專利名稱：核酸錯配檢測的制作方法
技術領域：
[1]本發(fā)明屬于核酸化學領域，尤其是進行核酸分析的電化學技術領域。
背景技術：
[2]DNA的導電性可用于發(fā)展DNA生物傳感器，即所謂的“DNA芯片”(Bixon等，1999；Schena等，1996；Fodor等，1993)。DNA芯片的形式之一由以陣列形式附著于表面上的單鏈DNA探針構成。靶DNA可采用熒光標記物進行標記，并成功地與可利用熒光測定法進行檢測的單個探針雜交。相反，在電化學檢測方法中則可直接讀出測得的信號(Takagi，2001；Kelly等，1999)。電化學技術包括電勢步進計時安培分析法(potentialstep chronoamperometry)、整流循環(huán)伏安法(dc cyclic voltammetry)以及電化學阻抗法(electrochemical impedance)(Bard和Faulkner，2001)。電化學DNA傳感器可采用具有電化學活性的DNA結合藥物作為檢測標記物，如金屬配位絡合物Ru(bpy)32+(Carter和Bard，1987；Millan等，1994)、電活性染料(Hashimoto等，1994)、醌類(Kertesz等，2000；Ambroise和Maiya，2000)以及甲基藍(Tani等，2001；Kelley等，1997)等。在另外的情況下，也在溶液中使用簡單的氧化還原探針Fe(CN)63-/4-(Patolsky等，2001)。在某些這類技術中，靶DNA不需要事先標記。表面修飾的電極的電學特性可采用阻抗譜法(impedancespectroscopy)和通過等效電路模型化的數(shù)據(jù)進行檢測(Macdonald，1987)。例如，在美國專利US 6,556,001中公開了一種可供選擇的電化學阻抗譜學方法(這里引作參考)。近年來，對通過金屬表面自組裝的鏈烷硫醇單層的電子傳遞進行了深入研究(Ulman，1996)。經(jīng)過自組裝單層進行不均一性電子傳遞后，電極的阻抗通常在由Randles(Randles，1947)建立的模型的基礎上進行描述。雙鏈DNA包括一個堆疊的π鍵系統(tǒng)，天然DNA(B-DNA)的導電性曾引起了激烈的爭論。近來對其進行的直接測定顯示，B-DNA是一種帶隙(band gap)非常寬的半導體(Storm等，2001)；(Rakitin等，2001)；(Porath等，2000)；(Murphy等，1993)。將銀原子沿著DNA的長度方向上沉積可提高其導電性，但該過程基本上是不可逆的(Braun等，1998)。另一種可能性在于，在高于pH 8.5時通過添加二價金屬離子(Zn2+、Co2+以及Ni2+)，將B-DNA轉化成M-DNA(Lee等，1993)(Aich等，1999)。據(jù)稱，在M-DNA中金屬離子置換了每一堿基對中鳥嘌呤及胸腺嘧啶的亞胺質子，但通過將金屬離子與EDTA螯合，或者降低pH，其結構可被重新轉換成B-DNA。通過M-DNA的電子傳遞可通過在相反末端標記有供體及受體發(fā)色團的雙鏈的熒光光譜來進行監(jiān)測。當形成M-DNA時，而且僅僅當受體位于同一個DNA分子上時，供體的熒光才淬滅(Aich等，1999；Aich等，2002)。近來進行的直接監(jiān)測使人們確信，M-DNA顯示了類似金屬的導電性，并且當長度達到500個堿基對時，就可在雙鏈中觀察到電子傳遞(Rakitin等，2001)。因此，通過使DNA的狀態(tài)可直接進行電子閱讀，M-DNA在生物傳感器應用中是十分有用的。
發(fā)明概述[5]本發(fā)明在多個方面提供了電化學核酸分析的方法及裝置。一方面，本發(fā)明提供了用于阻抗譜學系統(tǒng)的硬件及軟件，其特征在于通過測定不同頻率的阻抗來描述核酸等聚合物。例如，硬件可提供以不同頻率輸入到樣品中的電壓及電流，并測定產(chǎn)生的阻抗。軟件可存儲多個樣品的等效電路(equivalent circuit)參數(shù)、控制硬件對樣品的輸入、顯示測定數(shù)據(jù)、顯示結果并在結果超出預設限度時通知操作員。在多個方面，本發(fā)明提供了檢測附著于(tethered to)電化學電路中的電極上的核酸雙鏈中堿基對錯配的方法。例如，許多核酸可在電極上形成核酸雙鏈單層。核酸可包括自然存在的單體，例如DNA和RNA，也可帶有合成的取代基，包括范圍廣泛的可作為選擇的單體單元。本發(fā)明的方法可包括下列步驟a)將電能施加到電化學電路中的電極上；b)收集與電路中電極上的核酸雙鏈阻抗有關的電化學電路數(shù)據(jù)；以及c)將電化學電路數(shù)據(jù)與電路模型進行擬合，以得出指示核酸雙鏈中堿基對錯配的電路性能信息(circuit performance information)。一個作為選擇的方面，本發(fā)明提供了檢測堿基對錯配的系統(tǒng)。例如，該系統(tǒng)可包括a)為電化學電路中的電極提供電能的裝置，如電源；b)用于收集與電路中的電極上的核酸雙鏈阻抗有關的電化學電路數(shù)據(jù)的裝置，如控制器；以及c)將電化學電路數(shù)據(jù)與電路模型擬合以獲得指示核酸雙鏈中堿基對錯配的電路性能信息的裝置，如分析儀。該系統(tǒng)還可包括顯示器或者用于顯示電路性能信息的裝置；和/或記錄儀或者用于記錄電路性能信息的裝置。例如，電路性能信息可以在尼奎斯特圖(Nyquist plot)上繪出。在一個備選實施方案中，收集電化學電路數(shù)據(jù)可包括測定阻抗譜(impedance spectra)，例如在頻域(frequency domain)中測得的阻抗譜。各種電化學電路參數(shù)提供了與核酸雙鏈阻抗有關的數(shù)據(jù)。例如，核酸或者單層的實際阻抗及虛擬阻抗與電化學參數(shù)有關，如華伯氏阻抗(Warburgimpedance)、單層的電容、電荷轉移阻抗以及電子傳遞率。這些參數(shù)還可用于從全部雙鏈DNA樣品中鑒別出錯配的DNA樣品。本發(fā)明的電化學電路數(shù)據(jù)可包括復阻抗(complex impedance)的測定值。在一些實施方案中，可將電能施加到阻抗譜學系統(tǒng)中，并且阻抗譜學系統(tǒng)可涉及在不連續(xù)的時段內(nèi)(discrete period)以恒定頻率及恒定振幅施加正弦信號。在一些選擇的實施方案中，電路模型可包括一些電路元件，例如溶液電阻Rs；電荷轉移電阻RCT；恒定相元件CPE；傳質元件W(華伯氏阻抗)；以及并聯(lián)電阻Rx；其中電路元件的排列如

圖1所示。在一些實施方案中，核酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)，并且核酸雙鏈可以是雙螺旋。在一些實施例中，核酸可包括含有金屬的核酸雙鏈M-DNA，其具有第一鏈核酸和第二鏈核酸，第一及第二核酸鏈包括多個通過主鏈共價連接的含氮芳香族堿基，第一核酸鏈的含氮芳香族堿基通過氫鍵與第二核酸鏈的含氮芳香族堿基結合，第一及第二核酸鏈上的含氮芳香族堿基形成氫鍵結合的堿基對，其沿著導電性的含金屬的核酸雙鏈的長度方向堆疊排列，氫鍵結合的堿基對包括一個內(nèi)部螯合(interchelated)的二價金屬陽離子，其與芳香族的含氮芳香族堿基之一中的氮原子形成配位鍵。本發(fā)明可涉及將第一核酸雙鏈的電路性能信息與第二核酸雙鏈的電路性能信息相比較。例如，第一核酸雙鏈可以是B-DNA，第二核酸雙鏈可以是含有金屬的核酸雙鏈M-DNA。例如，電化學電路可包括電解質水溶液(aqueous electrolyte)，并且核酸可以限制在并且溶劑化于電解質水溶液中。在該水溶液中可提供氧化還原探針。
附圖簡述[15]圖1圖示了B-DNA及M-DNA的等效電路模式。虛線框中的電路為標準Randles電路。Rs溶液阻抗；Rx通過DNA的電阻；Rct電荷轉移阻抗；CPE恒定相元件，WWarburg阻抗。圖2是金電極表面上的天然DNA(B-DNA)及金屬DNA(M-DNA)的模式圖。如圖所示，Zn2+離子可被認為是與M-DNA的外側結合以及插入到DNA螺旋中。圖3顯示了(a)裸露的金及(b)裝配于金電極上的20個堿基對的雙鏈B-DNA在4mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)、20mM NaClO4及20mM Tris-ClO4緩沖液(pH 8.6)中的伏安圖(voltammogram)，掃描速率為50mV/s。圖4顯示了(a)裸露的金、(b)裝配于金電極上的20個堿基對的雙鏈B-DNA以及(c)裝配于金電極上的20個堿基對的雙鏈M-DNA的XPS光譜。圖5顯示了以4mM Fe(CN)63-/4-(1∶1)混合物作為氧化還原探針，在20mM Tris-ClO4及20mM NaClO4溶液中，以Ag/AgCl為參比施加0.250V電壓的Nyquist圖(Zimvs Zre)。在所有情況下，在含有0.4mM Zn2+、pH 7.0(■)或者0.4mM Mg2+、pH8.6(□)時，測得的數(shù)據(jù)點均顯示為0，計算的與Randles電路-----或者修正的Randles電路——的擬合曲線為(A)裸露金電極，(B)裝配于金電極上的20個堿基對的雙鏈B-DNA，(C)裝配于金電極上的20個堿基對的雙鏈M-DNA，以及(D)裝配于金電極上的20個堿基對的雙鏈B-DNA。圖6顯示了不存在氧化還原探針時，(A)裝配于金電極表面上的20個堿基對的雙鏈B-DNA(□)，以及(B)裝配于金電極表面上的20個堿基對的雙鏈M-DNA(■)的Nyquist圖。其中將實驗數(shù)據(jù)與所示等效電路進行了擬合。圖7顯示了以Fe(CN)63-/4-作為氧化還原探針，15個堿基對的雙鏈單層為B-DNA(□)或者M-DNA(■)、20個堿基對的雙鏈單層為B-DNA(○)或者M-DNA(●)、以及30個堿基對的雙鏈單層為B-DNA(△)或者M-DNA(▲)的Nyquist圖。如文中所述，將實驗數(shù)據(jù)與修正的等效電路進行了擬合。圖8顯示了B-DNA和M-DNA修飾的金電極在5mM Ru(NH3)3+/2+，20mM Tris-ClO4緩沖液(pH8.6)中，以Ag/AgCl為參比施加電勢為-0.10V時阻抗測定的Nyquist圖。圖9是顯示如實施例2中所探討的附著于電極表面上的雙鏈中DNA錯配的示意圖。圖10是顯示如實施例2中所探討的在B-DNA與M-DNA狀態(tài)下，正確配對的雙鏈以及中間有錯配的雙鏈的阻抗譜的圖表。圖11顯示了分別將20個堿基對的互補B-DNA(○)、中間存在錯配的B-DNA(□)、互補M-DNA(●)以及中間存在錯配的M-DNA(■)裝配于金電極上，以4mM[Fe(CN)6]3-/4-混合物(1∶1)作為氧化還原探針，在20mM Tris-ClO4和20mM NaClO4溶液中的Nyquist圖(-Zimvs Zre)，以Ag/AgCl為參比施加電勢為250mV，[ZnII]＝0.4，pH 8.6。在所有情況下，測得的數(shù)據(jù)點均以符號顯示，計算的與等效電路的擬合曲線顯示為實線。注意實驗數(shù)據(jù)與等效電路進行了擬合。Rs溶液電阻，Rx單層小孔/缺損電阻，RCT電荷轉移電阻，CPE恒定相元件，WWarburg阻抗。圖12中，a)為雜交-解鏈過程。i)水浸漬60℃ EtOH(60∶40)溫浴10分鐘，然后室溫下用20mM Tris-ClO4緩沖液漂洗10分鐘。ii)將靶ss-DNA加入到SSC緩沖液中，37℃下10分鐘，然后室溫3小時使其形成雙鏈。b)為按1∶2構成的全部雜交的“理想”單層(○)、雜交步驟后的1倍ss-DNA單層(□)以及重新雜交步驟之后按1∶2構成的復性的ds-DNA膜(●)的Nyquist圖。與公認的指示不完全雜交結果的單層不均一性的理想的“1∶2”膜的阻抗譜相比，復性DNA膜的阻抗譜存在差別。圖13顯示了分別將復性的20個堿基對的互補B-DNA(○)、中間存在錯配的B-DNA(□)、互補M-DNA(●)以及中間存在錯配的M-DNA(■)裝配于金電極上，以4mM Fe(CN)63-/4-混合物(1∶1)作為氧化還原探針，在20mM Tris-ClO4和20mM NaClO4溶液中的Nyquist圖(-Zimvs Zre)。以Ag/AgCl為參比，施加的電勢為250mV，[ZnII]＝0.4mM；pH 8.6。在所有情況下，測得的數(shù)據(jù)點以符號顯示，計算的等效電路的擬和曲線以實線表示。圖14顯示了通過監(jiān)測B-DNA與M-DNA之間RCT中的變化作為目標單鏈DNA濃度的函數(shù)來測定檢測范圍?；パaDNA鏈以(□)表示，中間錯配的DNA鏈以(○)表示。誤差范圍(error bar)最少由5個以上電極確定。
發(fā)明詳述[29]在本發(fā)明的一個方面，阻抗譜用于探測在金電極表面上自組裝單層的B-DNA及M-DNA的電學特性。通過背景技術介紹，圖1解釋了模擬受到通過自組裝單層進行非均一性電子傳遞的電極阻抗的電路模型，其通常在由Randles(Randles，1947)建立的模型的基礎上進行描述。等效電路(圖1的虛框中)由電阻元件和電容元件組成。Rs為溶液的電阻，Rct為電荷轉移阻抗，C為雙層電容(double-layer capacitance)，W為由于質子傳遞到電極所產(chǎn)生的Warburg阻抗。通常，Randles電路提供了鏈烷硫醇(alkanethiol)單層行為的很好的模型。然而，如下觀察結果引起了相當大的興趣即由Randles電路不足以描述含有共軛π鍵系統(tǒng)的HMB(4’-羥基-4-巰基聯(lián)苯)單層，但如果增加一個另外的并聯(lián)電阻(圖1中的Rx)，就可以很好的對其譜圖進行擬合(Janek等，1998)。如圖2中所示，當加入Zn2+形成M-DNA時，離子插入DNA螺旋中并與螺旋外側的磷酸酯主鏈結合。B-DNA轉換成M-DNA導致觀察到的15、20及30堿基對雙鏈的阻抗譜(impedance spectra)的特征發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，包括并聯(lián)電阻Rx的修正Randles電路可用于給出與實驗數(shù)據(jù)較好的擬合(圖1)。在這些情況下，M-DNA表現(xiàn)為使Rx和Rct都減小，并使通過單層的電子傳遞增加。本發(fā)明的多個方面涉及M-DNA，即一種含金屬的導電寡核苷酸雙鏈。在本發(fā)明的一些可供選擇的方面，含金屬的導電寡核苷酸雙鏈可包括第一核酸鏈和第二核酸鏈，第一及第二核酸鏈分別包括多個由主鏈共價連接的含氮芳香堿基。第一核酸鏈的含氮芳香堿基可通過氫鍵與第二核酸鏈的含氮芳香堿基結合。第一核酸鏈與第二核酸鏈的含氮芳香堿基可形成沿著含金屬導電寡核苷酸雙鏈長度方向堆疊排列的氫鍵結合的堿基對。氫鍵結合的堿基對可包括內(nèi)部螯合(interchelated)的金屬陽離子，其與含氮芳香堿基之一中的氮原子配位結合。內(nèi)部螯合的金屬陽離子可包括內(nèi)部螯合的二價金屬陽離子，二價金屬陽離子可選自由鋅、鈷及鎳組成的組。作為選擇，金屬陽離子可選自由下列陽離子組成的組Li，Be，Na，Mg，Al，K，Ca，Sc，Ti，V，Cr，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Cu，Zn，Ga，Ge，As，Rb，Sr，Y，Zr，Nb，Mo，Tc，Ru，Rh，Pd，Ag，Cd，In，Sn，Sb，Cs，Ba，La，Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，Lu，Hf，Ta，W，Re，Os，Ir，Pt，Au，Hg，TI，Pb，Bi，Po，F(xiàn)r，Ra，Ac，Th，Pa，U，Np以及Pu。第一及第二核酸鏈可包括脫氧核糖核酸，含氮芳香族堿基可選自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤及胞嘧啶組成的組。二價金屬陽離子可取代含氮芳香族堿基的亞胺質子，該含氮芳香堿基可選自由胸腺嘧啶及鳥嘌呤組成的組。含氮芳香堿基中的至少一個可包括具有N3氮原子的胸腺嘧啶，并且二價金屬陽離子可與N3氮原子配位結合。作為選擇，含氮芳香堿基中的至少一個可包括具有N1氮原子的鳥嘌呤，并且二價金屬陽離子可與該N1氮原子配位結合。在本發(fā)明的各個方面，如在下列實施例中所公開的，DNA單層可裝配于金電極表面，并由循環(huán)伏安法(CV)或者X-射線光電子光譜(XPS)來估算。如實施例中所示，CV光譜可提供對Fe(CN)63-/4-封閉良好的密集組裝的單層的很好證據(jù)。通過XPS，膜的厚度可基于Au 4f信號的指數(shù)衰減來估算，在實施例中算出為45_(Pressprich等，1989)。20個堿基對的雙鏈可預期具有大約70_的長度，所以作為例子的測得的45_的厚度與DNA以約50°角從電極表面突出相一致。通常，與也可通過堿基連接的單鏈DNA不同的是，雙鏈DNA通過連接物(linker)進行連接(Heme及Tarlov，1997)。在實施例中，S2p的峰值162.4eV與以前報道的指示DNA通過S-Au鍵與電極表面相互作用的烷硫醇(alkanethiol)非常一致(Ishida等，1999)。AC阻抗波譜法是已知的探測并模擬電極的界面特征的方法(Bard與Faulkner，2001)。例如，數(shù)據(jù)可以Nyquist圖(Zimvs Zre)的方式顯示，在圖可以很容易觀察并解釋其特征變化。復阻抗可以分別主要來自于測定的電化學系統(tǒng)的電阻與電容的實際值Zre(ω)與假想值Zim(ω)分量之和來顯示。如這里所示的例子，裸露電極的Nyquist圖為Zre軸上方的一個半圓形區(qū)域與隨后的一段直線組成。推定在頻率較高下測定的半圓部分與直接的電子傳遞限制過程相應，相反，推定觀察到的在頻率較低下測定的直線部分則表示擴散控制的電子傳遞過程。與裸露的金屬電極相比，用有機分子層對金屬表面進行修飾可減小雙層之間的電容，并降低了界面的電子傳遞率(Finklea等，1993；Kharitonov等，2000)。在一些實施例中，數(shù)據(jù)分析可需要使用由電學元件構成的等效電路對電極動力學進行模擬。對于許多單層來說，通?？山邮艿牡刃щ娐肥腔谌鐖D1中所示的Randles模型。然而，為了獲得與這里所公開的例子的數(shù)據(jù)的很好擬合，在等效電路中增加了并聯(lián)的界面電阻Rx，其名義上與通過DNA的電子傳遞相應。例如，可通過在不存在氧化還原活性探針Fe(CN)63-/4-的情況下測定的阻抗來提供并聯(lián)的界面電阻證據(jù)(見圖6)。對于許多不帶電荷的單層來說，不同的氧化還原探針可給出定量上類似的結果，這大概是由于探針與單層之間的相互作用為非靜電型的緣故(Boubour及Lennox，2000；Finklea，1996；Finklea等，1993)。然而，DNA帶負電荷，因此，Ru(NH3)63+/2+等帶正電荷的探針可進入單層，而Fe(CN)63-/4-等帶負電荷的探針則不能進入單層。例如，這些差別可反映在這里的實施例所顯示的結果中，其中帶有Ru(NH3)63+/2+的Rct大約為1KΩ(圖8)，與裸露的電極類似，而帶有Fe(CN)63-/4以及B-DNA的相應值接近20KΩ。因此，由于電荷轉移可以基本上繞過單層，Ru(NH3)63+/2+不適于用作DNA的探針。這里實施例所公開的結果表明，在某些情況下，由于M-DNA的Rct及Rx都比較小，其可成為比B-DNA更好的導體。在這些例子中，隨著長度的增加，B-DNA與M-DNA的Rct之差趨于增大，而隨著DNA雙鏈的長度增加，Rx之差趨于減小。在這些例子中，DNA不直接與電極相連，使Rct及Rx都具備了串聯(lián)的條件，來進行來自通過連接物與電極連接的DNA的電子傳遞。在作為選擇的實施方案中，DNA可直接與電極相連，也可通過可改變長度的連接物與電極相連，來解決連接物的影響問題。在一些實施方案中，B-DNA與M-DNA的相互轉換可形成系統(tǒng)，通過改變金屬離子或pH，其中的Rx及Rct都可受到調(diào)節(jié)。
實施例1[40]在本發(fā)明的一些方面的實施例中，下面將更為詳細地描述裝配于金電極上具有15、20及30個堿基對的硫醇標記的DNA雙鏈單層。通過以Fe(CN)63-/4-作為氧化還原探針的電化學阻抗譜學來研究電子傳遞。以Nyquist圖形式表示的譜圖由包括增加了用于測定通過DNA的電阻的并聯(lián)元件Rx的修正Randles電路來進行分析。天然B-DNA的電荷轉移電阻Rx及Rct都隨著長度的增加而增大。通過在pH 8.6下添加Zn2+形成M-DNA，并引起在Nyquist圖中的特征變化，而在添加Mg2+或者在pH 7.0下則觀察不到這些變化。M-DNA的Rx及Rct也都隨著雙鏈長度的增加而增大，但與B-DNA相比其增加的幅度都明顯較小。因此，某些金屬離子可調(diào)節(jié)DNA單層的電化學特性，而且通過金屬DNA膜的電子傳遞也比天然的DNA膜要快。
化學試劑[41]六鐵氰化鉀、六亞鐵氰化鉀、六胺基釕(III)、氯化六胺基釕(II)氯化物購自Aldrich，為ACS試劑級；Zn(ClO4)2、Mg(ClO4)2以及Tris-ClO4購自Fluka Co；標準緩沖液為pH 8.7或7.0的20mM Tris-ClO4，其它化學試劑為分析級，所有溶液均采用Millipore過濾水配制。
DNA[42]探針DNA采用標準的DNA合成方法在Saskatoon植物生物技術研究所(Plant Biotechnology Institute，Saskatoon)合成并純化。寡聚核苷酸堿基序列為15-mer DNA，5′-AAC TAC TGG GCCATC-(CH2)3-S-S-(CH2)3-OH-3′，靶互補序列為5′-GAT GGC CCA GTAGTT-3′；20-mer DNA，5′-AAC TAC TGG GCC ATC GTGAC-(CH2)3-S-S-(CH2)3-OH-3′，靶互補序列為5′-GTC ACG ATG GCCCAG TAG TT-3′，30mer DNA，5′-GTG GCT AAC TAC GCA TTC CACGAC CAA ATG-(CH2)3-S-S-(CH2)3-OH-3′，靶互補序列為5′-CAT TTGGTC GTG GAA TGC GTA GTT AGC CAC-3′。
電極制備[43]金盤電極(幾何表面積為0.02cm2)與Ag/AgCl參比電極購自Bioanalytical Systems。使用前，用0.05μm鋁土漿液仔細拋光，然后在0.01M KOH溶液中清洗幾分鐘，接著在Millipore H2O中清洗兩次。電極用波譜法仔細檢查，以確保不存在明顯缺陷。最后，在下述池中進行電化學處理，在0.5M H2SO4溶液中以Ag/AgCl為參比，電壓為-0.1到+1.25V進行循環(huán)掃描，直到在以Ag/AgCl為參比，電壓為1.1V時獲得穩(wěn)定的金氧化峰(Finklea，1996)。
DNA修飾金電極的制備[44]將10nmol二硫化物標記的DNA鏈加入到溶解于含有20mMNaClO4的50μl 20mM、pH 8.7的Tris-ClO4緩沖液的10nmol互補鏈溶液中，20℃放置2小時制備DNA雙鏈。雙鏈DNA終濃度約為100μM。新制備的金電極與DNA雙鏈在密封容器中溫育5天。將電極用緩沖液(20mM Tris-ClO4與20mM NaClO4)徹底漂洗并將其固定于電化學池中。加入0.4mM ZnClO4，pH 8.7下放置2小時，將B-DNA轉化成M-DNA。
X射線光電子波譜法[45]采用帶有Al-Ka放射源(1486.6eV)的Leybold MAX200光電子分光計來收集光發(fā)射光譜。測定過程中分析室中的基本壓強保持低于10-9mbar，起飛角(take-off angle)為60°。常規(guī)儀器校準標準為Au 4f7/2峰(結合能為84.0eV)。
電化學[46]采用常用的三電極池。所有實驗均在室溫下進行。池用接地Faraday隔離罩封閉。采用含有電解液的Luggin毛細管使參比電極始終與池分離。為了避免Cl-離子從標準Ag/AgCl參比電極中泄露到測定系統(tǒng)中，采用鹽橋參比電極。反電極為鉑導線。采用由GPIB在PC上運行鮑爾程序組(Power Suite)(Princeton Applied Research)的與EG&G 283恒電位器/恒流器連接的1025頻率響應分析儀(FRA)測定阻抗譜。在以Ag/AgCl為參比電勢為250mV時測定阻抗，并疊加到調(diào)幅為±5mV的正弦電勢上。用于阻抗測定的頻率范圍可以從100kHz到100mHz。裸露金電極、B-DNA及M-DNA修飾金電極的阻抗數(shù)據(jù)采用ZSimpWin軟件(PrincetonApplied Research)進行分析。在所有阻抗譜中，符號表示未處理的實驗數(shù)據(jù)，實線表示擬合曲線。
結果單層的組裝[47]如在材料及方法中所述，將天然雙鏈B-DNA組裝于金電極表面。單層以4mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)混合物作為氧化還原探針時的循環(huán)電壓電流(cycle voltammetery)為特征。典型的掃描顯示于圖3中，裸露金電極顯示了準可逆氧化還原循環(huán)的特征，峰值間距為158mV。對于裝配了20個堿基對雙鏈的電極來說，峰值電流下降超過95％，并且氧化與還原峰值的間距增大，表明電極表面上DNA的存在，而且溶液與表面之間的電子傳遞能力降低。金電極表面還可用X光電子波譜法(XPS)進行分析。如圖4所示，如所期望的修飾表面那樣，當連接有DNA(B-DNA或M-DNA)時，Au4f的峰值密度下降(Kondo等，1998；Ishida等，1999)。在B-DNA與M-DNA光譜中S2p(162.4eV)、P2p(133eV)以及N1s(400eV)處的峰值很明顯，但在裸露金電極的光譜中這些峰值則沒有出現(xiàn)，這給出了二硫化物連接的DNA與表面發(fā)生結合的很好證據(jù)。特別有意義的是，觀察到B-DNA與M-DNA的Nls及Ols(在pH 8.7下加入Zn2+之后)光譜是不同的。這與鋅離子與DNA雙螺旋的相互作用一致，尤其是與堿基對中的氮原子及氧原子相互作用相一致(Lee等，1993；Aich等，1999)。
B-DNA的阻抗分光檢測[49]在存在4mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)混合物作為氧化還原探針時進行阻抗測定。圖5A顯示了裸露金電極的Nyquist圖，其在高頻率下可以描述為原點附近的半圓形，隨后為具有相同斜率的線性尾巴。其它電極可用相同曲線描述，并且數(shù)據(jù)可用圖1中的Randles電路充分擬合。半圓的直徑用電荷轉移電阻Rct度量。對于20-mer的B-DNA來說(圖5B)，與裸露的金電極相比，由于傳遞到電極的電子減少，Rct顯著增加。然而，低頻區(qū)域不再呈線性，而且不能用簡單的Randles電路充分擬合。當不存在氧化還原探針時，B-DNA(以及M-DNA，見下文)的阻抗測定證明了對簡單絕緣體來說不期望出現(xiàn)的非線性行為(圖6)。然而，圖6的曲線可與由電容器與電阻并聯(lián)所構成的簡單電路擬合。這種結果表明增加的與Randles電路并聯(lián)的額外界面電阻Rx的存在(圖1)。如圖5B所示，修正電路在低頻區(qū)與高頻區(qū)都能與實驗數(shù)據(jù)擬合得非常好。
M-DNA的形成[50]在pH 8.7時將Zn2+加入到20-mer B-DNA修飾的金電極形成M-DNA時，阻抗譜的特征模式發(fā)生改變，在高頻區(qū)與低頻區(qū)Zim與Zre都減小(圖5C)。對比實驗表明，M-DNA的形成在兩小時內(nèi)完成。修正的Randles電路再次給出了與實驗數(shù)據(jù)的很好擬合。在圖5D中也顯示了在存在和不存在Zn2+的pH 7.0的緩沖液中以及在存在Mg2+的pH 8.7的緩沖液中DNA修飾電極的阻抗譜。在這些條件下，不會形成M-DNA，觀察到的阻抗譜也僅僅發(fā)生了很小的變化。Rs、Rx、Rct、C以及W的計算值在表1中列出。顯然，在M-DNA形成時Rx與Rct顯著下降，這既不是在加入Mg2+的情況下，也不是在pH 7.0時加入Zn2+的情況下發(fā)現(xiàn)。
表1pH及離子型aDNA
(a)除裸露金電極的數(shù)據(jù)是與未修正的Randles電路進行擬合外，其它數(shù)值均來自修正的Randles電路。
DNA序列長度[51]為了提供與所建議的模型中的元件有關的更多信息，采用15、20及30個堿基對的DNA雙鏈來修飾金電極的表面。如圖7所示，所有的阻抗譜均具有相同的特征形狀，并能與修正的Randles電路擬合得非常好。Rs、Rx、Rct、C以及W的計算值在表2中列出。這些值具有兩種截然不同的趨勢。第一，隨著B-DNA與M-DNA長度的增加，Rx與Rct都增大；第二，對于任何長度的雙鏈M-DNA，其Rx與Rct都小于B-DNA的相應值。代表傳遞到電極的質子的Warburg阻抗W的可變性更大，但在所有情況下M-DNA雙鏈均更高。如同期望的那樣，溶液電阻Rs與雙鏈的長度無關，而隨著雙鏈長度的增加，雙層電容C減小。
表2不同長度的DNA序列
Ru(NH3)3+/2+氧化還原電極[52]在該實施例中以Fe(CN)63-/4-作為氧化還原探針，其帶負電荷，因此可被DNA的磷酸酯骨架所排斥。而相反，Ru(NH3)3+/2+則可期望能夠穿過單層。采用Ru(NH3)3+/2+作為20個堿基對的B-DNA及M-DNA雙鏈的氧化還原探針進行了阻抗譜測定(圖8)。如在插頁中所示，Rct相當小，因而B-DNA與M-DNA的光譜之差也非常小。
實施例2[53]在前一實施例中，描述了B-DNA及M-DNA的自組裝單層(SAMs)的阻抗譜，并顯示了依賴于DNA長度和離子濃度的每個電阻(R)及電容(C)特征值。本實施例說明了DNA中的單堿基對錯配也引起阻抗譜的界限分明的的變化，從而在一定條件下將其與正確配對的雙鏈準確地區(qū)分開來。DNA序列及錯配的位置在圖9及表3中顯示。
表3 除非特別指出，在本實施例中所采用的方法與實施例1中相同。在B-DNA與M-DNA條件下，正確配對雙鏈的阻抗譜和一個帶有中間錯配的雙鏈顯示于圖10中。每個點表示在特定AC頻率下測得的Zi及Zr值。例如，在0.1Hz和49Hz的點高亮顯示，并可看出B-DNA與M-DNA的正確配對的雙鏈與中間錯配的雙鏈的相應Zi及Zr值明顯不同。從圖10顯示的阻抗譜中，可以精確計算出R及C值(如實施例1中所述)，并采用這些值來鑒別正確配對的雙鏈和錯配的雙鏈。在一些實施例中，不同的電極可給出不同的R和C值。因此，在一些實施例中，可采用匹配的成套電極來進行錯配檢測。在作為選擇的實施方案中，由于B-DNA與M-DNA的Z值之間的差別更為一致，而且對電極及實驗條件的依賴性較小，可在兩種頻率下測定B-DNA與M-DNA的Z值。從這些測定數(shù)據(jù)就能夠分辨正確配對的雙鏈與錯配的雙鏈。例如可設Li為在低頻率(0.1Hz)時測得的B-DNA與M-DNA的Zi之差，Hi為在高頻率(49Hz)時測得的B-DNA與M-DNA的Zr之差，設Y因子為Y＝Li×Lr×Hi×Hr。在一些實施方案中，例如，測定的正確配對的雙鏈的Y因子可以為大約1000，而錯配雙鏈則為大約1到約40。在一個實施方案中，提供了一種可用于測定Y因子等的裝置。這種裝置包括每個電極可單獨尋址的電極陣列。探針，例如20-mer的雙鏈探針可通過硫醇鹽鍵與每個電極連接，然后雙鏈變性，僅保留一個與電極連接的單鏈探針。與單鏈直接與電極連接相比，該方法可提供更為一致的電極表面。然后靶核酸可與電極上的探針雜交，并在兩種頻率下測定其阻抗。然后可對電極進行處理，以轉化形成M-DNA，例如，可用0.2mMZnClO4對電極進行處理，并重復測定阻抗。在該實施例中，如果測得的Y因子在大約100以下就可作為錯配的指示；反之，如果測定值高于大約100則可作為配對正確的雙鏈的指示。在一些實施方案中，如果測定仔細，則可檢測出錯配的位置，例如可將錯配定位于雙鏈的頂部、中部或底部。在一些實施方案中，例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測等，來自雜合體的樣品可給出Y值的中間值等。在一些實施方案中，可采用多晶金電極(polycrystalline goldelectrode)。作為替代，也可采用單晶金電極(monocrystalline goldelectrode)，其可提高鑒別率并增加了系統(tǒng)的靈敏度。在一些作為替代的實施例中，可以理解，本發(fā)明的系統(tǒng)也可作為數(shù)據(jù)存儲及讀取裝置來使用，信息可以電極上的核酸分子構型的形式儲存。
實施例3[63]在該實施例中，采用電化學法來測定未標記的雙鏈DNA中的單核苷酸錯配。采用阻抗譜來描述正確配對的雙鏈單層以及三種錯配位置不同的DNA單層的特征。單層以B-DNA的形式檢測，然后將其轉化成M-DNA。阻抗數(shù)據(jù)與等效電路的模擬提供了鑒別四種單層構型的有用參數(shù)。對于所有類型的雙鏈來說，當轉化成M-DNA后，電荷轉移電阻RCT都很低。令人驚異的是，發(fā)現(xiàn)含有錯配的雙鏈的RCT也同樣減小了，從而發(fā)現(xiàn)RCT可用于錯配檢測診斷。特別地，B-DNA與M-DNA的RCT之差(RCT)由正確配對雙鏈的190(22)Ωcm2分別減小到頂部位置錯配的雙鏈為95(20)Ωcm2，中間錯配為30(20)Ωcm2，底部錯配為85(20)Ω·cm2。在此作為例證的本發(fā)明的一個可供選擇的方面，采用將變性后能夠復性形成靶鏈的雙鏈變性形成松散堆疊的單鏈(ss)-DNA單層的方法。復性的效率為40-70％的范圍。在不完全雜交情況下，在B-DNA狀態(tài)下正確配對與錯配的雙鏈的RCT是相同的。然而在不完全雜交情況下，B-DNA與M-DNA之間的RCT仍然很顯著。正確配對的雙鏈的RCT為76(12)Ωcm2，而在序列中間有錯配的雙鏈產(chǎn)生的RCT值為30(15)Ωcm2。對檢測范圍進行了測定，并且阻抗方法學上可靠檢測的單堿基對DNA錯配濃度低至100pM。
材料[65]采用全自動DNA合成儀，通過標準磷酰胺化固相DNA合成法(phosphoamidate solid-phase DNA synthesis)來合成5’-二硫化物標記以及未標記的寡聚核苷酸鏈，采用反向HPLC純化，然后采用電噴射電離質譜分析(electrospray ionization mass spectrometry)來描述其特征。DNA序列及錯配的位置在表4中顯示。
表4列出了用于在實施例3中制備單層膜的DNA序列。序列中的錯配堿基對以加粗字體表示。
單層制備[66]將新洗凈的金電極(BAS，直徑1.6mm)在20mM Tris-ClO4緩沖液(pH8.6)中與0.05mM單鏈或雙鏈B-DNA溫育5天。然后用Tris-ClO4緩沖液清洗電極并將其固定于電化學池中?？赏ㄟ^將電極浸漬于熱水(60℃)EtOH(60∶40)中變性10分鐘然后在室溫下用20mM Tris-ClO4緩沖液漂洗來實現(xiàn)單鏈探針電極的變性和再生。發(fā)現(xiàn)了對于在不同電極上重復測定的可重復性質。通過將單鏈DNA自組裝單層暴露于SSC緩沖液(300mM NaCl，30mM檸檬酸鈉，pH7.0)中，在靶DNA存在下37℃加熱10分鐘，然后冷卻到室溫后再放置3小時復性。在pH 8.6下加入0.4mMZn(ClO4)2·6H2O，放置2小時使B-DNA轉化成M-DNA。通過Fe(CN)63-/4-、X射線光電子波譜法(XPS)及EIS技術，采用標準封閉研究來評估單層的形成。封閉研究顯示了有助于減少氧化還原探針向金表面擴散的峰值電流的減小。XPS數(shù)據(jù)顯示了Au-硫醇鍵(Au-thiolate bond)的存在，并且1∶2單層的厚度為44_。
電化學測定[68]采用常規(guī)的三電極池。所有實驗均在室溫下(22℃)進行。電極池用接地法拉第氏罩(Faraday cage)封閉。用3M KCl將Ag/AgCl導線密封于玻璃管中，用維克尖頭(Vycor tip)封蓋構成參比電極。反電極為鉑導線。阻抗譜采用與EG& G283恒電位器/恒流器相連的EG&G 1025頻率響應分析儀測定。交流電壓振幅為5mV，用于EIS測定的電壓頻率范圍為100kHz到100mHz。以Ag/AgCl為參比施加的電勢為250mV(氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-的表觀電位E0)。所有測定最少在不同電極上重復5次，以得到統(tǒng)計學上有意義的結果。
結果[69]金電極表面上完全配對的B-DNA單層由寡聚核苷酸1及其完全配對的互補鏈2制備。為了通過EIS法估計錯配的影響，制備了三種錯配的單層，每種在互補鏈上帶有單個嘧啶-嘧啶錯配?；パa的錯配鏈3的頂部第二堿基對為錯配堿基對，產(chǎn)生的錯配遠離電極表面。互補的錯配鏈4在11位由T代替了G，形成的單層在雙鏈中間帶有錯配堿基。互補的錯配鏈5在19位由C代替了A，產(chǎn)生的錯配與電極表面鄰近。以類似方式制備了1∶3、1∶4及1∶5的錯配B-DNA單層。在存在4mM[Fe(CN)6]3-/4-混合物(1∶1)作為氧化還原探針的情況下，在20mM Tris-ClO4緩沖液(pH8.6)中測定了所有單層的阻抗。在此如其它任何段落所述相同，然后在pH8.6下加入0.4mM ZnII將B-DNA轉化為M-DNA。在M-DNA的情況下，對所有4種單層重復進行阻抗測定。在圖11中以Nyquist圖的形式顯示了完全配對雙鏈(1∶2)和雙螺旋中間有錯配堿基的雙鏈(1∶4)的B-DNA和M-DNA單層的典型阻抗譜。每個點代表在特定交流頻率時測得的Zim和Zre值。如事先觀察所預期的那樣，該光譜顯示M-DNA的阻抗比B-DNA低40-44。更重要的是，DNA雙鏈中錯配的存在使B-DNA的阻抗減小，但使M-DNA的阻抗增加。為了解釋這種行為的原理，采用修正的Randles等效電路對所有DNA膜的阻抗譜進行了分析，圖11中顯示了電路圖。采用同樣的模型與在該實施例中描述的所有單層進行擬合。等效電路與實驗值的擬合以實線表示。這種處理使得可以根據(jù)電路元件對阻抗數(shù)據(jù)進行解釋，本實施例的所有單層的阻抗數(shù)據(jù)在表5中列出。等效電路包括如下所述五個元件。
表5.本實施例的互補DNA單層以及一系列錯配DNA單層的電路元件值。括號中的值表示來自多個電極(n＝5)測定結果的標準偏差，而不是非線性曲線的擬合誤差。
*CPE以及相關元件解釋為改性指數(shù)＞0.9的電容器。在支持電解液濃度和溫度相同的條件下，溶液電阻Rs保持穩(wěn)定在5-6Ωcm2。電路包括模擬為非理想電容器的穩(wěn)定相元件(CPE)，以計算電極表面的不均一性。CPE可解釋為在改性指數(shù)大于0.9的情況下的電容器。這就是所有在本實施例中顯示的單層的情況。單層的組成和厚度是影響CPE的因素。1∶2配對雙鏈以及兩種1∶3和1∶5的頂部和底部錯配雙鏈膜的CPE大小范圍為10-25μF cm2。然而，對1∶4的帶有中間錯配堿基的B-DNA與M-DNA膜來說，觀察到的電容非常高，約為40(2)μF·cm2。等效電路的Rx分量可推定為與單層結構中的小孔有關。每個B-DNA的Rx值都類似，表明單層之間的氣孔數(shù)目及大小均沒發(fā)生變化。然而，當轉化成M-DNA時，Rx趨向于減小。Warburg阻抗元件W依賴于[Fe(CN)6]3-/4-氧化還原探針的擴散速率。在B-DNA構象中配對雙鏈的Warburg阻抗最小，表明其為最有序的單層，體現(xiàn)了通過這種DNA單層的溶液電泳的路徑最短。電荷轉移電阻率(resistance terms)RCT可視為包括了(a)從[Fe(CN)6]3-/4-氧化還原探針傳遞到DNA單層的電子傳遞電阻，(b)DNA雙螺旋的堿基對之間的電荷轉移電阻，以及(c)從雙螺旋到金電極表面的電子傳遞產(chǎn)生的電阻率。對所有的單層來說，M-DNA的RCT都比B-DNA的低。RCT使得單核苷酸錯配與完全配對的DNA膜能夠鑒別。在該實施例中，錯配的存在導致所有帶有錯配堿基的膜的RCT都減小。就錯配檢測而言，給定膜的B-DNA與M-DNA之間的電荷轉移電阻之差RCT提供了完全配對雙鏈與頂部或中間位置帶有單堿基錯配的雙鏈之間的鑒別方法。表5中列出了所有膜的RCT。1∶2的完全配對的雙鏈膜的RCT為190(22)Ωcm2，而錯配膜的RCT則相當小。有趣地是，1∶3的頂部錯配的膜以及底部錯配的膜(1∶5)的RCT相近(1∶3的為95(19)Ωcm2，1∶5的為85(20)Ωcm2)。帶有中間錯配堿基的雙鏈的RCT非常低(1∶4的為30(18)Ωcm2)。例如，使用RCT在作為選擇的實施方案中是很有利的，因為在B-DNA與M-DNA之間的相對阻抗測定可重復的情況下，不同電極形態(tài)可產(chǎn)生不同的阻抗。為了解釋在非理想狀態(tài)下的阻抗測定，這里以復性(rehybridization)的影響為例。在該形式中，DNA探針序列穿過單鏈DNA單層洗滌(這將導致雜交的不同)。直接形成單鏈DNA單層可產(chǎn)生DNA鏈密集堆疊的膜，并干擾了與互補鏈的結合。因此，在本實施例中，先形成雙鏈DNA膜，然后使其變性形成堆疊更松散的單鏈DNA單層。在這種方法中，在一些實施方案中靶DNA的復性率可達到40-70％。圖12a以圖解的形式說明了雜交-變性過程。用熱水(60℃)EtOH(60∶40)洗滌雙鏈DNA膜，然后在室溫下用Tris-ClO4緩沖液漂洗至變性并形成由DNA鏈1組成的單鏈DNA膜。然后將該膜暴露于互補靶ss-DNA溶液中并雜交3小時。在一些實施方案中，加熱可對單層造成有害影響，然而，如在該實施例中所述，當Rx分量保持實質相同或者有所增加時，推定其顯示沒有產(chǎn)生新的小孔或缺陷位點，這種影響是可以消除的。在本實施例中，如圖12b所示，當在變性-復性過程后采用2或4重新形成雙鏈DNA膜時，阻抗信號沒有恢復到完全配對的雙鏈DNA的值，表明形成的膜由雙鏈DNA和單鏈DNA組成。重要地是，盡管明顯沒有完全復性，仍可檢測到錯配的存在，如圖13中的阻抗譜所示。含有互補鏈2以及中間帶有單堿基錯配的鏈4的單鏈DNA膜復性后，所有的光譜均與如上所述的相同等效電路進行擬合，電路參數(shù)顯示于表6中。
表6復性的互補DNA單層以及復性的中間錯配DNA單層的擬合阻抗值。括號中的值表示來自多個電極測定結果的標準偏差(n＝5)，而不是非線性曲線的擬合誤差。
*CPE以及相關元件解釋為改性指數(shù)＞0.9的電容器。由圖13及表6中的實施方案可以看出，由配對及錯配的靶DNA雜交形成的B-DNA膜在一些條件下是可區(qū)分的。然而，在該實施方案中，在M-DNA情況下膜顯示出了明顯的不同。此外，RCT可用于鑒別配對與錯配的DNA膜。B-DNA與M-DNA的RCT的差別在作為例證的實施方案(76(12)Ωcm2)十分一致，正確配對的雙鏈都大于RCT/Ωcm2減小到29(15)Ω·cm2的錯配膜。復性實施例采用各種濃度的靶互補鏈作為例證，解釋了測定需要將配對膜從錯配DNA膜中鑒別出來的最小濃度的靶單鏈DNA。每次測定記錄B-DNA與M-DNA膜的阻抗譜，并將其與等效電路擬合。如圖14中所示，當靶單鏈DNA濃度下降到100pM時，RCT也保持相當恒定。如這里的例證，通過B-DNA與M-DNA之間的RCT之差，可清楚地鑒別出配對DNA與錯配的DNA。
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結論[165]盡管在此描述了本發(fā)明的多個實施方案，本領域技術人員根據(jù)公知技術在本發(fā)明的范圍內(nèi)可對其進行多種變化與修改。這些修改包括采用公知的等同物來替代本發(fā)明的任一方面，以實質上相同的方式獲得相同的結果。其中的數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)據(jù)。詞語“包括”這里用作開放式術語，實質上與短語“包括但不限于”等同，單詞“包括”也具有相應的意思。如這里所使用的，除非在上下文中明確指出以外，單數(shù)形式“a”、“an”及“the”也包括復數(shù)的指示對象。因此，例如，在提及“一件事情”時，包括了一件以上的這種事情。這里引用的參考文獻并不是將這些參考文獻作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術的一種認可。在說明書中引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請，均通過引用而包含于本申請中，如同特別并單獨指出每個單個出版物在此均包含于本申請中那樣，并如同對其進行了完整的闡述。本發(fā)明包括了此前參照例子與附圖充分描述的所有的實施方案及其變化。
權利要求
1.一種檢測附著于電化學電路中的電極上的核酸雙鏈中堿基對錯配的方法，包括a)對電化學電路中的電極施加電能；b)收集與電路中電極上的核酸雙鏈[B1]的阻抗有關的電化學電路數(shù)據(jù)；以及c)將電化學電路數(shù)據(jù)與電路模型擬合，以獲得指示核酸雙鏈中堿基對錯配的電路性能信息。
2.權利要求1的方法，其中收集電化學電路數(shù)據(jù)包括測定阻抗譜。
3.權利要求2的方法，其中阻抗譜在頻域范圍內(nèi)測定。
4.權利要求1、2或3的方法，其中電化學電路數(shù)據(jù)包括復阻抗的測定值。
5.權利要求1的方法，其中將電能施加到阻抗譜學系統(tǒng)中，阻抗譜學系統(tǒng)包括在不連續(xù)的時段內(nèi)以恒定頻率及恒定振幅施加正弦信號。
6.權利要求1、2、3、4或5的方法，其中電路模型包括如下電路元件溶液電阻Rs；電荷轉移電阻RCT；恒定相元件CPE；傳質元件W(Warburg阻抗)；以及并聯(lián)電阻Rx；其中電路元件按下圖排列
7.權利要求1到6中任何一項的方法，其中核酸為脫氧核糖核酸。
8.權利要求1到6中任何一項的方法，其中核酸包括由第一核酸鏈和第二核酸鏈組成的含有金屬的核酸雙鏈，第一及第二核酸鏈包括多個通過主鏈共價連接的含氮芳香族堿基，第一核酸鏈的含氮芳香族堿基通過氫鍵與第二核酸鏈的含氮芳香族堿基相連，第一及第二核酸鏈上的含氮芳香族堿基形成氫鍵結合的堿基對，其沿著導電性的含金屬的核酸雙鏈的長度方向堆疊排列，氫鍵結合的堿基對包括內(nèi)部螯合的二價金屬陽離子，其與芳香族的含氮芳香族堿基之一中的氮原子形成配位鍵。
9.權利要求1到6中任何一項的方法，進一步包括將第一核酸雙鏈的電路性能信息與第二核酸雙鏈的電路性能信息相比較。
10.權利要求9的方法，其中第一核酸雙鏈為B-DNA，第二核酸雙鏈為由第一核酸鏈和第二核酸鏈構成的含金屬的核酸雙鏈，第一及第二核酸鏈包括多個通過主鏈共價連接的含氮芳香族堿基，第一核酸鏈的含氮芳香族堿基通過氫鍵與第二核酸鏈的含氮芳香族堿基相連，第一及第二核酸鏈上的含氮芳香族堿基形成氫鍵結合的堿基對，其沿著導電性的含金屬的核酸雙鏈的長度方向堆疊排列，氫鍵結合的堿基對包括內(nèi)部螯合的二價金屬陽離子，其與芳香族的含氮芳香族堿基之一中的氮原子形成配位鍵。
11.權利要求1到10中任何一項的方法，其中電路性能信息在Nyquist圖中顯示。
12.權利要求1到11中任何一項的方法，其中多個核酸在電極上形成核酸雙鏈單層。
13.權利要求1到12中任何一項的方法，其中電化學電路包括電解質水溶液，而且核酸限制在并溶劑化于電解質水溶液中。
14.權利要求13的方法，在水溶液中進一步包括氧化還原探針。
15.權利要求1到14中任何一項的方法，其中核酸雙鏈為雙螺旋。
16.一種檢測附著于電化學電路中的電極上的核酸雙鏈中堿基對錯配的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括a)對電化學電路中的電極施加電能的裝置；b)收集與電路中電極上的核酸雙鏈的阻抗有關的電化學電路數(shù)據(jù)的裝置；以及c)將電化學電路數(shù)據(jù)與電路模型擬合，以獲得指示核酸雙鏈中堿基對錯配的電路性能信息的裝置。
17.一種檢測附著于電化學電路中的電極上的核酸雙鏈中堿基對錯配的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括a)電源，用于對電化學電路中的電極施加電能；b)控制器，用于收集與電路中電極上的核酸雙鏈的阻抗有關的電化學電路數(shù)據(jù)；以及c)分析儀，用于將電化學電路數(shù)據(jù)與電路模型擬合，以獲得指示核酸雙鏈中堿基對錯配的電路性能信息。
18.權利要求17的系統(tǒng)，進一步包括顯示器用以顯示電路性能信息。
19.權利要求17或18的系統(tǒng)，進一步包括記錄儀用以記錄電路性能信息。
20.一種通過測量電極上的核酸層的阻抗來檢測核酸雙鏈中錯配的方法，[B2]基本上如上所述并且參考實施例和附圖。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了通過測定電極上核酸層的阻抗，例如通過AC阻抗譜學等來檢測核酸雙鏈中的錯配的方法及裝置。
文檔編號G01N27/02GK1784497SQ200480012133
公開日2006年6月7日 申請日期2004年3月4日 優(yōu)先權日2003年3月5日
發(fā)明者J·S·李, H-B·克拉茨, 李晨鐘, 龍億濤 申請人:薩斯喀徹溫大學技術公司