本發(fā)明屬于抗體的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人源程序性死亡因子配體pd-l2單克隆抗體及其制備方法。

背景技術(shù)：

pd-l2作為b7家族的第5個(gè)成員，曾被命名為b7-dc、btdc，是程序性死亡因子因子1(programmeddeath-1,pd-1)的主要配體之一。b7家族作為唯一能從apc單向傳送信號(hào)至t細(xì)胞的共刺激分子，是僅可以從抗原提呈細(xì)胞apc單向傳遞信號(hào)至t細(xì)胞共同刺激的分子，與cd28家族分子以配體-受體的形式，提供t細(xì)胞活化過(guò)程雙重信號(hào)，腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)pd-l2分子，通過(guò)pd-l2與t細(xì)胞表面受體pd-l2分子的結(jié)合，傳遞負(fù)性抑制信號(hào)，躲避cd8+t細(xì)胞的殺傷作用，減弱機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，造成腫瘤免疫逃逸。因此，hpd-l2作為腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)，需要準(zhǔn)確和高靈敏的免疫組化技術(shù)對(duì)其檢測(cè)。

免疫組化技術(shù)是20世紀(jì)70年代初sterbberger在酶標(biāo)法的基礎(chǔ)上以免疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)為理論基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，可對(duì)組織和細(xì)胞內(nèi)的特定抗原或抗體(多肽和蛋白質(zhì))進(jìn)行定位、定性或定量檢測(cè)。目前，免疫組化技術(shù)在臨床檢測(cè)的應(yīng)用包括良性和惡性腫瘤的診斷與鑒定、腫瘤分期、腫瘤來(lái)源的鑒定、區(qū)分組織器官交界處腫瘤、發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶和指導(dǎo)腫瘤的治療。因此，有必要制備高純度、高特異性的hpd-l2單克隆抗體，利用免疫組化技術(shù)指導(dǎo)腫瘤的診斷和治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種人源程序性死亡因子配體pd-l2單克隆抗體的制備方法。

為此采用如下的技術(shù)方案：

一種人源程序性死亡因子配體hpd-l2單克隆抗體，所述抗體包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述的重鏈可變區(qū)堿基序列和氨基酸序列分別如seqidno.1-2所示，輕鏈可變區(qū)的堿基序列和氨基酸序列分別如seqidno.3-4所示。

所述抗體為如下1）或2）所示的蛋白質(zhì)：

1）重鏈與輕鏈可變區(qū)由seqidno.1-4所示的堿基序列或氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

2）將seqidno.1-4所示的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的堿基序列或氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基/氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白質(zhì)的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)。

所述抗體的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)編碼dna分子，所述編碼dna分子為如下1）-3）中任一所述的dna分子：

1）其輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列所示；

2）與seqidno.1-4中序列限定的dna分子雜交且編碼權(quán)利要求1-2中任一所述抗體的dna分子；

3）與1）的dna分子具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1-2中任一所述的抗體的dna分子。

所述的單克隆抗體的重組表達(dá)載體或表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

任一所述的抗體在如下a）-c）中任一種中的應(yīng)用：

a）制備特異性結(jié)合人源程序性死亡因子配體pd-l2的產(chǎn)品；

b)制備利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中pd-l2的產(chǎn)品；

c)制備作為治療腫瘤的藥物。

一種人源程序性死亡因子配體hpd-l2單克隆抗體的制備方法，采用如下步驟：

1）利用分子克隆的手段構(gòu)建hpd-l2胞外段的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至宿主菌rosseta（de3）中進(jìn)行蛋白表達(dá)，純化后，獲得高純度、構(gòu)象均一的hpd-l2蛋白；

2）將制備好的hpd-l2抗原腹腔注射至balb/c小鼠體內(nèi)；

3）重復(fù)步驟2）再將強(qiáng)免疫2次后，取血，利用elisa技術(shù)檢測(cè)血清中抗體效價(jià)；

4）取效價(jià)達(dá)到要求高于10⁶的balb/c小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，制備雜交瘤細(xì)胞；

5）對(duì)分泌hpd-l2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行2~3次的克隆化培養(yǎng)；

6）將步驟5）獲得的克隆化培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得較高濃度的抗hpd-l2蛋白的單克隆抗體；

7）利用proteina親和層析柱對(duì)細(xì)胞上清單抗進(jìn)行純化；

8）特異性檢測(cè)：利用免疫組化技術(shù)對(duì)獲得的抗體的特異性進(jìn)行檢測(cè)；

9）利用pcr技術(shù)對(duì)制備的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)進(jìn)行基因測(cè)序。

具體為：

1）獲取抗原h(huán)pd-l2蛋白：人源pd-l2基因，定位于人類的9號(hào)染色體長(zhǎng)臂(9q24.2)，pd-l2的cdna的全長(zhǎng)約為1.7kb，由247個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量（mr）約為25000（包括20個(gè)氨基酸的n端信號(hào)肽），其中胞外區(qū)包括200個(gè)氨基酸，跨膜區(qū)包括23個(gè)氨基酸，胞內(nèi)區(qū)包括31個(gè)氨基酸，胞外區(qū)有igv樣區(qū)和igc樣區(qū)，igv樣區(qū)長(zhǎng)度為93個(gè)氨基酸，igc樣區(qū)的長(zhǎng)度為95個(gè)氨基酸。利用軟件primerpremier5.0設(shè)計(jì)hpd-l2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的上游引物和下游引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）技術(shù)擴(kuò)增獲得hpd-l2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域20-208的基因，分別對(duì)該目的基因與表達(dá)載體pet-27b進(jìn)行雙酶切，然后利用t4-dna連接酶進(jìn)行酶連，獲得重組質(zhì)粒pet-27b-hpd-l2，送至基因測(cè)序。將測(cè)序正確重組質(zhì)粒pet-27b-hpd-l2轉(zhuǎn)化至宿主菌rosseta（de3）中，進(jìn)行蛋白表達(dá)。根據(jù)聚丙烯凝膠電泳（sds-page）的結(jié)果，hpd-l2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域以包涵體的形式表達(dá)。將hpd-l2蛋白的包涵體溶于含有8m尿素的tris-nacl緩沖液中，進(jìn)行ni柱純化，然后利用復(fù)性緩沖液（0.06g氧化型谷胱甘肽，0.3g還原型谷胱甘肽，12.11gtris，210.66gl-精氨酸鹽酸鹽，0.02g丙胺磺酸鹽，11.69gnacl，一次水定容1l，ph8.5），進(jìn)行hpd-l2蛋白的復(fù)性，獲得空間折疊正確、構(gòu)象均一的抗原。最后再利用akta蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)一步純化hpd-l2蛋白，獲得高純度、高構(gòu)象均一性的抗原蛋白。

2）用pbs將步驟1）獲得的hpd-l2蛋白稀釋至1mg/ml，然后與等體積的完全弗氏佐劑（ifc）混合，利用乳化器將混合物乳化至滴水不化后，選取6~8周齡的balb/c小鼠進(jìn)行腹腔免疫，注射劑量為：100μg/只。

3）重復(fù)步驟2）所述，加強(qiáng)免疫兩次：第15天，改換成弗式不完全佐劑，注射劑量為：50μg/只；第29天，弗式不完全佐劑，注射劑量為：50μg/只。

4）第三次注射2周后，尾部取血并測(cè)定血清效價(jià)；利用elisa檢測(cè)balb/c小鼠血清中的抗體效價(jià)，取效價(jià)達(dá)到要求（高于10⁶）的balb/c小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，制備雜交瘤細(xì)胞，融合前三天加強(qiáng)免疫一次，直接不加佐劑，免疫劑量50μg/只。

5）融合2周左右，利用elisa法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，包被抗原為hpd-l2蛋白，獲得分泌hpd-l2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

6）對(duì)于5）步驟獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行2~3次的克隆化培養(yǎng)，每次克隆化培養(yǎng)約7-10天，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，標(biāo)出肉眼可見(jiàn)的只有單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔，進(jìn)行抗體檢測(cè)；將檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞再次擴(kuò)大培養(yǎng)，直至100%孔分泌hpd-l2蛋白單克隆抗體，建系保存該雜交瘤細(xì)胞株。

7）將步驟6）克隆化培養(yǎng)、篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)內(nèi)，獲得抗hpd-l2蛋白高濃度細(xì)胞上清單抗。

8）將2g左右的proteina填料與10mlph7.0的tris緩沖液混合，倒入層析柱，靜置5-10min，使得填料自然沉降，得到無(wú)氣泡的proteina填料柱；加入10倍柱體積的ph7.0的tris緩沖液，并以合適的流速?zèng)_洗柱子；將步驟7）獲得高濃度單抗與ph7.0的tris緩沖液按照體積比1:2混合后，用0.45μm濾膜過(guò)濾后，加入層析柱中進(jìn)行親和層析，然后利用洗脫液（ph4.50.1m檸檬酸溶液加ph8.0的中和液）洗脫抗體，將洗脫液利用pbs透析三次，最后利用超濾濃縮管濃縮抗體溶液，獲得高純度、高濃度的hpd-l2單克隆抗體。

9）利用pcr技術(shù)對(duì)制備的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)進(jìn)行基因測(cè)序。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本抗體是完全人源性抗體，具有高特異性、高親和力和高靈敏度，且抗體具有很好的膜定位；本發(fā)明純化抗體的方法是利用proteina填料來(lái)純化，得到的單克隆抗體純度更高。本發(fā)明所采用的人源pd-l2蛋白制備的單克隆抗體能夠?yàn)槟[瘤的診斷與治療提供一定的科學(xué)指導(dǎo)。

附圖說(shuō)明

圖1：hpd-l2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域基因克隆的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道m(xù)：dnaladder；泳道1-3：分別表示于50、55與58溫度條件下獲得的pcr產(chǎn)物。

圖2：hpd-l2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)鑒定的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。泳道m(xù)：蛋白marker；泳道1：純化獲的hpd-l2蛋白。

圖3：hpd-l2單抗的免疫組化特異性檢測(cè)圖。

圖4：hpd-l2單抗檢測(cè)pd-l2蛋白的wb結(jié)果圖。泳道a：陰性對(duì)照；泳道b：制備的hpd-l2單抗檢測(cè)pd-l2蛋白結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

具體采用如下步驟：

1）首先獲取抗原h(huán)pd-l2蛋白：本發(fā)明選取hpd-l2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域作為抗原，其堿基數(shù)約為560bp，蛋白分子量約為22kda。利用引物設(shè)計(jì)軟件primerpremier5.0設(shè)計(jì)hpd-l2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的上游引物：5’ggactgccatatgttcacagtgacagtcc’（酶切位點(diǎn)，ndei）和下游引物：5’aatctcgaggtcaatgctggccaaag’（酶切位點(diǎn)，xhoi），利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）技術(shù)擴(kuò)增獲得大量hpd-l2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的基因，分別對(duì)該目的基因與載體pet-27b進(jìn)行雙酶切，然后利用t4-dna連接酶進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pet-27b-hpd-l2，送去基因測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pet-27b-hpd-l2轉(zhuǎn)化至宿主菌rosseta（de3）中，挑取陽(yáng)性單克隆菌落，接種于35mg/l卡納抗性lb培養(yǎng)基的10ml試管中，37℃，200rpm/min培養(yǎng)過(guò)夜；將10ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種于含有35mg/l卡納抗性的1llb培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，220rpm/min培養(yǎng)至菌液od值達(dá)到0.8-1.0，加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）至終濃度0.5mm，37℃，190rpm/min培養(yǎng)8h，進(jìn)行蛋白表達(dá)。收集菌體，重懸于50mlpbs中（含0.1mmpmsf），超聲破碎，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）鑒定，結(jié)果表明：hpd-l2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域以包涵體的形式表達(dá)。將hpd-l2蛋白的包涵體溶于含有8m尿素的tris-nacl緩沖液中，進(jìn)行ni柱純化。將含有高純度的hpd-l2蛋白的ni柱洗脫液利用復(fù)性緩沖液（0.06g氧化型谷胱甘肽，0.3g還原型谷胱甘肽，12.11gtris,210.66gl-精氨酸鹽酸鹽，0.02gndsb,11.69gnacl，一次水定容1l，ph8.5）進(jìn)行復(fù)性，獲得空間折疊正確、構(gòu)象均一的抗原。最后再利用akta純化系統(tǒng)的g75柱進(jìn)一步對(duì)hpd-l2蛋白進(jìn)行純化，獲得高純度、構(gòu)象均一性的抗原蛋白。

2）用pbs將步驟1）獲得的hpd-l2蛋白稀釋至1mg/ml，然后與等體積的完全弗氏佐劑（ifc）混合，利用乳化器將混合物乳化至滴水不化；選取6~8周齡的balb/c小鼠進(jìn)行腹部多點(diǎn)注射免疫，每只小鼠注射劑量為：100μg，免疫前三天進(jìn)行取血當(dāng)為空白血清。

3）重復(fù)步驟2）所述，加強(qiáng)免疫兩次：第15天，每只小鼠注射劑量為：50μg；第29天，每只小鼠注射劑量為：50μg，加強(qiáng)免疫用弗式不完全佐劑。

4）第三次注射2周后，尾部取血并測(cè)定血清效價(jià)；利用elisa檢測(cè)balb/c小鼠血清中的抗體效價(jià)，以空白對(duì)照組血清為陰性對(duì)照，pbs為空白對(duì)照；效價(jià)高于10⁶時(shí)，表明抗體具有足夠的抗體滴度和親和力，取該balb/c小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，制備雜交瘤細(xì)胞。

5）融合2周左右，利用elisa法對(duì)雜交瘤細(xì)胞的抗體進(jìn)行檢測(cè)和篩選，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，包被抗原為hpd-l2蛋白；最終獲得分泌hpd-l2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

6）對(duì)于5）步驟獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行2~3次的克隆化篩選和培養(yǎng)；每次克隆化培養(yǎng)約7-10天，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，標(biāo)出肉眼可見(jiàn)的只有單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔，進(jìn)行抗體檢測(cè)；將檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞再次擴(kuò)大培養(yǎng)，直至100%孔分泌hpd-l2單克隆抗體，建系保存該雜交瘤細(xì)胞株。

7）細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)制備單抗：建系的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清單抗，先將細(xì)胞上清低速離心以除去細(xì)胞等雜質(zhì)，收集上清后再采用高速離心以除去細(xì)小顆粒。

8）將2g左右的proteina填料與10mlph7.0的tris緩沖液混合，倒入層析柱，靜置5-10min，使得填料自然沉降，得到無(wú)氣泡的proteina填料柱；加入10倍柱體積的ph7.0的tris緩沖液，并以合適的流速?zèng)_洗柱子；將步驟7）獲得的高濃度hpd-l2單抗與ph7.0的tris緩沖液按照體積比1:2混合后，用0.45μm濾膜過(guò)濾后，倒入層析柱中進(jìn)行親和層析純化，利用10倍柱體積的ph7.0的tris緩沖液進(jìn)行洗脫非特異性吸附的雜質(zhì)，然后利用洗脫液（ph4.50.1m檸檬酸溶液加ph8.0的中和液）洗脫hpd-l2單體，用pbs將洗脫液透析三次，最后利用超濾濃縮管濃縮抗體溶液，獲得高純度、高濃度的hpd-l2單克隆抗體。

9）hpd-l2單克隆抗體的特異性檢測(cè)：利用免疫組化技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，選取hpd-l2的陽(yáng)性組織切片進(jìn)行脫蠟和水化處理，之后封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和非特異性抗原。接著加一抗、二抗，最后dab顯色和核染。本發(fā)明所述的hpd-l2單克隆抗體具有很好的膜定位、特異性很強(qiáng)、能夠很好的檢測(cè)hpd-l2陽(yáng)性組織（如圖3）。

10）hpd-l2單克隆抗體亞型測(cè)定：利用鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑盒采用elisa檢測(cè)法對(duì)balb/c小鼠和f1小鼠腹水純化的hpd-l2單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果表明：hpd-l2單克隆抗體屬于igg3亞類，其輕鏈為k鏈。

11）利用pcr技術(shù)對(duì)制備的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)進(jìn)行基因測(cè)序。

表1elisa檢測(cè)balb/c小鼠血清中的抗體效價(jià)表

取效價(jià)達(dá)到要求的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，融合后兩周，進(jìn)行elisa檢測(cè)，elisa步驟和結(jié)果如表2：

（1）包被：用包被緩沖液將本發(fā)明制備的pd-l2蛋白稀釋至1μg/ml，然后包被聚苯乙烯板的反應(yīng)孔，100μl/孔，4℃過(guò)夜。

（2）洗滌：棄去孔內(nèi)的包被液，用洗滌緩沖液孔洗滌3次反應(yīng)孔，3×3min（以下簡(jiǎn)稱洗滌）。

（3）封閉：每孔加入200μl的封閉液，37℃封閉2h；盡量棄盡封閉液。

（4）加一抗：每孔加入稀釋5倍細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃下孵育1h；孵育完畢后棄盡一抗，充分洗滌后甩干。

（5）加二抗：每孔加入100μl用稀釋液稀釋至一定濃度的hrp-羊抗小鼠igg二抗，37℃下孵育30min；孵育完畢后棄盡酶標(biāo)二抗，洗滌，甩干。

（6）顯色：每孔加入100μl底物tmb，37℃避光反應(yīng)15min；每孔加入100ml的終止液以終止顯色反應(yīng)。測(cè)定450nm的吸光度值（a450）。

表2骨髓瘤細(xì)胞融合后兩周的elisa結(jié)果

注釋：粗體下劃線：>1.5；斜體加框體：0.95-1.5

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：從elisa結(jié)果中可以看出陰性的結(jié)果（nc）只有0.1284，陽(yáng)性結(jié)果（pc）為over。表中標(biāo)記的是抗體效價(jià)較高的融合細(xì)胞株，分別是：a3、c2、d8、d9、e6；這5株細(xì)胞株是對(duì)pd-l2特異性較強(qiáng)、產(chǎn)生抗pd-l2抗體較多的細(xì)胞株。將這5株細(xì)胞株進(jìn)行進(jìn)一步的克隆化培養(yǎng)，直至獲得特異性更強(qiáng)、100%分泌單克隆抗體的融合細(xì)胞株。

表3hpd-l2單抗亞型的elisa結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：經(jīng)亞型鑒定試劑盒鑒定，所以本次發(fā)明的抗體重鏈亞型為igg3，輕鏈為κ型。

實(shí)施例2

利用western-blot技術(shù)檢測(cè)pd-l2蛋白，具體操作步驟如下：

1）對(duì)含有pd-l2蛋白的生物樣品，利用15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后取下page膠，與pvdf膜做成“三明治”形狀，用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

2）電轉(zhuǎn)完畢，取下pvdf膜，加入5%bsa-tbst(蛋白面朝下），于37?c搖床搖蕩（65rpm）封閉1h，以消除非特異性背景。

3）封閉結(jié)束后用tbst洗掉5%bsa-tbst，加入一抗：本發(fā)明制備的hpd-l2的單克隆抗體，于脫色搖床搖蕩孵育（60rpm）1h或者4?c孵育過(guò)夜（12-16h），使一抗與特異蛋白結(jié)合。

4）回收一抗，用tbst在搖床中洗4次（60rpm），洗脫時(shí)間分別為5min、10min、15min、20min。

5）加入二抗，于脫色搖床孵育（60rpm）1h，使二抗與一抗充分結(jié)合。

6）回收二抗，用tbst在搖床中洗4次（60rpm），洗脫時(shí)間分別為5min、10min、15min、20min。

7）用ecl顯色試劑盒（200μl試劑a/張+200μl試劑b/張）孵育3min。去掉反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移到保鮮膜上，壓片顯影定影。定影后自然干燥，佳能相機(jī)拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如附圖4）。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明、不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明、對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)、在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下、還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換、都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明所提交的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>福州大學(xué)

<120>一種人源程序性死亡因子配體hpd-l2單克隆抗體

<130>4

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<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>252

<212>dna

<213>重鏈可變區(qū)堿基序列

<400>1

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<210>2

<211>83

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<213>重鏈可變區(qū)氨基酸序列

<400>2

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<213>輕鏈可變區(qū)堿基序列

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<213>輕鏈可變區(qū)氨基酸序列

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