核酸和檢測轉(zhuǎn)基因水稻b2a68及其衍生系的方法以及試劑盒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種核酸，該核酸為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的旁側(cè)序列所示的核酸。本發(fā)明還提供了一種檢測轉(zhuǎn)基因水稻的方法，該方法包括：（1）使用針對如上所述的核酸的特異性引物，對取自待測水稻的核酸樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物；（2）檢驗(yàn)所述PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物中是否含有所述特異性引物產(chǎn)生的特異性目的片段；如果所述PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物中含有所述特異性引物產(chǎn)生的特異性目的片段，則指示所述待測水稻為所述轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者含有該核酸的衍生系。本發(fā)明還提供了一種試劑盒及該試劑盒的用途。通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明成功地實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者含有該核酸的衍生系的檢測。
【專利說明】核酸和檢測轉(zhuǎn)基因水稻B2A68及其衍生系的方法以及試劑盒及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種核酸、一種檢測轉(zhuǎn)基因水稻的方法、一種試劑盒以及該試劑盒在檢測轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻(Oryza sativa L.)作為世界上最重要的糧食作物之一，人們對其遺傳轉(zhuǎn)化和育種利用等方面進(jìn)行了深入細(xì)致的研究。我國在水稻轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域取得了一系列重大成果，很多轉(zhuǎn)基因水稻品種已被獲準(zhǔn)進(jìn)行環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗(yàn)，2009年轉(zhuǎn)Bt基因抗螟蟲水稻“華恢I號”和“Bt汕優(yōu)63”獲得生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，標(biāo)志著我國轉(zhuǎn)基因水稻具備了商業(yè)化生產(chǎn)的基本條件。為了平衡貿(mào)易利益、滿足公眾關(guān)切、控制潛在風(fēng)險(xiǎn)、加強(qiáng)工商監(jiān)管，許多國家相繼建立了轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的安全評價(jià)和標(biāo)識制度。我國現(xiàn)行對于農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的管理依據(jù)的是國務(wù)院2001年5月23日頒布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，以及農(nóng)業(yè)部2002年I月5日發(fā)布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》3個(gè)配套規(guī)章。為了實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的標(biāo)識管理，保障轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的有效監(jiān)管和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，對轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的準(zhǔn)確度和靈敏度提出了嚴(yán)格要求。
[0003]轉(zhuǎn)基因植物中外源基因在染色體上插入位置的旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)基因植物品系最重要的分子特征之一，是區(qū)別不同轉(zhuǎn)化事件的唯一性標(biāo)識，是建立轉(zhuǎn)基因植物品系特異性檢測方法的重要技術(shù)資料。目前已有專利和文獻(xiàn)報(bào)道了多個(gè)作物轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體的檢測方法，如:張大兵等(2006)建立 了轉(zhuǎn)基因玉米M0M863的品系特異性檢測方法；盧長明等(2007)擴(kuò)增出了轉(zhuǎn)基因油菜Rfl外源插入載體旁側(cè)序列并建立了該轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法；謝家建等(2007)利用Tail-PCR、Genome walking和LD-PCR等方法獲得了轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻、Bt汕優(yōu)63和科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列，并建立了品系特異性的檢測方法。
[0004]利用密碼子優(yōu)化的Cry2Aa#基因和Bar基因轉(zhuǎn)化水稻，可以獲得抗螟蟲、抗除草劑水稻(參考專利申請“密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因與重組載體以及改變作物抗性的方法”，專利申請?zhí)?01210280832.4)。既抗除草劑、又抗螟蟲的轉(zhuǎn)基因水稻將在生產(chǎn)上發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的發(fā)明人通過密碼子優(yōu)化的Cry2Aa#基因和Bar基因轉(zhuǎn)化水稻，獲得了一個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻新品系B2A68。然而，由于轉(zhuǎn)化事件具有隨機(jī)性，所以轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68的外源基因在基因組中插入位置并不清楚、確定。因此，難以實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68的特異性檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種核酸及檢測含有該核酸的轉(zhuǎn)基因水稻品系的方法。
[0006]轉(zhuǎn)基因水稻新品系B2A68已經(jīng)在文獻(xiàn)(雜交水稻，2013，28 (I):63-67)中公開，可以通過向中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所來函索取的方式獲得，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所保證從本發(fā)明的申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放轉(zhuǎn)基因水稻新品系B2A68。
[0007]由于外源基因的隨機(jī)插入，導(dǎo)致外源基因插入在水稻基因組同一位置的機(jī)會幾乎沒有，所以外源基因序列與水稻基因組序列拼接而成的旁側(cè)序列具有唯一性。因此，旁側(cè)序列的核酸是一種全新的核酸分子，本發(fā)明的發(fā)明人得到了轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68的旁側(cè)序列的具體序列信息，由此建立的檢測方法是檢測轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68及其含有該核酸衍生系的特異性方法。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種核酸，該核酸為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的旁側(cè)序列所示的核酸，所述轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的旁側(cè)序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段，SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段；其中，SEQ ID N0.1的片段至少包括SEQ IDN0.1的第100-141位的序列，優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.1的第90-151位的序列，更優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.1的第80-161位的序列；SEQ ID N0.6的片段至少包括SEQ ID N0.6的第1520-1561位的序列，優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.6的第1510-1571位的序列，更優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.6的第1500-1581位的序列。
[0009]另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測轉(zhuǎn)基因水稻的方法，該轉(zhuǎn)基因水稻為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者含有如上所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的衍生系，該方法包括:
[0010](I)使用針對如上所述的核酸的特異性引物，對取自待測水稻的核酸樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物；
[0011](2)檢驗(yàn)所述PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物中是否含有所述特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)生的特異性目的片段；如果所述PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物中含有所述特異性目的片段，則指示所述待測水稻為所述轉(zhuǎn)基因水稻B2A68 或者由B2A68雜交產(chǎn)生的含有該核酸片段的衍生系。
[0012]另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包括右側(cè)特異性引物和/或左側(cè)特異性引物，優(yōu)選的，所述右側(cè)特異性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQ IDN0.17所示的核酸；所述左側(cè)特異性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQ ID N0.19所示的核酸。
[0013]另一方面，本發(fā)明還提供了如上所述的試劑盒在檢測轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者含有如上所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的衍生系中的用途。
[0014]通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明成功地實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者由B2A68雜交產(chǎn)生的含有該核酸片段的衍生系的檢測。
[0015]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的【具體實(shí)施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0017]圖1為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68所用載體的T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)及引物位置示意圖。
[0018]圖2為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68通過hiTail_PCR擴(kuò)增得到的T-DNA右邊界側(cè)的旁側(cè)序列片段電泳圖。M:lKb plus DNA marker ;1、3、5:B2A68 二級擴(kuò)增產(chǎn)物;2、4、6:B2A68 三級擴(kuò)增產(chǎn)物；7:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅68 二級擴(kuò)增產(chǎn)物；8:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅68三級擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0019]圖3為通過LD-PCR方法獲得的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68中T-DNA左邊界側(cè)的旁側(cè)序列片段電泳圖。M:lKb plus DNA marker ；Ck:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅68 ;1_11:轉(zhuǎn)基因水稻B2A68。[0020]圖4為外源片段在水稻染色體上插入位點(diǎn)及其上下游基因分布圖。
[0021]圖5為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68中T-DNA右邊界側(cè)的旁側(cè)序列特異性引物RB-2F/RB-2R檢測電泳圖。M:1Kb plus DNA marker ；B:空白對照;1、3、5、7、9:轉(zhuǎn)基因水稻B2A68、CD083、B2A4008S、BE7001S、B88S ;2、4、6、8、10:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?D68、吉梗 88、4008S、7001S、P88S。
[0022]圖6為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68中T-DNA右邊界側(cè)的旁側(cè)序列特異性引物L(fēng)B-2F/LB-2R檢測電泳圖。M:1Kb plus DNA marker ；B:空白對照;1、3、5、7、9:轉(zhuǎn)基因水稻B2A68、CD083、B2A4008S、EB7001S、B88S ;2、4、6、8、10:非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?D68、吉梗 88、4008S、7001S、P88S。
[0023]圖7為右邊界特異性引物退火溫度優(yōu)化結(jié)果。M:1Kb plus DNA marker ；1:52.0°C；2:52.2°C ；3:52.8°C ；4:53.6°C ；5:54.5°C ；6:55.5°C ；7:56.5°C ；8:57.5°C ；9:58.4°C ；10:59.20C ；11:59.80C ；12:60.(TC。
[0024]圖8為左邊界特異性引物退火溫度優(yōu)化結(jié)果。M:1Kb plus DNA marker ；1:52.0°C；2:52.2°C ；3:52.8°C ；4:53.6°C ；5:54.5°C ；6:55.5°C ；7:56.5°C ；8:57.5°C ；9:58.4°C ；10:59.20C ；11:59.80C ；12:60.(TC。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0026] 本發(fā)明提供了一種核酸，該核酸為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的旁側(cè)序列所示的核酸，所述轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的旁側(cè)序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段，SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段；其中，SEQ ID N0.1的片段至少包括SEQ ID N0.1的第100-141位的序列，優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.1的第90-151位的序列，更優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.1的第80-161位的序列；SEQ ID N0.6的片段至少包括SEQ ID N0.6的第1520-1561位的序列，優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.6的第1510-1571位的序列，更優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.6的第1500-1581位的序列。
[0027]本發(fā)明還提供了一種檢測轉(zhuǎn)基因水稻的方法，該轉(zhuǎn)基因水稻為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者由轉(zhuǎn)基因水稻B2A68雜交產(chǎn)生的含有如上所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的衍生系，該方法包括:
[0028](I)使用針對如上所述的核酸的特異性引物，對取自待測水稻的核酸樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物；
[0029](2)檢驗(yàn)所述PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物中是否含有所述特異性引物擴(kuò)增所產(chǎn)生的特異性目的片段；如果所述PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物中含有所述特異性目的片段，則指示所述待測水稻為所述轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者由B2A68雜交產(chǎn)生的含有該核酸片段的衍生系。
[0030]根據(jù)權(quán)本發(fā)明的方法，其中，所述針對SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段的特異性引物是指能夠僅擴(kuò)增SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段所示的核酸的引物，所述針對SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段的特異性引物不能夠擴(kuò)增SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段所示的核酸以外的核酸，優(yōu)選地，所述針對SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.1的片段的特異性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQ ID N0.17所示的核酸；所述特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)生的目的片段的長度為307bp。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述特異性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQID N0.17所示的核酸時(shí)，優(yōu)選情況下，PCR擴(kuò)增的條件可以包括退火溫度為55-60°C。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述針對SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段的特異性引物是指能夠僅擴(kuò)增SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段所示的核酸的引物，所述針對SEQID N0.6或SEQ ID N0.6的片段的特異性引物不能夠擴(kuò)增SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.6的片段所示的核酸以外的核酸，優(yōu)選地，所述特異性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQID N0.19所示的核酸；所述特異性引物的目的片段的長度為521bp。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述特異性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQID N0.19所示的核酸時(shí)，優(yōu)選情況下，PCR擴(kuò)增的條件包括退火溫度為52-58°C (圖8)。
[0034]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包括右側(cè)特異性引物和/或左側(cè)特異性引物，其中，所述右側(cè)特異性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQ ID N0.17所示的核酸；所述左側(cè)特異性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQ ID N0.19所示的核酸。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照核酸，所述陽性對照核酸包括SEQ ID N0.1所示的核酸和/或SEQ ID N0.6所示的核酸。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、PCR緩沖液和耐高溫DNA聚合酶。
[0037]本發(fā)明還提供了如上所述的試劑盒在檢測轉(zhuǎn)基因水稻B2A68及由轉(zhuǎn)基因水稻B2A68雜交產(chǎn)生含有如上所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的衍生系中的用途。 [0038]轉(zhuǎn)基因水稻B2A68所用載體的T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)及引物位置見圖1，該載體由Cry2Aa#基因表達(dá)框和Bar基因表達(dá)框組成。本發(fā)明采用常規(guī)方法提取植物基因組DNA。利用hiTail-PCR和LD-PCR方法，分離并延伸得到T-DNA右邊界側(cè)的旁側(cè)序列，如SEQ IDN0.1所示，長度1975bp。利用LD-PCR方法分離得到的T-DNA左邊界側(cè)的旁側(cè)序列，如SEQID N0.6 所示，長度 2856bp。
[0039]通過分析SEQ ID N0.1發(fā)現(xiàn)，其中第I至第120位序列與所用載體右邊界上游序列完全一致，說明是外源基因序列，第121至第1975位序列與已發(fā)表的水稻基因組第3號染色體上序列(NCBI登錄號AC133450.6) 一致，說明是轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的基因組序列。通過分析SEQ ID N0.6發(fā)現(xiàn)，其第I至第1541位序列與水稻3號染色體上的發(fā)表序列(AC133450.6)高度匹配，說明是轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的基因組序列，第1542至第2856位與載體左邊界及CaMV35S終止子、Bar基因序列及35S啟動子部分序列完全相同，說明是外源基因序列。
[0040]根據(jù)T-DNA右旁側(cè)序列(SEQ ID N0.1)設(shè)計(jì)特異性引物，其中一條引物根據(jù)SEQID N0.1中第I至第120位序列設(shè)計(jì)，即是按照T-DNA右邊界區(qū)域序列設(shè)計(jì)，另一條引物根據(jù)第121至第1975位序列設(shè)計(jì)，即按照插入位點(diǎn)旁邊的水稻基因組序列設(shè)計(jì)。優(yōu)選的，本發(fā)明采用的正向引物為RB-2F，序列如SEQ ID N0.16所示(5，-CCAACTTAATCGCCTTGC-3’)，反向引物為RB-2R，序列如SEQ ID N0.17所示(5，-GGGTTCCAATCTTGTGCC-3，)，利用該引物對進(jìn)行PCR檢測，只有轉(zhuǎn)基因水稻B2A68能獲得長度為307bp的特異條帶。
[0041]根據(jù)T-DNA左旁側(cè)序列(SEQ ID N0.6)設(shè)計(jì)特異性引物，其中一條引物根據(jù)SEQ IDN0.6中第I至第1541位序列設(shè)計(jì)，即是按照T-DNA左邊界區(qū)域序列設(shè)計(jì)，另一條引物根據(jù)第1542至第2856位序列設(shè)計(jì)，即參照插入位點(diǎn)旁邊的水稻基因組序列設(shè)計(jì)。優(yōu)選的，本發(fā)明采用的正向引物為 LB-2F，序列如 SEQ ID N0.18 所示(5，-ACATTTCATCCAGCAGCAGA-3’)，反向引物為 LB-2R，序列如 SEQ ID N0.19 所示(5，-CCAGATAAGGGAATTAGGGT-3’)，利用該引物對進(jìn)行PCR檢測，只有轉(zhuǎn)基因水稻B2A68能獲得長度為521bp的特異條帶。
[0042]本發(fā)明首次獲得了轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68的插入外源基因的左、右旁側(cè)序列，并且利用這兩個(gè)旁側(cè)序列建立了靈敏、特異性的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的品系特異性定性PCR檢測方法。本發(fā)明所建立的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68特異性PCR檢測方法可以進(jìn)一步應(yīng)用于特異性檢測試劑盒的開發(fā)，以對轉(zhuǎn)基因活體(植株、種子)、產(chǎn)品、提取物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)含量樣品的設(shè)置，還可實(shí)現(xiàn)定量檢測和定量檢測試劑盒的開發(fā)。
[0043]本發(fā)明可以采用如下技術(shù)方案:
[0044]I)獲得右旁側(cè)序列
[0045]轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的外源基因在水稻染色體插入位置的右旁側(cè)序列，所述T-DNA右邊界側(cè)的旁側(cè)序列，其特征在于:所述右旁側(cè)序列如SEQ ID N0.1所示。
[0046]首先，通過hiTail-PCR擴(kuò)增得到右旁側(cè)序列的部分序列，如SEQ ID N0.2所示，全長59Ibp。hiTail-PCR所用特異性嵌套引物依據(jù)植物表達(dá)載體pC3300-Cry2Aa#的T-DNA序列右邊界(RB)上游IacZ基因序列設(shè)計(jì)。植物表達(dá)載體pC3300_Cry2Aa#的資料參考專利(201210280832.4)。hiTail-PCR 方法參考文獻(xiàn)(Liu et al., 2007, B1Techniques, 43(5):649-456),其中=Rb-Ob 序列為 5，-CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT-3’，Rb-1b 序列為 5’ -ACGATGGAC TCCAGAGCGGCCGCCGACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATC-3’，Rb_2b 序列為5’ -GAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTT-3’。hiTail-PCR 擴(kuò)增獲得 591bp 長的片斷。
[0047]通過分析發(fā)現(xiàn)其中第I至第120位核苷酸序列與所用載體右邊界序列完全一致；第121至第591位序列與水稻基因組第3號染色體上NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)登錄號為AC133450.6的序列的第36171至第36641位完全匹配。
[0048]其次，利用SEQ ID N0.2所示的序列設(shè)計(jì)引物RBGF，序列如SEQ ID N0.3所示(5’ -TCGGCACAAGATTGGAAC-3’)，參考水稻基因組序列(NCBI登錄號AC133450.6)設(shè)計(jì)引物RBGR,序列如 SEQ ID N0.4 所示(5，-TGCAGTTGAGGTCGGTGT-3’)，利用 RBGF 和 RBGR 引物對PCR擴(kuò)增得到1740bp的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的基因組序列，如SEQ ID N0.5所示，該序列與網(wǎng)上所列的粳稻序列(AC133450.6)相同。
[0049]然后，把兩次擴(kuò)增獲得的兩個(gè)序列SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.5拼接得到右旁側(cè)序列SEQ ID N0.1，該序列全長1975bp，包含第I至第120位的外源基因序列(載體序列)與第121至第1975位的水稻基因組序列。
[0050]2)獲得左旁側(cè)序列
[0051]在本發(fā)明中，還提供了轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的外源基因在水稻染色體插入位置的左旁側(cè)序列，所述T-DNA左邊界側(cè)的旁側(cè)序列，其特征在于:所述左旁側(cè)序列如SEQ ID N0.6所示。
[0052]首先，所述左旁側(cè)部分序列，如SEQ ID N0.7所示，它通過LD-PCR擴(kuò)增得到，全長925bp。具體方法為:參照已公布的該位點(diǎn)上游水稻基因組序列設(shè)計(jì)正向引物L(fēng)B-1F，序列如SEQ ID N0.8所示(5，-GGCGTCACGTTTGTTGTT-3’)，根據(jù)T-DNA左邊界序列設(shè)計(jì)反向引物L(fēng)B-1R，序列如SEQ ID N0.9所示(5’-CTGCCCGTCACCGAGATT_3)，用該引物對擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的部分左旁側(cè)序列，如SEQ ID N0.7所示，長度為925bp。通過分析SEQ ID N0.7發(fā)現(xiàn)，除了第612位與水稻3號染色體第36169位相比有一個(gè)A堿基缺失外，其余第I至第613位與水稻第3號染色體上第35557-第36170位完全匹配；第614位至第925位與載體pC3300-Cry2Aa#的左邊界及CaMV35S終止子部分序列完全相同。
[0053]其次，參考已公布水稻基因組序列(NCBI登錄號AC133450.6)設(shè)計(jì)引物L(fēng)BGF，序列如 SEQ ID N0.10 所示(5，-TAAACTGTTAGGCGGTGGA-3’)，利用 SEQ ID N0.7 序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)BGR，序列如 SEQ ID N0.11 所示(5，-TCGTGGAAATTGTGAGGG-3’)，利用 LBGF 和 LBGR 引物對PCR擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的基因組序列，序列如SEQID N0.12所示，全長1113bp。
[0054]再次，利用SEQ ID N0.7序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)BTF，序列如SEQ ID N0.13所示(5’ -CCCTTATCTGGGAACTACTCAC-3’)，利用載體pC3300_Cry2Aa# 上 35S 啟動子序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)BTR，序列如 SEQ ID N0.14 所示(5，-TAACATGGTGGAGCACGACA-3’)，利用 LBTF 和 LBTR 引物對PCR擴(kuò)增得序列，該序列如SEQ ID N0.15所示，該序列與載體pC3300_Cry2Aa#的相應(yīng)序列相同，全長1068bp。
[0055]最后，將SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.15拼接得到左邊界旁側(cè)序列，序列如SEQ ID N0.6所示，全長2856bp。其中第I至第1541位為水稻基因組序列，第1542位至第2856位為外源基因序列(載體序列)。
[0056]3)基于右旁側(cè)序列的B2A68轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法
[0057]轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68的外源插入片段的右旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于:所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為T-DNA右邊界的旁側(cè)序列的特異性引物:一條引物依據(jù)SEQ ID N0.1中第I至第120位序列設(shè)計(jì)，另一條引物依據(jù)SEQ ID N0.1中第121至第1975位序列設(shè)計(jì)。
[0058]優(yōu)選地，所述特異性引物如下:
[0059]正向引物RB-2F，序列如 SEQ ID N0.16 所示(5，-CCAACTTAATCGCCTTGC-3’)，依據(jù)SEQ ID N0.1中第I至第120位序列設(shè)計(jì)；
[0060]反向引物RB-2R，序列如 SEQ ID N0.17 所示(5，-GGGTTCCAATCTTGTGCC-3’)，依據(jù)SEQ ID N0.1中第121至第1975位序列設(shè)計(jì)；
[0061]利用上述引物對進(jìn)行擴(kuò)增，轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68能獲得長度為307bp的目的片段，非轉(zhuǎn)基因水稻及非該轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因水稻不能獲得目的片斷或大小相同的目的片斷。
[0062]4)基于左旁側(cè)序列的B2A68轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法
[0063]轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68的外源插入片段的左旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于:所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為T-DNA左邊界旁側(cè)序列的特異性引物:一條引物依據(jù)SEQ ID N0.6中第I至第1541位序列設(shè)計(jì)，另一條引物依據(jù)SEQ ID N0.6中第1542至第2856位序列設(shè)計(jì)。
[0064]優(yōu)選地，所述特異性引物如下:
[0065]正向引物L(fēng)B-2F，序列如 SEQ ID N0.18:所示(5，-ACATTTCATCCAGCAGCAGA-3’)，依據(jù)SEQ ID N0.6中第I至第1541位序列設(shè)計(jì)；
[0066]反向引物L(fēng)B-2R，序列如 SEQ ID N0.19:所示(5，-CCAGATAAGGGAATTAGGGT-3’)，依據(jù)SEQ ID N0.6第1542至第2856位序列設(shè)計(jì)；
[0067]利用上述引物對進(jìn)行擴(kuò)增，轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68能獲得長度為521bp的目的片段，非轉(zhuǎn)基因水稻及非該轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因水稻不能獲得目的片斷或大小相同的目的片斷。
[0068]5)基于左、右旁側(cè)序列的多重PCR檢測方法
[0069]依據(jù)SEQ ID N0.1中第I至第120位序列設(shè)計(jì)I個(gè)特異性引物，依據(jù)SEQ ID N0.1中第121至第1975位序列設(shè)計(jì)I個(gè)特異性引物，獲得右旁側(cè)序列的I個(gè)特異性引物對；依據(jù)SEQ ID N0.6中第I至第1541位序列設(shè)計(jì)I個(gè)特異性引物，依據(jù)SEQ ID N0.6中第1542至第2856位序列設(shè)計(jì)I個(gè)特異性引物，獲得左旁側(cè)序列的I個(gè)特異性引物對；以這2個(gè)特異性引物對同時(shí)擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA，同時(shí)獲得左、右邊界的2條目標(biāo)特異帶。
[0070]優(yōu)選的，以特異性引物L(fēng)B-2F、LB-2R、RB-2F和RB-2R對待測樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)基因水稻B2A68擴(kuò)增獲得521bp和307bp的2條目的片段，其它所有水稻不會獲得條帶或者上述相同大小的目標(biāo)條帶。
[0071]以下，通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件進(jìn)行，例如《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0072]實(shí)施例1:轉(zhuǎn)基因水稻品系B2A68右邊界旁側(cè)序列的擴(kuò)增
[0073]1.DNA的提取:CTAB法(王關(guān)林等，植物基因工程，北京:科學(xué)出版社，2009)。取
2.0yL DNA用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用微量紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度。 [0074]2.hiTail-PCR 分離 T-DNA 右旁側(cè)序列:參照 Liu 等(Liu et al., 2007, B1Techniques，43 (5):649-456)的方法進(jìn)行，每個(gè)隨機(jī)引物對重復(fù)擴(kuò)增三次。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離。所用引物序列見表1，擴(kuò)增程序見表2。
[0075]表1:hiTail_PCR 所用引物
[0076]
【權(quán)利要求】
1.一種核酸，該核酸為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的旁側(cè)序列所示的核酸，所述轉(zhuǎn)基因水稻B2A68 的旁側(cè)序列為 SEQ ID N0.1 或 SEQ ID N0.1 的片段，SEQ ID N0.6 或 SEQ ID N0.6 的片段；其中，SEQ ID N0.1的片段至少包括SEQ ID N0.1的第100-141位的序列，優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.1的第90-151位的序列，更優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.1的第80-161位的序列；SEQ ID N0.6的片段至少包括SEQ ID N0.6的第1520-1561位的序列，優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.6的第1510-1571位的序列，更優(yōu)選至少包括SEQ ID N0.6的第1500-1581位的序列。
2.一種檢測轉(zhuǎn)基因水稻的方法，該轉(zhuǎn)基因水稻為轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者含有權(quán)利要求1所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的衍生系，該方法包括: (O使用針對權(quán)利要求1所述的核酸的特異性引物，對取自待測水稻的核酸樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物； (2)檢驗(yàn)所述PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物中是否含有所述特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)生的特異性目的片段；如果所述PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物中含有所述特異性目的片段，則指示所述待測水稻為所述轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者含有權(quán)利要求1所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的衍生系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述特異性引物包括SEQID N0.16所示的核酸和SEQ ID N0.17所示的核酸；所述特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)生的目的片段的長度為307bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，PCR擴(kuò)增的條件包括退火溫度為55-60°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述特異性引物包括SEQID N0.18所示的核酸和SEQ ID N0.19所示的核酸；所述特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)生的目的片段的長度為521bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，PCR擴(kuò)增的條件包括退火溫度為52-58°C。
7.一種試劑盒，該試劑盒包括右側(cè)特異性引物和/或左側(cè)特異性引物，其中，所述右側(cè)特異性引物包括SEQ ID N0.16所示的核酸和SEQ ID N0.17所示的核酸；所述左側(cè)特異性引物包括SEQ ID N0.18所示的核酸和SEQ ID N0.19所示的核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括陽性對照核酸，所述陽性對照核酸包括SEQ ID N0.1所示的核酸和/或SEQ ID N0.6所示的核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括dNTPs、PCR緩沖液和耐高溫DNA聚合酶。
10.權(quán)利要求7-9中任意一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測轉(zhuǎn)基因水稻B2A68或者含有權(quán)利要求I所述的核酸的轉(zhuǎn)基因水稻B2A68的衍生系中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK104031912SQ201310068126
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月4日
【發(fā)明者】肖國櫻, 蔣利平, 翁綠水 申請人:中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所