米種子中的α-生育酚含量提高了1～2倍(圖3)。

實施例5：轉(zhuǎn)基因玉米旁側(cè)序列分離鑒定

通過hi-tailpcr分析旁側(cè)序列，引物設(shè)計原則：隨機簡并引物(ad)為32或33個堿基，3′端為aggtg和tacg，起到控制擴增片段平均大小在914bp和727bp的作用。ad引物包含6個簡并引物(簡并度為4096)。簡并堿基5′端為一個hindiii酶切位點，便于克隆。5′端為一個tm值為52℃的16堿基序列，和引物ac序列一致。引物sp1、sp2和sp3為目的基因終止子序列上的一套嵌套引物，tm值均要大于68℃。

5.1用于hi-tailpcr的引物如下：

ad1:5’-acgatggactccagagaagcttnnnnnnaggtg-3’；

ad2:5’-acgatggactccagagaagcttnnnnnntacg-3’；

ac:5’-acgatggactccagag-3’；

nos-sp1:5’-gattgaatcctgttgccggtcttgc-3’；

nos-sp2:5’-acgatggactccagtccggcccctgttgccggtcttgcg atga-3’；

nos-sp3:5’-tgattagagtcccgcaattatacatttaatacgc-3’。

5.2pcr方法如下：

hi-tailpcr包括三輪巢式pcr，即預(yù)擴增(pre-amplification)、第一輪擴增(primarytail-pcr)和第二輪擴增(secondarytail-pcr)。首先用ad1或ad2同sp1進行預(yù)擴增，最初模板濃度為50ng/μl。然后將預(yù)擴增的產(chǎn)物稀釋40倍后，取2μl進行第一輪擴增，所用引物為ac和sp2。最后，再將primarytail-pcr的產(chǎn)物稀釋10倍，取2μl進行第二輪擴增，所用引物為ac和sp3。

5.3pcr體系如下：

5.4pcr程序及擴增條件如下：

1)預(yù)擴增條件

94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，60℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，10個循環(huán)；94℃變性20秒，58℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，20個循環(huán)；72℃延伸5分鐘。

2)第一輪擴增條件

94℃變性20秒，65℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，1個循環(huán)；94℃變性20秒，68℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，94℃變性20秒，68℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，94℃變性20秒，50℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，13個循環(huán)；72℃延伸5分鐘。

3)第二輪擴增條件

94℃變性20秒，68℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，94℃變性20秒，68℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，94℃變性20秒，50℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，7個循環(huán)；72℃延伸5分鐘。

獲得特異性的pcr條帶后，直接回收進行測序，獲得了gt1轉(zhuǎn)基因事件的第一旁側(cè)序列(序列4)。該3’端旁側(cè)dna的核苷酸序列具體如下：

aatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattaaactatcagtgtttaattagctatcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtaccgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgacagatcccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttctgcgggcgatttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcg

其中小寫字母為表達框中的nos終止子序列，包括第1-262共262bp的核苷酸序列；大寫字母為插入位點附近的玉米基因組序列，包括第263-786共524bp的核苷酸序列。

另外，本發(fā)明還包括獲得了gt1轉(zhuǎn)基因事件的第二旁側(cè)序列(序列3)，該3’端旁側(cè)dna的核苷酸序列具體如下：

gtcatctatgttactagatcgggaattaaactatcagtgt；

其中小寫字母為表達框中的nos終止子的部分序列，包括第1-20共20bp的核苷酸序列；大寫字母為插入位點附近的玉米基因組序列，包括第21-40共20bp的核苷酸序列。

本發(fā)明還包括獲得了gt1轉(zhuǎn)基因事件的第三旁側(cè)序列(序列2)，該3’端旁側(cè)dna的核苷酸序列具體如下：

ctatgttactagatcgggaattaaactatc；

其中小寫字母為表達框中的nos終止子的部分序列，包括第1-15共15bp的核苷酸序列；大寫字母為插入位點附近的玉米基因組序列，包括第16-30共15bp的核苷酸序列。

本發(fā)明還包括獲得了gt1轉(zhuǎn)基因事件的第四旁側(cè)序列(序列1)，該3’端旁側(cè)dna的核苷酸序列具體如下：

tgttactagatcgggaattaaact；

其中小寫字母為表達框中的nos終止子的部分序列，包括第1-12共12bp的核苷酸序列；大寫字母為插入位點附近的玉米基因組序列，包括第13-24共12bp的核苷酸序列。

實施例6：轉(zhuǎn)基因玉米特異性pcr鑒定

將實施例5中獲得的特異的pcr條帶，直接回收進行測序，如果測序結(jié)果與上述序列1～4中任意一項吻合，則說明存在本發(fā)明的特異性轉(zhuǎn)基因玉米事件gt1；如果測序結(jié)果與上述序列1～4都不吻合，則說明不存在本發(fā)明的特異性轉(zhuǎn)基因玉米事件gt1。

或者，根據(jù)獲得的第一旁側(cè)序列(序列4)設(shè)計引物，進行pcr檢測，可獲得特異性pcr片段，擴增片段大小為438bp。

6.1引物序列如下：

nosfw：5’-atgattagagtcccgcaattatac-3’；

gt1rv：5’-gggatctgtcgatcgacaag-3’。

6.2pcr體系如下：

6.3pcr反應(yīng)條件：

可獲得特異性的pcr片段(圖4)

本實施例中檢測轉(zhuǎn)基因玉米事件gt1的方法對于轉(zhuǎn)基因玉米gt1外源插入片段旁側(cè)序列的鑒定，適用于富含α-生育酚的轉(zhuǎn)基因玉米gt1(包括親本、雜種f1和后代)及其制品(包括植株、組織、種子及其制品)的檢測。

顯然，上面描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。