本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)?00980124312.0的分案申請(qǐng)。相關(guān)信息本申請(qǐng)要求2008年6月25日提交的us61/075,697、2009年2月24日提交的us61/155,041和2009年2月24日提交的us61/155,105的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明背景單克隆抗體、其綴合物和衍生物作為治療性和診斷性試劑具有巨大的商業(yè)重要性。非人抗體通常在單次低劑量注射后在患者中引發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答(schroff，1985cancerres45:879-85，shawler.jimmunol1985135:1530-5；dillman，cancerbiother19949:17-28)。因此，開(kāi)發(fā)了減弱鼠和其他嚙齒類動(dòng)物抗體的免疫原性的幾個(gè)方法以及使用例如轉(zhuǎn)基因小鼠或噬菌體展示產(chǎn)生完全人抗體的技術(shù)。改造嵌合抗體，所述嵌合抗體將嚙齒類動(dòng)物可變區(qū)與人恒定區(qū)組合(例如，bouliannenature1984312:643-6)，顯著地減少了免疫原性問(wèn)題(例如，lobuglio，procnatlacadsci198986:4220-4；clark，immunoltoday200021:397-402)。還對(duì)人源化的抗體進(jìn)行改造，其中改造可變區(qū)本身的嚙齒類動(dòng)物序列以盡可能接近人序列同時(shí)保持至少原始cdr，或其中將來(lái)自嚙齒類動(dòng)物抗體的cdr移植入人抗體的構(gòu)架(例如，riechmann，nature1988332:323-7；us5,693,761)。兔多克隆抗體被廣泛地用于生物測(cè)定例如elisa或western印跡。多克隆兔抗體由于其通常高得多的親和力而通常比多克隆嚙齒類動(dòng)物抗體更有利。此外，兔通常能夠引發(fā)良好的對(duì)抗原的抗體應(yīng)答，所述抗原在小鼠中具有較弱的免疫原性和/或當(dāng)用于噬菌體展示時(shí)不產(chǎn)生良好的結(jié)合劑。由于兔抗體的這些熟知的有利方面，因而它們被理想地用于治療性抗體的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)。未普遍進(jìn)行該應(yīng)用的原因主要是由于單克隆兔抗體的產(chǎn)生的技術(shù)挑戰(zhàn)。因?yàn)楣撬枇鰳幽[瘤在兔中是未知的，因此產(chǎn)生單克隆抗體的常規(guī)雜交瘤技術(shù)不適用于兔抗體。為表達(dá)兔抗體的細(xì)胞提供融合細(xì)胞系伴侶的開(kāi)拓工作已由knight和colleagues(spieker-polet等人，pnas1995，92:9348-52)進(jìn)行并且改善的融合伴侶細(xì)胞系已由pytela等人在2005年(參見(jiàn)例如美國(guó)專利7429487)進(jìn)行了描述。然而，該技術(shù)未得到廣泛地推廣，因?yàn)橄鄳?yīng)的專門技術(shù)基本上由單個(gè)研究小組控制。用于產(chǎn)生單克隆抗體的可選擇的方法(其包括通過(guò)rt-pcr從選擇的表達(dá)抗體的細(xì)胞克隆抗體)描述于文獻(xiàn)中，但對(duì)于兔抗體從未有成功的報(bào)導(dǎo)。如果用于人治療，預(yù)期兔抗體(與鼠抗體一樣)引發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答，因此，兔抗體需要先進(jìn)行人源化，然后才可將其用于臨床。然而，用于產(chǎn)生人源化的嚙齒類動(dòng)物抗體的方法由于分別地兔與小鼠抗體之間以及兔與人抗體之間的結(jié)構(gòu)差異而不能容易地推廣至兔抗體。例如，輕鏈cdr3(cdrl3)通常比之前已知的來(lái)自人或小鼠抗體的cdrl3長(zhǎng)得多。然而，存在少數(shù)幾個(gè)現(xiàn)有技術(shù)中描述的兔抗體人源化的方法，然而所述方法無(wú)其中將非人供體的cdr移植在人受體抗體上的經(jīng)典移植方法。wo04/016740描述了所謂的“表面再建(resurfacing)”策略?！氨砻嬖俳ā辈呗缘哪康氖歉脑旆侨藰?gòu)架的溶劑可及的殘基以便它們變得更象人的殘基。wo04/016740中所述的用于兔抗體的相似人源化技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。wo08/144757和wo05/016950公開(kāi)了用于人源化兔單克隆抗體的方法，其包括將親本兔抗體的氨基酸序列與相似人抗體的氨基酸序列相比較。然后，改變親本兔抗體的氨基酸序列以便其構(gòu)架區(qū)在序列上與相似人抗體的等同構(gòu)架區(qū)更相似。為了獲得良好的結(jié)合能力，對(duì)于每一種免疫結(jié)合劑，需要單獨(dú)地進(jìn)行繁重的開(kāi)發(fā)努力。上述方法的潛在問(wèn)題是，不使用人構(gòu)架而是改造兔構(gòu)架以便其看起來(lái)更象人的。此類方法具有風(fēng)險(xiǎn)：包埋在蛋白質(zhì)核心中的氨基酸區(qū)段仍可能包含免疫原性t細(xì)胞表位。迄今為止，本申請(qǐng)者仍未鑒定到通過(guò)應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)移植方法而人源化的兔抗體。這可由兔cdr可能與人或嚙齒類動(dòng)物cdr顯著不同的事實(shí)來(lái)解釋。如本領(lǐng)域中已知的，許多兔vh鏈相對(duì)于鼠和人對(duì)應(yīng)物具有額外配對(duì)的半胱氨酸。除了cys22與cys92之間形成的保守二硫橋外，在一些兔鏈中還存在cys21-cys79橋以及在cdrh1的最后一個(gè)殘基與cdrh2的第一個(gè)殘基之間形成的cdr間s-s橋。除此以外，半胱氨酸殘基對(duì)通常見(jiàn)于cdr-l3中。此外，許多兔抗體cdr不屬于任何之前已知的經(jīng)典結(jié)構(gòu)。特別地，cdr-l3通常比人或鼠對(duì)應(yīng)物的cdr-l3長(zhǎng)得多。因此，非人cdr抗體至人構(gòu)架的移植是主要的蛋白質(zhì)改造任務(wù)。必須將來(lái)自天然進(jìn)化的構(gòu)架的抗原結(jié)合環(huán)轉(zhuǎn)移至不同的人工選擇的人構(gòu)架，以使天然環(huán)構(gòu)象得到保持以進(jìn)行抗原結(jié)合。通常抗原結(jié)合親和力在環(huán)移植后大大降低或消除。仔細(xì)選擇的人構(gòu)架在移植抗原結(jié)合環(huán)中的使用使得在人源化分子中保持結(jié)合親和力的概率最大化(roguzka等人1996)。雖然可在文獻(xiàn)中獲得的許多移植實(shí)驗(yàn)提供了cdr移植的大致指導(dǎo)，但不可能使模式普遍化。典型的問(wèn)題在于，在移植cdr環(huán)后喪失了特異性、穩(wěn)定性或可生產(chǎn)性。因此，存在對(duì)用于可靠且快速地人源化用作治療劑和診斷劑的兔抗體的改進(jìn)的方法的迫切需要。此外，還存在對(duì)用于可靠地人源化兔抗體、提供具有藥物樣生物物理性質(zhì)的功能性抗體和/或抗體片段的人受體構(gòu)架的需要。發(fā)明概述已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)質(zhì)量控制(qc)測(cè)定(如wo0148017中和aufdermaur等人(2001)，febslett508，p.407-412中公開(kāi)的)鑒定的高度可溶的和穩(wěn)定的人抗體構(gòu)架特別適合于容納來(lái)自其他非人動(dòng)物物種的cdr例如兔cdr。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了特定人抗體(所謂的“fw1.4”抗體)的輕鏈和重鏈可變區(qū)，其特別適合作為來(lái)自具有不同結(jié)合特異性的多種抗體的cdr，特別是來(lái)自兔抗體的cdr的通用受體，無(wú)論二硫橋是否存在于cdr中。此外，本發(fā)明提供了所述特定人抗體構(gòu)架的兩個(gè)突變序列，即rfw1.4和rfw1.4(v2)，兩者都是特別適合作為用于兔cdr的移植的通用受體構(gòu)架的構(gòu)架。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使人構(gòu)架適合于容納來(lái)自其他非人動(dòng)物物種的cdr特別是兔cdr的構(gòu)架殘基的基序。通過(guò)將兔cdr移植入此類高度相容的可變輕鏈和重鏈構(gòu)架產(chǎn)生的人源化免疫結(jié)合劑一致且可靠地保持供體cdr所來(lái)源的兔抗體的空間定位。因此，不必將供體免疫結(jié)合劑的結(jié)構(gòu)相關(guān)位置引入受體構(gòu)架。由于這些有利方面，可實(shí)現(xiàn)兔抗體的高通量人源化，無(wú)需進(jìn)行或幾乎無(wú)需進(jìn)行結(jié)合能力的優(yōu)化。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將兔cdr和其他非人cdr移植入本文中公開(kāi)的可溶和穩(wěn)定的輕鏈和/或重鏈人抗體構(gòu)架序列，從而產(chǎn)生具有優(yōu)良生物物理性質(zhì)的人源化抗體的方法。特別地，通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的免疫結(jié)合劑展示優(yōu)良的功能性質(zhì)例如溶解性和穩(wěn)定性。附圖概述圖1描述了本文中用于將抗原結(jié)合部位從兔單克隆抗體移植入高度可溶和穩(wěn)定的人抗體構(gòu)架的cdrh1的界定。圖2示意性顯示了用熒光抗體2標(biāo)記的b細(xì)胞1與用細(xì)胞內(nèi)染料4染色的表達(dá)靶的細(xì)胞3相互作用。靶的選擇:5；bcr:6。圖3:結(jié)合esba903可溶性靶的兔b細(xì)胞的facs選擇方法。圖3a:根據(jù)前向和側(cè)向散射門控淋巴細(xì)胞。圖3b：其中，選擇igg+igm-細(xì)胞(可能地記憶b細(xì)胞)(紅色門控)。圖3c:用esba903-pe和esba903-percp雙染色的細(xì)胞(綠色門控)預(yù)期編碼高親和力的抗esba903的igg。在96孔板中分選顯示最亮的熒光的細(xì)胞(粉紅色門控)。圖4.用抗tnfα抗體(pe標(biāo)記的)包被的珠粒結(jié)合tnfα轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞(上圖)?？筩d19抗體(apc標(biāo)記的)包被的對(duì)照珠粒不結(jié)合tnfα轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞(中圖)。用抗tnfα抗體(pe標(biāo)記的)包被的珠粒不結(jié)合野生型(wt)cho細(xì)胞(下圖)。左邊的散點(diǎn)圖(dotplot)顯示前向散射和側(cè)向散射，其分別表示事件的大小和粒度。單個(gè)珠粒(～3um)的群體被門控在p2中。最終結(jié)合至珠粒的cho細(xì)胞(～30um)被門控在p1中。中間的散點(diǎn)圖顯示就其pe或apc染色而言的p1事件(cho細(xì)胞)。因此，如果細(xì)胞與抗tnfα珠粒相互作用，那么它們將示于p3門控中，如果它們與抗cd19珠粒相互作用，那么它們將出現(xiàn)在p4門控中。在右邊，詳述了各樣品的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。圖5.將用抗tnfα-pe包被的珠粒和用抗cd19-apc包被的珠粒與tnfα轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞混合在一起。cho細(xì)胞被門控(p1)，并且其中結(jié)合抗tnfα-pe包被的珠粒或抗cd19-apc包被的珠粒的細(xì)胞分別示于門控p3和p4中。未結(jié)合的珠?？稍陂T控p2中看到。圖6.獲自kabat數(shù)據(jù)庫(kù)的兔抗體序列的分析確認(rèn)，可變重鏈的cdr3通常比其鼠對(duì)應(yīng)物長(zhǎng)3個(gè)氨基酸。發(fā)明詳述定義為了可更容易地理解本發(fā)明，將如下定義某些術(shù)語(yǔ)。另外的定義示于本說(shuō)明書的上下文中。術(shù)語(yǔ)“抗體”是指完整抗體和任何抗原結(jié)合片段。術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合多肽”和“免疫結(jié)合劑”在本文中同時(shí)使用?！翱贵w”是指包含通過(guò)二硫鍵鏈間連接的至少兩個(gè)重鏈(h)和兩個(gè)輕鏈(l)的蛋白質(zhì)(任選地被糖基化)或其抗原結(jié)合部分。各重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為vh)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域ch1、ch2和ch3。各輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為vl)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域cl。vh和vl區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的高變區(qū)，以及散布于其間的稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的更保守的區(qū)域。各vh和vl由以下列順序從氨基末端至羧基末端排列的3個(gè)cdr和4個(gè)fr組成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白對(duì)宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(c1q))的結(jié)合。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱“抗體部分”)是指抗體的保持特異性結(jié)合抗原(例如，tnf)的能力的一個(gè)或多個(gè)片段。已顯示可利用全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)進(jìn)行抗體的抗原結(jié)合功能。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”中包含的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)f(ab')2片段，包含通過(guò)鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個(gè)fab片段的二價(jià)片段，(iii)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iv)由抗體的單臂的vh和vl結(jié)構(gòu)域組成的fv片段；(v)單結(jié)構(gòu)域或dab片段(ward等人,(1989)nature341：544-546)，其由vh結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)或(vii)可任選地通過(guò)合成的接頭連接的兩個(gè)或更多個(gè)分離的cdr的組合。此外，雖然fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域vl和vh由分開(kāi)的基因編碼，但可使用重組方法，通過(guò)合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產(chǎn)生為其中vl和vh區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子的單個(gè)蛋白質(zhì)鏈(稱為單鏈fv(scfv)；參見(jiàn)，例如，bird等人(1988)science242:423-426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sciusa85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”中。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得此類抗體片段，并且以與對(duì)于完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段?？赏ㄟ^(guò)重組dna技術(shù)或通過(guò)酶促或化學(xué)斷裂完整免疫球蛋白來(lái)產(chǎn)生抗原結(jié)合部分?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亞型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗體。術(shù)語(yǔ)“免疫結(jié)合劑”是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分抗原結(jié)合位置，例如重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，這樣免疫結(jié)合劑能夠特異性識(shí)別靶抗原。免疫結(jié)合劑的非限定性實(shí)例包括全長(zhǎng)免疫球蛋白分子和scfv，以及抗體片段，包括但不限于(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)f(ab')2片段，包含通過(guò)鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個(gè)fab片段的二價(jià)片段，(iii)fab'片段，其基本上是具有鉸鏈區(qū)的一部分的fab(參見(jiàn),fundamentalimmunology(paul編輯，3.sup.rded.1993)；(iv)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(v)由抗體的單臂的vl和vh結(jié)構(gòu)域組成的fv片段；(vi)單結(jié)構(gòu)域抗體例如dab片段(ward等人,(1989)nature341：544-546)，其由vh或vl結(jié)構(gòu)域組成，camelid(參見(jiàn)hamers-casterman等人，nature363：446-448(1993)和dumoulin等人，proteinscience11：500-515(2002))或shark抗體(例如，sharkig-nars)；和(vii)納米抗體(nanobody)，包含單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)“單鏈抗體”、“單鏈fv”或“scfv”意指包含通過(guò)接頭連接的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(或區(qū)域；vh)和抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(或區(qū)域；vl)的分子。此類scfv分子可具有一般結(jié)構(gòu)：nh2-vl-接頭-vh-cooh或nh2-vh-接頭-vl-cooh。合適的現(xiàn)有技術(shù)接頭由重復(fù)的ggggs氨基酸序列或其變體組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用具有seqidno:8中所示的氨基酸序列的(ggggs)4接頭，但也可使用1-3個(gè)重復(fù)的變體(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)?？捎糜诒景l(fā)明的其他接頭由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“功能性質(zhì)”是例如為了提高多肽的生產(chǎn)性質(zhì)或治療功效，其提高(例如相對(duì)于常規(guī)多肽)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫結(jié)合劑)的性質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是穩(wěn)定性(例如，熱穩(wěn)定性)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是溶解性(例如，在細(xì)胞條件下)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是聚集行為。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是蛋白質(zhì)表達(dá)(例如，在原核細(xì)胞中)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能性質(zhì)是在制造方法中內(nèi)含體溶解后的重折疊行為。在某些實(shí)施方案中，功能性質(zhì)不是抗原結(jié)合親和力的提高。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)功能性質(zhì)的改善對(duì)免疫結(jié)合劑的結(jié)合親和力沒(méi)有顯著影響。術(shù)語(yǔ)“cdr”是指抗體的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)主要促成抗原結(jié)合的6個(gè)高變區(qū)之一。所述6個(gè)cdr的最常用的定義之一由kabate.a.等人，(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.nihpublication91-3242)提供。如本文中使用的，cdr的kabat定義只應(yīng)用于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr1、cdr2和cdr3(cdrl1、cdrl2、cdrl3或l1、l2、l3)，以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr2和cdr3(cdrh2、cdrh3或h2、h3)。然而，如本文中使用的，根據(jù)下列殘基位置(kabat編號(hào))定義重鏈可變結(jié)構(gòu)域的cdr1(cdrh1或h1)：其始于位置26并且終止于位置36之前。這基本上是由kabat和chotia分別定義的cdrh1的融合物(關(guān)于示例說(shuō)明，也參見(jiàn)圖1)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體構(gòu)架”，是指可變結(jié)構(gòu)域vl或vh的一部分，其用作該可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)(cdr)的支架。從本質(zhì)上講，其是不具有cdr的可變結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的部位(例如，tnf分子上的特定部位)。表位通常以獨(dú)特的空間構(gòu)象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個(gè)連續(xù)或非連續(xù)的氨基酸。參見(jiàn)，例如，epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”、“選擇性結(jié)合”、“選擇性地結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”是指抗體對(duì)預(yù)先確定的抗原上的表位的結(jié)合。通常，抗體以大約小于10-7m，例如大約小于10-8m、10-9m或10-10m或更小的親和力(kd)結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"kd"或“kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。通常，本發(fā)明的抗體以小于大約10-7m，例如小于大約10-8m、10-9m或10-10m或更小的解離平衡常數(shù)(kd)結(jié)合tnf，例如，如使用表面等離子體共振(spr)技術(shù)在biacore儀中測(cè)定的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子”是指dna分子和rna分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈dna。當(dāng)將核酸與另一個(gè)核酸序列置于功能關(guān)系中時(shí)，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動(dòng)子或增強(qiáng)子有效地連接至所述編碼序列。術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠運(yùn)輸已與其連接的另一個(gè)核酸的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是“質(zhì)?！?，其是指可將另外的dna區(qū)段連接至其中的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的dna區(qū)段連接至病毒基因組中。本文中公開(kāi)的載體能夠在已引入它們的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)或可在引入宿主細(xì)胞后整合入宿主細(xì)胞的基因組，從而隨宿主基因組一起復(fù)制(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指已向其中引入了表達(dá)載體的細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌(escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)；釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(pichiapastoris)、cho(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系)和ns0細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"兔類動(dòng)物"是指分類學(xué)兔形目(lagomorpha)的成員，包括兔科(leporidae)(例如野兔和兔)和鼠兔科(ochotonidae)(鼠兔)。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，兔類動(dòng)物是兔。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“兔”是指屬于兔科的動(dòng)物。如本文中所使用的，“同一性”是指兩個(gè)多肽、分子之間或兩個(gè)核酸之間匹配的序列。當(dāng)兩個(gè)進(jìn)行比較的序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)(例如，如果兩個(gè)多肽的每一個(gè)中的位置都被賴氨酸占據(jù))時(shí)，各個(gè)分子在該位置上是同一的。兩個(gè)序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是，在考慮為了進(jìn)行兩個(gè)序列的最佳比對(duì)而必需引入的缺口的數(shù)目和各缺口的長(zhǎng)度的情況下，由這兩個(gè)序列共有的同一的位置的數(shù)目的函數(shù)。通常，在將兩個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)以產(chǎn)生最大同一性時(shí)進(jìn)行比較。這樣的比對(duì)可通過(guò)使用，例如，已整合入gcg軟件包中的gap程序的needleman和wunsch(j.mol.biol.48：444-453(1970))算法的方法，利用blossum62矩陣或pam250矩陣以及16，14，12，10，8，6或4的缺口權(quán)重和1，2，3，4，5或6的長(zhǎng)度權(quán)重來(lái)提供。除非另外指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，但下面描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。在矛盾的情況下，以本說(shuō)明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例只是舉例說(shuō)明性的而非限定性的。在下列部分更詳細(xì)地描述本發(fā)明的多個(gè)方面。應(yīng)理解，可隨意組合不同實(shí)施方案、參數(shù)和范圍。此外，取決于具體的實(shí)施方案，可不使用選擇的定義、實(shí)施方案或范圍。如果沒(méi)有另外指出，那么按照aho編號(hào)方案標(biāo)示氨基酸位置。aho編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)一步描述于honegger，a.和pluckthun，a.(2001)jmol.biol.309:657-670)中。可選擇地，可使用如在kabat等人(kabat，e.a.,等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nihpublicationno.91-3242)中進(jìn)一步描述的kabat編號(hào)系統(tǒng)。用于確定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中氨基酸殘基位置的兩個(gè)不同編號(hào)系統(tǒng)的換算表提供于a.honegger，j.mol.biol.309(2001)657-670中。在第一方面，本發(fā)明提供了用于從其他動(dòng)物物種例如兔移植cdr的通用受體構(gòu)架。之前已描述，包含在所謂的“質(zhì)量控制”篩選(wo0148017)中鑒定的人構(gòu)架的抗體或抗體衍生物的特征在于普遍較高的穩(wěn)定性和/或溶解性。雖然人單鏈構(gòu)架fw1.4(seqidno:1(在wo03/097697中稱為a43)和seqidno:2(在wo03/097697中稱為ki27)的組合)在質(zhì)量控制測(cè)定中明顯表現(xiàn)不佳，但令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，其具有固有的高熱力學(xué)穩(wěn)定性并且可良好地產(chǎn)生(即便與多種不同cdr的組合)。該分子的穩(wěn)定性主要?dú)w因于其構(gòu)架區(qū)。還已顯示fw1.4本質(zhì)上可與兔抗體的抗原結(jié)合部位高度相容。因此，fw1.4代表了用于構(gòu)建從兔環(huán)的移植衍生的穩(wěn)定的人源化scfv抗體片段的適當(dāng)支架。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架，其包含與seqidno.1具有至少90％的同一性的vh序列和/或與seqidno.2具有至少85％的同一性的vl序列，更優(yōu)選包含用于兔cdr的移植的fw1.4的序列(seqidno:3)，或與seqidno:3具有至少60％，更優(yōu)選至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％的同一性的序列。此外，已發(fā)現(xiàn)可通過(guò)置換fw1.4的重鏈中的幾個(gè)殘基位置和/或通過(guò)置換fw1.4的輕鏈中的一個(gè)位置來(lái)優(yōu)化fw1.4。從而，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，vh中許多種兔cdr的環(huán)構(gòu)象可得到完全保持，且很大程度上不依賴于供體構(gòu)架的序列。fw1.4的重鏈中的所述殘基以及輕鏈的所述一個(gè)位置中的所述殘基在兔抗體中是保守的。從兔庫(kù)集推導(dǎo)出重鏈中的位置以及輕鏈中的所述一個(gè)位置處的共有殘基并且將其引入人受體構(gòu)架的序列。因此，改進(jìn)的構(gòu)架1.4(在下文中稱為rfw1.4)與幾乎任何兔cdr相容。此外，包含不同兔cdr的rfw1.4與兔野生型單鏈相反，可良好地表達(dá)和良好地產(chǎn)生，并且仍然幾乎完全保持原始供體兔抗體的親和力。因此，本發(fā)明提供了seqidno.1的可變重鏈構(gòu)架，其還包含通常支持來(lái)源于兔免疫結(jié)合劑的cdr的構(gòu)象的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。特別地，所述殘基存在于選自24h，25h，56h，82h，84h，89h和108h(aho編號(hào))的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上。已證明這些位置影響cdr的構(gòu)象，從而預(yù)期用于突變以容納供體cdr。優(yōu)選，所述一個(gè)或多個(gè)殘基選自：位置24處的蘇氨酸(t)、位置25處的纈氨酸(v)、位置56處的甘氨酸或丙氨酸(g或a)、位置82處的賴氨酸(k)、位置84處的蘇氨酸(t)、位置89處的纈氨酸(v)和位置108處的精氨酸(r)(aho編號(hào))。優(yōu)選，存在至少3個(gè)，更優(yōu)選4、5、6和最優(yōu)選所有7個(gè)殘基。令人驚訝地，已發(fā)現(xiàn)所述殘基的存在改善了免疫結(jié)合劑的穩(wěn)定性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架，其包含與seqidno.4具有至少50％，更優(yōu)選至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％和更優(yōu)選100％的同一性的vh，前提是存在由位置24處的蘇氨酸(t)、位置25處的纈氨酸(v)、位置56處的丙氨酸(a)或甘氨酸(g)、位置84處的蘇氨酸(t)、位置82處的賴氨酸(k)、位置89處的纈氨酸(v)和位置108處的精氨酸(r)(aho編號(hào))組成的組中的至少1個(gè)，更優(yōu)選至少3個(gè)，更優(yōu)選至少4、5、6和最優(yōu)選7個(gè)殘基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架是兔cdr的免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述可變重鏈構(gòu)架是或包含seqidno.4或seqidno.6?？蓪蓚€(gè)所述可變重鏈構(gòu)架例如與任何適當(dāng)?shù)妮p鏈構(gòu)架組合。因此，本發(fā)明提供了免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架，其包含：(i)與seqidno.4具有至少70％的同一性，優(yōu)選至少75％，80％，85％，90％，更優(yōu)選至少95％的同一性的可變重鏈構(gòu)架；和/或(ii)與seqidno.2具有至少70％的同一性，優(yōu)選至少75％，80％，85％，90％，更優(yōu)選至少95％的同一性的可變輕鏈構(gòu)架。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，可變重鏈構(gòu)架包含位置24處的蘇氨酸(t)、位置56處的甘氨酸(g)、位置84處的蘇氨酸(t)、位置89處的纈氨酸(v)和位置108處的精氨酸(r)(aho編號(hào))。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可變輕鏈包含位置87處的蘇氨酸(t)(aho編號(hào))。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架包含(i)選自seqidno.1，seqidno.4和seqidno.6的可變重鏈構(gòu)架；和/或(ii)seqidno.2或seqidno.9的可變輕鏈構(gòu)架。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)接頭將可變重鏈構(gòu)架連接至可變輕鏈構(gòu)架。接頭可以是任何適當(dāng)?shù)慕宇^，例如包含1至4個(gè)重復(fù)的序列g(shù)gggs的接頭，優(yōu)選(ggggs)4肽(seqidno.8)，或alfthan等人(1995)proteineng.8:725-731中公開(kāi)的接頭。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架是與seqidno.5具有至少70％，75％，80％，85％，90％，更優(yōu)選至少95％的同一性的序列，然而所述序列優(yōu)選不是seqidno.3。更優(yōu)選，免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架包含或是seqidno.5。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架是與seqidno.7具有至少70％，75％，80％，85％，90％，更優(yōu)選至少95％的同一性的序列，然而所述序列優(yōu)選不是seqidno.3。更優(yōu)選，免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架包含或是seqidno.7。此外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，上述氨基酸基序的存在使得構(gòu)架，優(yōu)選人構(gòu)架特別適合于容納來(lái)自其他非人動(dòng)物物種的cdr特別是兔cdr。所述基序?qū)γ庖呓Y(jié)合劑的穩(wěn)定性不具有負(fù)面影響。cdr以與其在兔免疫結(jié)合劑中的天然空間定位相似的構(gòu)象存在；從而，不必將結(jié)構(gòu)相關(guān)位置移植至受體構(gòu)架上。因此，人或人源化的免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架包含由位置24處的蘇氨酸(t)、位置25處的纈氨酸(v)、位置56處的丙氨酸(a)或甘氨酸(g)、位置82處的賴氨酸(k)、位置84處的蘇氨酸(t)、位置89處的纈氨酸(v)和位置108處的精氨酸(r)(aho編號(hào))組成的組中的至少3個(gè)氨基酸、優(yōu)選4、5、6和更優(yōu)選7個(gè)氨基酸。本文中所述的免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架可在重鏈構(gòu)架，優(yōu)選在位置12、103和144(aho編號(hào))處包含增強(qiáng)溶解性的置換。優(yōu)選，可用更親水的氨基酸置換疏水性氨基酸。親水性氨基酸是例如精氨酸(r)，天冬酰胺(n)，天冬氨酸(d)，谷氨酰胺(q)，甘氨酸(g)，組氨酸(h)，賴氨酸(k)，絲氨酸(s)和蘇氨酸(t)。更優(yōu)選，重鏈構(gòu)架包含(a)位置12處的絲氨酸(s)、(b)位置103處的絲氨酸(s)或蘇氨酸(t)和/或(c)位置144處的絲氨酸(s)或蘇氨酸(t)。此外，增強(qiáng)穩(wěn)定性的氨基酸可存在于可變輕鏈構(gòu)架的位置1，3，4，10，47，57，91和103(aho編號(hào))中的一個(gè)或多個(gè)位置上。更優(yōu)選，可變輕鏈構(gòu)架包含位置1處的谷氨酸(e)、位置3處的纈氨酸(v)、位置4處的亮氨酸(l)、位置10處的絲氨酸(s)、位置47處的精氨酸(r)、位置57處的絲氨酸(s)、位置91處的苯丙氨酸(f)和/或位置103處的纈氨酸(v)。由于谷氨酰胺(q)易于脫氨，因此在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，vh在位置141處包含甘氨酸(g)。該置換可改善蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期貯存。例如，本文中公開(kāi)的受體構(gòu)架可用于產(chǎn)生人或人源化抗體，所述抗體保持非人cdr所源自的非人抗體的結(jié)合性質(zhì)。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括本文中公開(kāi)的免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架，所述免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架還包括來(lái)自供體免疫結(jié)合劑，優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物免疫結(jié)合劑，更優(yōu)選來(lái)自兔類動(dòng)物免疫結(jié)合劑和最優(yōu)選來(lái)自兔免疫結(jié)合劑的重鏈cdr1，cdr2和cdr3和/或輕鏈cdr1，cdr2和cdr3。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異于期望的抗原的免疫結(jié)合劑，其包含：(i)兔類動(dòng)物的可變輕鏈cdr；和(ii)與seqidno.4具有至少50％，更優(yōu)選至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％和最優(yōu)選100％的同一性的人可變重鏈構(gòu)架。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，存在前提條件：由位置24處的蘇氨酸(t)、位置25處的纈氨酸(v)、位置56處的丙氨酸(a)或甘氨酸(g)、位置84處的蘇氨酸(t)、位置82處的賴氨酸(k)、位置89處的纈氨酸(v)和位置108處的精氨酸(r)(aho編號(hào))組成的組中的至少一個(gè)氨基酸存在于所述人可變重鏈構(gòu)架序列中。優(yōu)選，兔類動(dòng)物是兔。更優(yōu)選，免疫結(jié)合劑包含來(lái)自供體免疫結(jié)合劑的重鏈cdr1，cdr2和cdr3以及輕鏈cdr1，cdr2和cdr3。如本領(lǐng)域中已知的，許多兔vh鏈具有相對(duì)于鼠和人對(duì)應(yīng)物的額外配對(duì)的半胱氨酸。除了cys22與cys92之間形成的保守二硫橋外，在一些兔鏈中還存在cys21-cys79橋以及在cdrh1的最后一個(gè)殘基與cdrh2的第一個(gè)殘基之間形成的cdr間s-s橋。除此以外，半胱氨酸殘基對(duì)通常見(jiàn)于cdr-l3中。此外，許多兔抗體cdr不屬于任何之前已知的經(jīng)典結(jié)構(gòu)。特別地，cdr-l3通常比人或鼠對(duì)應(yīng)物的cdr-l3長(zhǎng)得多。如之前所述，非人cdr至本文中描述的構(gòu)架的移植產(chǎn)生了其中以恰當(dāng)?shù)臉?gòu)象展示cdr的分子。需要時(shí)，可通過(guò)移植非人供體免疫結(jié)合劑的抗原相互作用構(gòu)架殘基來(lái)提高免疫結(jié)合劑的親和力。此類位置可以例如通過(guò)下列方法來(lái)鑒定：(i)鑒定各自的種系祖先序列，或可選擇地，在高度同源的構(gòu)架序列的情況下通過(guò)使用共有序列；(ii)產(chǎn)生供體可變結(jié)構(gòu)域序列與步驟(i)的種系祖先序列或共有序列的序列比對(duì)；和(iii)鑒定相異的殘基。在許多情況下在體內(nèi)親和力產(chǎn)生過(guò)程中，分子表面上的相異殘基被突變，從而可能產(chǎn)生對(duì)抗原的親和力。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本文中所述的免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架的免疫結(jié)合劑。所述免疫結(jié)合劑可以是例如scfv抗體、全長(zhǎng)免疫球蛋白、fab片段、dab或納米抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將免疫結(jié)合劑連接至一個(gè)或多個(gè)分子，例如治療劑例如細(xì)胞毒性劑、趨化因子、生長(zhǎng)因子或其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，成像劑或第二蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄激活因子或dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文中公開(kāi)的免疫結(jié)合劑可以例如用于診斷應(yīng)用、治療應(yīng)用、靶標(biāo)確認(rèn)或基因治療。本發(fā)明還提供了編碼本文中公開(kāi)的免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架或本文中公開(kāi)的免疫結(jié)合劑的分離的核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含本文中公開(kāi)的核酸的載體?？衫鐚⒈疚闹泄_(kāi)的核酸或載體用于基因治療。本發(fā)明還包括包含本文中公開(kāi)的載體和/或核酸的宿主細(xì)胞。此外，提供了包含本文中公開(kāi)的免疫結(jié)合劑受體構(gòu)架、本文中公開(kāi)的免疫結(jié)合劑、本文中公開(kāi)的分離的核酸或本文中公開(kāi)的載體的組合物。本文中公開(kāi)的序列如下(x殘基是cdr插入位置)：seqidno.1：fw1.4的可變重鏈構(gòu)架(a43)evqlvesggglvqpggslrlscaas(x)n＝1-50wvrqapgkglewvs(x)n＝1-50rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycak(x)n＝1-50wgqgtlvtvssseqidno.2：fw1.4的可變輕鏈構(gòu)架(ki27)eivmtqspstlsasvgdrviitc(x)n＝1-50wyqqkpgkapklliy(x)n＝1-50gvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyyc(x)n＝1-50fgqgtkltvlgseqidno.3：fw1.4的構(gòu)架eivmtqspstlsasvgdrviitc(x)n＝1-50wyqqkpgkapklliy(x)n＝1-50gvpsrfsgsgsgaeftltisslqpddfatyyc(x)n＝1-50fgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlscaas(x)n＝1-50wvrqapgkglewvs(x)n＝1-50rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycak(x)n＝1-50wgqgtlvtvssseqidno.4：rfw1.4的可變重鏈構(gòu)架evqlvesggglvqpggslrlsctas(x)n＝1-50wvrqapgkglewvg(x)n＝1-50rftisrdtskntvylqmnslraedtavyycar(x)n＝1-50wgqgtlvtvssseqidno.5：rfw1.4的構(gòu)架eivmtqspstlsasvgdrviitc(x)n＝1-50wyqqkpgkapklliy(x)n＝1-50gvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyc(x)n＝1-50fgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctas(x)n＝1-50wvrqapgkglewvg(x)n＝1-50rftisrdtskntvylqmnslraedtavyycar(x)n＝1-50wgqgtlvtvssseqidno.6：rfw1.4(v2)的可變重鏈構(gòu)架evqlvesggglvqpggslrlsctvs(x)n＝1-50wvrqapgkglewvg(x)n＝1-50rftiskdtskntvylqmnslraedtavyycar(x)n＝1-50wgqgtlvtvssseqidno.7：rfw1.4(v2)的構(gòu)架eivmtqspstlsasvgdrviitc(x)n＝1-50wyqqkpgkapklliy(x)n＝1-50gvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyc(x)n＝1-50fgqgtkltvlgggggsggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlsctvs(x)n＝1-50wvrqapgkglewvg(x)n＝1-50rftiskdtskntvylqmnslraedtavyycar(x)n＝1-50wgqgtlvtvssseqidno.8：接頭ggggsggggsggggsggggsseqidno.9：fw1.4的經(jīng)置換的可變輕鏈構(gòu)架eivmtqspstlsasvgdrviitc(x)n＝1-50wyqqkpgkapklliy(x)n＝1-50gvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyc(x)n＝1-50fgqgtkltvlg在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)將非人供體抗體的cdr移植至穩(wěn)定和可溶的抗體構(gòu)架來(lái)人源化非人抗體的方法。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自兔抗體的cdr和所述構(gòu)架是上述cdr和構(gòu)架。用于將cdr移植入人受體構(gòu)架的一般方法已由winter在美國(guó)專利5,225,539中和由queen等人在wo9007861a1(其以其全文通過(guò)引用合并入本文)中公開(kāi)。用于將來(lái)自兔單克隆抗體的cdr移植入選擇的構(gòu)架的一般策略與winter等人和queen等人的策略相關(guān)，但在某些關(guān)鍵方面有分歧。特別地，本發(fā)明的方法與本領(lǐng)域內(nèi)已知的典型的winter和queen的方法相異在于，本文中公開(kāi)的人抗體構(gòu)架特別適合作為人或非人供體抗體的通用受體。因此，與winter和queen的一般方法不同，用于本發(fā)明的人源化方法的構(gòu)架序列不必是展示與供體cdr所源自的非人(例如，兔)抗體的序列的最大序列相似性的構(gòu)架序列。此外，不需要從供體序列移植構(gòu)架殘基來(lái)支持cdr構(gòu)象。至多，可引入位于構(gòu)架中的抗原結(jié)合氨基酸或在體細(xì)胞高突變期間產(chǎn)生的其他突變。下面描述產(chǎn)生具有高溶解性和穩(wěn)定性的人源化兔源抗體的移植方法的具體內(nèi)容。因此，本發(fā)明提供了人源化兔cdr供體免疫結(jié)合劑的方法，所述免疫結(jié)合劑包含重鏈cdr1，cdr2和cdr3序列和/或輕鏈cdr1，cdr2和cdr3序列。所述方法包括步驟：(i)將由cdr1、cdr2和cdr3序列組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)，更優(yōu)選3個(gè)cdr移植入重鏈上的人重鏈?zhǔn)荏w構(gòu)架，所述受體構(gòu)架與seqidno:1具有至少50％，優(yōu)選至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，更優(yōu)選至少95％的同一性；和/或(ii)將由cdr1、cdr2和cdr3序列組成的組中的至少1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)，更優(yōu)選3個(gè)cdr移植入輕鏈上的人輕鏈?zhǔn)荏w構(gòu)架，所述人輕鏈構(gòu)架與seqidno:2具有至少50％，優(yōu)選至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，更優(yōu)選至少95％的同一性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可變鏈?zhǔn)荏w構(gòu)架包含：(i)包含選自seqidno:1，seqidno:4和seqidno:6的構(gòu)架氨基酸序列的人重鏈構(gòu)架和(ii)包含seqidno:2或seqidno:9的構(gòu)架氨基酸序列的人輕鏈構(gòu)架。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括步驟：(i)將重鏈cdr1、cdr2和cdr3序列移植入免疫結(jié)合劑重鏈和(ii)將輕鏈cdr1、cdr2和cdr3序列移植入免疫結(jié)合劑輕鏈，所述免疫結(jié)合劑與seqidno.3、seqidno.5或seqidno.7具有至少75％，80％，85％，90％，更優(yōu)選至少95％的同一性。更優(yōu)選，免疫結(jié)合劑是或包含seqidno.3、seqidno.5或seqidno.7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為了改善抗原結(jié)合，所述方法還可包括用參與抗原結(jié)合的供體殘基置換受體構(gòu)架殘基的步驟。在本發(fā)明的方法的示例性實(shí)施方案中，首先鑒定cdr供體抗體的氨基酸序列，然后使用常規(guī)序列比對(duì)工具(例如，needleman-wunsch算法和blossum矩陣)比對(duì)序列?？墒褂贸Ｒ?guī)抗體編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行缺口的引入和殘基位置的命名。例如，可使用用于免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的aho編號(hào)系統(tǒng)。還可使用kabat編號(hào)系統(tǒng)，因?yàn)槠涫怯糜诰幪?hào)抗體中的殘基的最廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)?？衫缡褂胹ubim程序分配kabat編號(hào)。該程序分析抗體序列的可變區(qū)且按照由kabat和同事(deret等人1995)建立的系統(tǒng)給序列編號(hào)。通常按照基于序列的變異性的最常用的kabat定義來(lái)進(jìn)行構(gòu)架和cdr區(qū)的界定。然而，對(duì)于cdr-h1，命名優(yōu)選是kabat定義，通過(guò)分析一組3d復(fù)合物結(jié)構(gòu)的抗體與抗原之間的接觸而產(chǎn)生的平均接觸數(shù)據(jù)(maccallum等人，1996)和基于結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域的位置的chotia's定義的組合(也參見(jiàn)圖1)。用于確定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中的氨基酸殘基位置的兩個(gè)不同編號(hào)系統(tǒng)的換算表提供于a.honegger，j.mol.biol.309(2001)657-670中。kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)一步描述于kabat等人(kabat，e.a.，等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nihpublicationno.91-3242)中。aho編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)一步描述于honegger，a.和pluckthun，a.(2001)jmol.biol.309:657-670)中?？墒褂美缧蛄蟹治鏊惴ê头诸惙椒ǖ膃xcel工具，基于人抗體庫(kù)的分析(knappik等人，2000，jmolbiol.feb11；296(l):57-86)將兔單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域例如分類至相應(yīng)的人亞組?？蓪dr構(gòu)象分配至供體抗原結(jié)合區(qū)，然后還可鑒定維持不同經(jīng)典結(jié)構(gòu)所需的殘基位置。使用chothia's(1989)定義確定兔抗體的6個(gè)抗體高變區(qū)中的5個(gè)(l1、l2、l3、h1和h2)的cdr經(jīng)典結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，按照下列方法產(chǎn)生、鑒定和分離cdr：將b細(xì)胞，優(yōu)選兔b細(xì)胞(i)與靶抗原(優(yōu)選純化的)或(ii)與在其表面上表達(dá)靶抗原的細(xì)胞一起溫育。在(ii)的情況下，表達(dá)靶抗原的所述細(xì)胞可以例如是天然表達(dá)選擇的靶或經(jīng)轉(zhuǎn)化在它們的表面上表達(dá)靶蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選cho或hek293細(xì)胞，酵母細(xì)胞，優(yōu)選酵母球芽(spheroblast)或細(xì)菌細(xì)胞。當(dāng)表達(dá)時(shí)，靶抗原可以以整合入或連接至細(xì)胞膜的形式在細(xì)胞表面上表達(dá)。可以例如以分離的株系在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)細(xì)胞，或可從其天然環(huán)境例如組織、器官或生物體分離所述細(xì)胞。靶抗原在細(xì)胞的表面上表達(dá)，即情況(ii)，對(duì)于跨膜蛋白是特別優(yōu)選的，對(duì)于多次跨膜蛋白例如gpcr(g蛋白偶聯(lián)受體)或離子通道或其天然構(gòu)象在重組表達(dá)和純化后難以維持的任何其他蛋白是更優(yōu)選的。使用重組蛋白的常規(guī)免疫在這些情況下由于在純化過(guò)程中丟失完整膜蛋白/復(fù)合物的天然構(gòu)象或由于純蛋白的量不足而不適宜或不可能。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用dna而非重組蛋白，例如通過(guò)wo/2004/087216中公開(kāi)的dna接種方案免疫哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選兔。dna接種誘導(dǎo)快速的抗天然抗原的免疫應(yīng)答。因?yàn)椴恍枰亟M蛋白，因此該技術(shù)一方面非常節(jié)約成本，另一方面，更重要地，該方法允許完整膜復(fù)合物和/或多次跨膜的膜蛋白的天然表達(dá)?？蓮乃鲆衙庖叩膭?dòng)物，優(yōu)選所述兔分離b細(xì)胞，或可選擇地b細(xì)胞是稚b細(xì)胞(naiveb-cell)。在所述方法的隨后步驟中，從已免疫的動(dòng)物(優(yōu)選已免疫的兔)的淋巴器官(例如脾或淋巴結(jié))分離b細(xì)胞，優(yōu)選記憶b細(xì)胞。將b細(xì)胞與在其表面上表達(dá)抗原的細(xì)胞或與熒光標(biāo)記的可溶性抗原混合溫育。分離在其表面上表達(dá)靶特異性抗體并且因此結(jié)合靶抗原或在細(xì)胞表面上表達(dá)的靶抗原的b細(xì)胞。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)b細(xì)胞和/或靶細(xì)胞進(jìn)行染色以允許通過(guò)基于流式細(xì)胞術(shù)的分選術(shù)分離b細(xì)胞/靶細(xì)胞或b細(xì)胞/抗原復(fù)合物。流式細(xì)胞術(shù)通常測(cè)量由單個(gè)細(xì)胞(當(dāng)其穿過(guò)激光束時(shí))發(fā)射的熒光。然而，一些研究者已使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)研究細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，例如，由鈣粘蛋白(panorchan等人，2006，j.cellscience，119，66-74；leongethibma，2005，j.immunol.methods，302，116-124)或整聯(lián)蛋白(gawaz等人，1991，j.clin.invest，88，1128-1134)介導(dǎo)的粘著。因此，在(ii)的情況下，用胞內(nèi)熒光染料(例如鈣黃綠素)染色表達(dá)選擇的靶的細(xì)胞。用結(jié)合細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物的熒光抗體染色b細(xì)胞。因此，可選擇包含通過(guò)b細(xì)胞受體-靶相互作用彼此粘著的兩個(gè)細(xì)胞的雙色“事件”(參見(jiàn)圖2)。由于igg通常具有比igm更高的親和力，因此優(yōu)選選擇在其表面上表達(dá)igg而非igm(這是記憶b細(xì)胞的特征)的陽(yáng)性b細(xì)胞。為了所述目的，優(yōu)選使用多色染色，其中例如分別用apc和fitc差異標(biāo)記特異于igg和igm的抗體。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，b細(xì)胞分選的讀出還可選擇該相互作用功能性阻斷/激活受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。例如，可將b細(xì)胞與功能性表達(dá)gpcr(g蛋白偶聯(lián)受體)的細(xì)胞一起溫育。可向混合物中加入通過(guò)gpcr發(fā)出信號(hào)的激動(dòng)劑以誘導(dǎo)gpcr介導(dǎo)的ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流出。如果存在于b細(xì)胞上的抗體功能性阻斷激動(dòng)劑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，那么ca2+流出也將被該細(xì)胞間相互作用阻斷?？墒褂昧魇郊?xì)胞術(shù)定量測(cè)量ca2+流出。因此，只有顯示ca2+流出的增加或減少的b細(xì)胞/靶細(xì)胞聚集物可被分選。在選擇步驟之后，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)b細(xì)胞以使抗體能夠分泌入培養(yǎng)基。產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。培養(yǎng)可包括使用輔助細(xì)胞系例如胸腺瘤輔助細(xì)胞系(例如el4-b5，參見(jiàn)zubler等人，1985，j.immunol.，134(6):3662-3668)。優(yōu)選，進(jìn)行驗(yàn)證步驟以就對(duì)靶的特異性結(jié)合測(cè)試產(chǎn)生的抗體，例如以排除抗除靶蛋白外的在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)的抗體。例如，其中使用完整細(xì)胞進(jìn)行包被步驟的celisa(即改進(jìn)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa))適合用于所述目的。所述方法允許估量抗體與配體競(jìng)爭(zhēng)的能力和選擇性。然后分析上述步驟中產(chǎn)生的抗體以鑒定所述抗體的cdr。這可包括步驟例如純化抗體、闡明其氨基酸序列和/或核酸序列。最后，可以例如通過(guò)使用寡核苷酸延伸法的基因合成將cdr移植入受體構(gòu)架，優(yōu)選上述受體構(gòu)架。在一個(gè)實(shí)施方案中，本領(lǐng)域公認(rèn)的cdr移植方法可用于將供體cdr移植入受體構(gòu)架。在大多數(shù)情況下，將來(lái)自重鏈的所有3個(gè)cdr從供體抗體移植至單個(gè)受體構(gòu)架和將來(lái)自輕鏈的所有3個(gè)cdr移植至不同受體構(gòu)架。預(yù)期不應(yīng)當(dāng)總是必需移植所有cdr，因?yàn)橐恍ヽdr可能不參與對(duì)抗原的結(jié)合，并且具有不同序列(和相同長(zhǎng)度)的cdr可具有相同的折疊(從而盡管序列不同，抗原接觸至主鏈接觸可得到保持)。事實(shí)上單個(gè)結(jié)構(gòu)域(ward等人，1989，nature341，pp.544-546)或甚至單個(gè)cdr(r.taub等人，1989，j.biolchem264，pp.259-265)單獨(dú)可具有抗原結(jié)合活性。然而，無(wú)論是移植所有cdr還是只移植一些cdr，cdr移植的意圖是將相同或更確切地相同的抗原結(jié)合部位從動(dòng)物移植至人抗體(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5,225,539(winter))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在它們整合入受體構(gòu)架之前或之后改變供體抗體的cdr。可選擇地，只在其終免疫結(jié)合劑形式中進(jìn)行抗體的表征。為了進(jìn)行該方法，可通過(guò)rt-pcr從培養(yǎng)的分選的b細(xì)胞或直接從單個(gè)分選的b細(xì)胞得到在分選的b細(xì)胞上表達(dá)的抗體的cdr序列。為了所述目的，b細(xì)胞的增殖和/或上述驗(yàn)證步驟和/或上述分析步驟可能不是必須的。其中一個(gè)寡核苷酸庫(kù)編碼cdr并且第二庫(kù)編碼適當(dāng)?shù)拿庖呓Y(jié)合劑支架的構(gòu)架區(qū)的部分重疊的寡核苷酸的兩個(gè)庫(kù)的組合允許在一步pcr中產(chǎn)生人源化免疫結(jié)合劑。高通量測(cè)序、克隆和生產(chǎn)允許基于純化的人源化免疫結(jié)合劑的性能進(jìn)行克隆選擇，而不表征細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌的igg。因此在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫結(jié)合劑是scfv。然而，cdr的移植可由于與抗原接觸的構(gòu)架殘基而導(dǎo)致產(chǎn)生的免疫結(jié)合劑對(duì)抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細(xì)胞高度突變的結(jié)果。因此，可能仍然需要將此類供體構(gòu)架氨基酸移植至人源化抗體的構(gòu)架。來(lái)自非人免疫結(jié)合劑的參與抗原結(jié)合的氨基酸殘基可通過(guò)檢查兔單克隆抗體可變區(qū)序列和結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定。cdr供體構(gòu)架中與種系不同的的各殘基可被認(rèn)為是相關(guān)的。如果不能確定最接近的種系，那么可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分?jǐn)?shù)的兔序列的共有序列相比較。稀有構(gòu)架殘基被認(rèn)為可能是體細(xì)胞高度突變的結(jié)果，從而在結(jié)合中起著重要作用。還可進(jìn)一步優(yōu)化本發(fā)明的抗體以顯示增強(qiáng)的功能性質(zhì)例如增強(qiáng)的溶解性和/或穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方案中，按照2008年3月12日提交的pct申請(qǐng)系列號(hào)pct/ep2008/001958(名稱為"sequencebasedengineeringandoptimizationofsinglechainantibodies"，其通過(guò)引用合并入本文)中公開(kāi)的“功能共有序列”方法優(yōu)化本發(fā)明的抗體。例如，可將本發(fā)明的免疫結(jié)合劑與功能性選擇的scfv的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較以鑒定比免疫結(jié)合劑中的相應(yīng)位置更耐受變異性或更不耐受變異性的氨基酸殘基位置，從而表明此類鑒定的殘基位置可適合用于改造以改善功能性例如穩(wěn)定性和/或溶解性。用于置換的示例性構(gòu)架殘基位置和示例性構(gòu)架置換描述于2008年6月25日提交的pct申請(qǐng)pct/ch2008/000285(名稱為"methodsofmodifyingantibodies，andmodifiedantibodieswithimprovedfunctionalproperties")和2008年6月25日提交的pct申請(qǐng)pct/ch2008/000284(名稱為"sequencebasedengineeringandoptimizationofsinglechainantibodies")中。例如，可在本發(fā)明的免疫結(jié)合劑的重鏈可變區(qū)中在氨基酸位置(對(duì)于下文列出的每一個(gè)氨基酸位置參照aho編號(hào))上引入一個(gè)或多個(gè)下列置換：(a)氨基酸位置1處的q或e；(b)氨基酸位置6處的q或e；(c)氨基酸位置7處的t、s或a，更優(yōu)選t或a，更優(yōu)選t；(d)氨基酸位置10處的a、t、p、v或d，更優(yōu)選t、p、v或d，(e)氨基酸位置12處的l或v，更優(yōu)選l，(f)氨基酸位置13處的v、r、q、m或k，更優(yōu)選v、r、q或m，(g)氨基酸位置14處的r，m，e，q或k，更優(yōu)選r，m，e或q，更優(yōu)選r或e；(h)氨基酸位置19處的l或v，更優(yōu)選l；(i)氨基酸位置20處的r，t，k或n，更優(yōu)選r，t或n，更優(yōu)選n；(j)氨基酸位置21處的i，f，l或v，更優(yōu)選i，f或l，更優(yōu)選i或l；(k)氨基酸位置45處的r或k，更優(yōu)選k；(l)氨基酸位置47處的t，p，v，a或r，更優(yōu)選t，p、v或r，更優(yōu)選r；(m)氨基酸位置50處的k，q、h或e，更優(yōu)選k、h或e，更優(yōu)選k；(n)氨基酸位置55處的m或i，更優(yōu)選i；(o)氨基酸位置77處的k或r，更優(yōu)選k；(p)氨基酸位置78處的a、v、l或i，更優(yōu)選a、l或i，更優(yōu)選a；(q)氨基酸位置82處的e，r，t或a，更優(yōu)選e，t或a，更優(yōu)選e；(r)氨基酸位置86處的t，s，i或l，更優(yōu)選t，s或l，更優(yōu)選t；(s)氨基酸位置87處的d，s，n或g，更優(yōu)選d，n或g，更優(yōu)選n；(t)氨基酸位置89處的a，v，l或f，更優(yōu)選a，v或f，更優(yōu)選v；(u)氨基酸位置90處的f，s，h，d或y，更優(yōu)選f，s，h或d；(v)氨基酸位置92處的d，q或e，更優(yōu)選d或q，更優(yōu)選d；(w)氨基酸位置95處的g，n，t或s，更優(yōu)選g，n或t，更優(yōu)選g；(x)氨基酸位置98處的t，a，p，f或s，更優(yōu)選t，a，p或f，更優(yōu)選f；(y)氨基酸位置103處的r，q，v，i、m，f或l，更優(yōu)選r，q，i，m，f或l，更優(yōu)選y，更優(yōu)選l；和(z)氨基酸位置107處的n，s或a，更優(yōu)選n或s，更優(yōu)選n。另外地或可選擇地，可將一個(gè)或多個(gè)下列置換引入本發(fā)明的免疫結(jié)合劑的輕鏈可變區(qū)：(aa)氨基酸位置1處的q，d，l，e，s或i，更優(yōu)選l，e，s或i，更優(yōu)選l或e；(bb)氨基酸位置2處的s，a，y，i，p或t，更優(yōu)選a，y，i，p或t，更優(yōu)選p或t；(cc)氨基酸位置3處的q，v，t或i，更優(yōu)選v，t或i，更優(yōu)選v或t；(dd)氨基酸位置4處的v，l，i或m，更優(yōu)選v或l；(ee)氨基酸位置7處的s，e或p，更優(yōu)選s或e，更優(yōu)選s；(ff)氨基酸位置10處的t或i，更優(yōu)選i；(gg)氨基酸位置11處的a或v，更優(yōu)選a；(hh)氨基酸位置12處的s或y，更優(yōu)選y；(ii)氨基酸位置14處的t，s或a，更優(yōu)選t或s，更優(yōu)選t；(jj)氨基酸位置18處的s或r，更優(yōu)選s；(kk)氨基酸位置20處的t或r，更優(yōu)選r；(ll)氨基酸位置24處的r或q，更優(yōu)選q；(mm)氨基酸位置46處的h或q，更優(yōu)選h；(nn)氨基酸位置47處的k，r或i，更優(yōu)選r或i，更優(yōu)選r；(oo)氨基酸位置50處的r，q，k，e，t或m，更優(yōu)選q，k，e，t或m；(pp)氨基酸位置53處的k，t，s，n，q或p，更優(yōu)選t，s，n，q或p；(qq)氨基酸位置56處的i或m，更優(yōu)選m；(rr)氨基酸位置57處的h，s，f或y，更優(yōu)選h，s或f；(ss)氨基酸位置74處的i，v或t，更優(yōu)選v或t，r，更優(yōu)選t；(tt)氨基酸位置82處的r，q或k，更優(yōu)選r或q，更優(yōu)選r；(uu)氨基酸位置91處的l或f，更優(yōu)選f；(vv)氨基酸位置92處的g，d，t或a，更優(yōu)選g，d或t，更優(yōu)選t；(xx)氨基酸位置94處的s或n，更優(yōu)選n；(yy)氨基酸位置101處的f，y或s，更優(yōu)選y或s，更優(yōu)選s；和(zz)氨基酸位置103處的d，f，h，e，l，a，t，v、s，g或i，更優(yōu)選h，e，l，a，t，v，s，g或i，更優(yōu)選a或v。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫結(jié)合劑包含一個(gè)或多個(gè)2008年6月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/075,692(名稱為“solubilityoptimizationofimmunobinders”)中描述的穩(wěn)定性增強(qiáng)突變。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫結(jié)合劑在選自由12、103和144(aho編號(hào)約定)組成的重鏈氨基酸位置的氨基酸位置處包含溶解性增強(qiáng)突變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫結(jié)合劑包含一個(gè)或多個(gè)選自下列的置換：(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(s)；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸(s)或蘇氨酸(t)；和(c)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸(s)或蘇氨酸(t)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫結(jié)合劑包含下列置換：(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(s)；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸(s)或蘇氨酸(t)；和(c)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸(s)或蘇氨酸(t)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫結(jié)合劑在根據(jù)aho編號(hào)系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)的位置1，3，4，10，47，57，91和103中的至少一個(gè)位置處的輕鏈?zhǔn)荏w構(gòu)架的構(gòu)架殘基上包含穩(wěn)定性增強(qiáng)突變。在優(yōu)選實(shí)施方案中，輕鏈?zhǔn)荏w構(gòu)架包含一個(gè)或多個(gè)置換，所述置換選自：(a)位置1處的谷氨酸(e)、(b)位置3處的纈氨酸(v)、(c)位置4處的亮氨酸(l)、(d)位置10處的絲氨酸(s)、(e)位置47處的精氨酸(r)、(e)位置57處的絲氨酸(s)、(f)位置91處的苯丙氨酸(f)和(g)位置103處的纈氨酸(v)。可使用許多可獲得的方法中的任何方法產(chǎn)生包含上述突變的人源化抗體。因此，本發(fā)明的提供了按照本文中描述的方法人源化的免疫結(jié)合劑。在某些優(yōu)實(shí)施方案中，所述免疫結(jié)合劑的靶抗原是vegf或tnfα。本發(fā)明中描述的或通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽可以例如使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)合成?？蛇x擇地，可通過(guò)重組方法來(lái)合成編碼期望的可變區(qū)的核酸分子和產(chǎn)生多肽。例如，一旦已確定人源化的可變區(qū)的序列，可通過(guò)分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)制備包含其的可變區(qū)或多肽。更具體地，可使用重組dna技術(shù)，通過(guò)用核酸序列(例如，編碼期望的可變區(qū)(例如，改進(jìn)的重鏈或輕鏈；其可變結(jié)構(gòu)域或其的其他抗原結(jié)合片段)的dna序列)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生多種多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，可制備包含與編碼至少vh或vl的dna序列有效連接的啟動(dòng)子的表達(dá)載體。必要時(shí)或需要時(shí)，可制備第二表達(dá)載體，所述載體包含與編碼互補(bǔ)可變結(jié)構(gòu)域的dna序列有效連接的啟動(dòng)子(即，其中親本表達(dá)載體編碼vh，第二表達(dá)載體編碼vl，反之亦然)。然后可用一個(gè)或兩個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞系(例如，永生化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系)，并在允許嵌合可變結(jié)構(gòu)域或嵌合抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，neuberger等人的國(guó)際專利申請(qǐng)pct/gb85/00392)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可制備包含供體cdr和受體fr氨基酸序列的可變區(qū)，然后可將變化引入核酸分子以進(jìn)行cdr氨基酸置換。用于制備編碼多肽的的氨基酸序列變體的核酸分子的示例性本領(lǐng)域公認(rèn)的方法包括但不限于，通過(guò)早期制備的編碼多肽的dna的定點(diǎn)(或寡核苷酸介導(dǎo)的)誘變、pcr誘變和盒式誘變進(jìn)行的制備。定點(diǎn)誘變是用于制備置換變體的優(yōu)選方法。該技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見(jiàn)，例如，carter等人nucleicacidsres.13:4431-4443(1985)和kunkel等人，proc.natl.acad.sci.usa82:488(1987))。簡(jiǎn)而言之，在進(jìn)行dna的定點(diǎn)誘變時(shí)，通過(guò)首先將編碼期望的突變的寡核苷酸與這樣的親本dna的單鏈雜交來(lái)改變親本dna。雜交后，使用雜交的寡核苷酸作為引物并且使用親本dna的單鏈作為模板，將dna聚合酶用于合成完整第二鏈。從而，將編碼期望的突變的寡核苷酸整合入所得的雙鏈dna。pcr誘變也適合用于制備多肽的氨基酸序列變體。參見(jiàn)higuchi，inpcrprotocols，pp.177-183(academicpress，1990)；和vallette等人，nuc.acidsres.17:723-733(1989)。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)將少量模板dna在pcr中用作起始材料時(shí)，可將在序列上與模板dna中的相應(yīng)區(qū)域略微不同的引物用于產(chǎn)生相對(duì)大量的特定dna片段，所述dna片段只在其中引物與模板不同的位置處與模板序列不同。用于制備變體的另一個(gè)方法盒式誘變基于由wells等人，gene34:315-323(1985)描述的技術(shù)。起始材料是包含待突變的dna的質(zhì)粒(或其他載體)。確定待突變的親本dna中的密碼子。在鑒定的突變位置的每一側(cè)都必須存在獨(dú)特的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。如果不存在這樣的限制性位點(diǎn)，那么可通過(guò)使用上述寡核苷酸介導(dǎo)的誘變法將其引入編碼多肽的dna中的適當(dāng)位置處來(lái)產(chǎn)生它們。在這些位置切割質(zhì)粒dna以使之線性化。使用標(biāo)準(zhǔn)方法合成編碼位于限制性位點(diǎn)之間但包含期望的突變的dna序列的雙鏈寡核苷酸，其中分開(kāi)合成寡核苷酸的兩條鏈，然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其雜交在一起。該雙鏈寡核苷酸稱為盒。該盒經(jīng)設(shè)計(jì)具有與線性化的質(zhì)粒的末端相容的5'和3'末端，以便其可直接連接至質(zhì)粒。該質(zhì)?，F(xiàn)包含突變的dna序列?？筛脑觳⑶疫M(jìn)一步改變通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的可變區(qū)以進(jìn)一步增加抗原結(jié)合。因此，可進(jìn)行上述步驟或然后進(jìn)行另外的步驟，包括親和力成熟。此外，可將經(jīng)驗(yàn)結(jié)合數(shù)據(jù)用于進(jìn)一步優(yōu)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可進(jìn)一步改造本發(fā)明的多肽以便其在氨基酸序列上但不在期望的活性上產(chǎn)生變化。例如，可對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行導(dǎo)致在“非必需”氨基酸殘基處的氨基酸置換的另外的核苷酸置換。例如，可用來(lái)自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基置換免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案，可用結(jié)構(gòu)相似的、在側(cè)鏈家族成員的組成和/或順序上不同的串(string)替代氨基酸的串，即可產(chǎn)生其中用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的保守置換。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族，包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。除了氨基酸置換以外，本發(fā)明還涉及其他修飾，例如對(duì)fc區(qū)氨基酸序列的修飾以產(chǎn)生具有改變的效應(yīng)子功能的fc區(qū)變體?？梢岳缛笔c區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基以削弱或增強(qiáng)對(duì)fcr的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案，可修飾一個(gè)或多個(gè)fc區(qū)殘基以產(chǎn)生這樣的fc區(qū)變體。通常，按照本發(fā)明的該實(shí)施方案，缺失不超過(guò)1至大約10個(gè)fc區(qū)殘基。本文中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失的fc區(qū)將優(yōu)選保持至少大約80％，優(yōu)選至少大約90％和最優(yōu)選至少大約95％的起始fc區(qū)或天然序列人fc區(qū)。還可制備氨基酸插入fc區(qū)變體，所述變體具有改變的效應(yīng)子功能。例如，可在與本文中鑒定為影響fcr結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)fc區(qū)位置相鄰的位置處引入至少一個(gè)氨基酸殘基(例如1至2個(gè)氨基酸殘基和通常不超過(guò)10個(gè)殘基)?！跋噜彙币庵冈诒疚闹需b定的fc區(qū)殘基的1至2個(gè)氨基酸殘基內(nèi)。此類fc區(qū)變體可展示增強(qiáng)的或減弱的fcrn結(jié)合。此類fc區(qū)域變體通常將在fc區(qū)域包含至少一個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，可組合氨基酸修飾。例如，變異的fc區(qū)可包括2、3、4、5個(gè)等本文中的置換，例如本文中鑒定的特定fc區(qū)位置的置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽可具有改變的對(duì)fcrn或?qū)α硪粋€(gè)fc受體的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中描述的或通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽例如人源化ig可變區(qū)和/或包含人源化ig可變區(qū)的多肽可通過(guò)重組方法產(chǎn)生。例如，可將編碼多肽的多核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中以進(jìn)行重組表達(dá)。在多肽是抗體的情況下，可將編碼另外的輕鏈和重鏈可變區(qū)(任選地連接至恒定區(qū))的多核苷酸插入相同或不同的表達(dá)載體。可任選地將親和標(biāo)簽序列(例如his(6)標(biāo)簽)連接至多肽序列或包含在所述序列中以幫助下游純化。將編碼免疫球蛋白鏈的dna區(qū)段有效地連接至表達(dá)載體的控制序列，所述控制序列確保免疫球蛋白多肽的表達(dá)。表達(dá)控制序列包括但不限于啟動(dòng)子(例如，天然結(jié)合的或異源啟動(dòng)子)、信號(hào)序列、增強(qiáng)子元件和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選，表達(dá)控制序列是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中的真核啟動(dòng)子系統(tǒng)。在已將載體整合入適當(dāng)?shù)乃拗骱?，在適合于高水平表達(dá)核苷酸序列的條件下維持宿主，然后收集和純化多肽。此類表達(dá)載體通?？稍谒拗魃镏袕?fù)制(作為附加體或作為宿主染色體dna的組成部分)。通常，表達(dá)載體包含選擇標(biāo)記(例如，氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗性或新霉素抗性)以允許檢測(cè)用期望的dna序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利4,704,362)。大腸桿菌(e.coli)是對(duì)于克隆本發(fā)明的多核苷酸(例如，dna序列)特別有用的一種原核宿主。適合使用的其他微生物宿主包括桿菌(bacilli)例如枯草芽孢桿菌和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)例如沙門氏菌(salmonella)、沙雷氏菌(serratia)和各種假單胞菌(pseudomonas)的種。其他微生物例如酵母也可用于表達(dá)。酵母屬(saccharomyces)和畢赤酵母屬(pichia)是示例性酵母宿主，且需要時(shí)，適當(dāng)?shù)妮d體具有表達(dá)控制序列(例如，啟動(dòng)子)、復(fù)制起點(diǎn)、終止序列等。常見(jiàn)啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導(dǎo)型酵母啟動(dòng)子包括，特別地，來(lái)自醇脫氫酶、異細(xì)胞色素c和負(fù)責(zé)甲醇、麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，大腸桿菌和釀酒酵母是優(yōu)選宿主。除了微生物外，哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)物還可用于表達(dá)和產(chǎn)生本發(fā)明的多肽(例如，編碼免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。參見(jiàn)winnacker，fromgenestoclones，vchpublishers，n.y.，n.y.(1987)。真核細(xì)胞實(shí)際上是優(yōu)選的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域內(nèi)已開(kāi)發(fā)了能夠分泌異源蛋白質(zhì)(例如，完整免疫球蛋白)的許多適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞系，包括cho細(xì)胞系、各種cos細(xì)胞系、hela細(xì)胞、293細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化的b細(xì)胞和雜交瘤。用于此類細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列例如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(queen等人，immunol.rev.89:49(1986))以及必需的加工信息位點(diǎn)例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、rna剪接位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列是來(lái)源于免疫球蛋白基因、sv40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒等的啟動(dòng)子。參見(jiàn)co等人，j.immunol.148:1149(1992)?？赏ㄟ^(guò)熟知的方法(所述方法視細(xì)胞宿主類型的變化而變化)將包含目的多核苷酸序列(例如，重鏈和輕鏈編碼序列和表達(dá)控制序列)的載體轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染通常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofection)、基因槍(biolistics)或基于病毒的轉(zhuǎn)染可用于其他細(xì)胞宿主。(通常參見(jiàn)sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual(coldspringharborpress，第2版，1989)。用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、電穿孔和顯微注射(通常參見(jiàn)，sambrook等人，同上)。為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可將轉(zhuǎn)基因顯微注射入受精的卵母細(xì)胞，或可將其整合入胚胎干細(xì)胞的基因組，并且將此類細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移入去核卵母細(xì)胞。還可將受試多肽整合在轉(zhuǎn)基因中以引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組和隨后在例如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的奶中進(jìn)行表達(dá)(參見(jiàn)，例如，deboer等人5,741,957；rosen5,304,489；和meade5,849,992)。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因包括與來(lái)自乳腺特異性基因例如酪蛋白或β-乳球蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子有效連接的輕鏈和/或重鏈的編碼序列?？墒褂脝蝹€(gè)載體或兩個(gè)載體表達(dá)多肽。例如，可將抗體重鏈和輕鏈克隆在分開(kāi)的表達(dá)載體上并且共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用信號(hào)序列促進(jìn)本發(fā)明的多肽表達(dá)。在表達(dá)后，可按照本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法包括硫酸銨沉淀法、親和柱(例如，蛋白a或蛋白g)、柱層析、hplc純化、凝膠電泳等(通常參見(jiàn)scopes，proteinpurification(springer-verlag，n.y.，(1982))來(lái)純化多肽?？赏ㄟ^(guò)培養(yǎng)的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系來(lái)表達(dá)人源化的ig可變區(qū)或包含其的多肽。還可在體內(nèi)在細(xì)胞中表達(dá)它們。被轉(zhuǎn)化(例如，轉(zhuǎn)染)以產(chǎn)生改變的抗體的細(xì)胞系可以是永生化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如，淋巴來(lái)源的細(xì)胞系(例如，骨髓瘤、雜交瘤、三源雜交瘤或四源雜交瘤(quadroma)細(xì)胞系)。細(xì)胞系還可包括已通過(guò)用病毒(例如，eb病毒)轉(zhuǎn)化而被永生化的正常淋巴細(xì)胞例如b細(xì)胞。雖然通常用于產(chǎn)生多肽的細(xì)胞系是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，但還可使用來(lái)自其他來(lái)源(例如細(xì)菌和酵母)的細(xì)胞系。特別地，可使用大腸桿菌來(lái)源的細(xì)菌菌株，尤其是例如噬菌體展示。一些永生化的淋巴細(xì)胞系例如骨髓瘤細(xì)胞系在其正常狀態(tài)下分泌分離的ig輕鏈或重鏈。如果用表達(dá)在本發(fā)明的方法中制備的改變的抗體的載體轉(zhuǎn)化這樣的細(xì)胞系，則將不必進(jìn)行所述方法的剩余步驟，只要正常分泌的鏈與由更早制備的載體編碼的ig鏈的可變結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)。如果永生化的細(xì)胞系不分泌或不分泌互補(bǔ)鏈，則必需將編碼適當(dāng)?shù)幕パa(bǔ)鏈或其片段的載體引入細(xì)胞。在其中永生化細(xì)胞系分泌互補(bǔ)輕鏈或重鏈的情況下，可以例如通過(guò)用載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)菌細(xì)胞，然后將細(xì)菌細(xì)胞與永生化細(xì)胞系(例如，通過(guò)質(zhì)體融合)融合來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系?？蛇x擇地，可通過(guò)電穿孔將dna直接引入永生化細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中描述的或通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的人源化的ig可變區(qū)可存在于任何抗體的抗原結(jié)合片段中?？芍亟M產(chǎn)生片段，改造片段、合成片段或可通過(guò)用蛋白水解酶降解抗體來(lái)產(chǎn)生片段。例如，片段可以是fab片段；使用木瓜蛋白酶的降解在連接兩個(gè)重鏈的鏈間(即，vh-vh)二硫鍵之前的區(qū)域斷裂抗體。這導(dǎo)致形成包含輕鏈和重鏈的vh和ch1結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)相同片段。可選擇地，片段可以是f(ab')2片段?？赏ㄟ^(guò)用在鏈間二硫鍵之后斷裂重鏈從而產(chǎn)生包含兩個(gè)抗原結(jié)合部位的片段的胃蛋白酶降解抗體來(lái)產(chǎn)生此類片段。另一個(gè)可選擇的方案是使用“單鏈”抗體?？梢砸远喾N方式構(gòu)建單鏈fv(scfv)片段。例如，可將vh的c端連接至vl的n端。通常，將接頭(例如，(ggggs)4)置于vh與vl之間。然而，鏈連接的順序可以是相反的，并且可包括幫助檢測(cè)或純化的標(biāo)簽(例如myc-、his-或flag-標(biāo)簽)(標(biāo)簽例如可連接至本發(fā)明的任何抗體或抗體片段的標(biāo)簽；其用途不限于scfv)。因此，并且如下文中指出的，標(biāo)記的抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在可選擇的實(shí)施方案中，本文中描述的或通過(guò)本文中所述的方法產(chǎn)生的抗體可以是重鏈二聚體或輕鏈二聚體。此外，可使用抗體輕鏈或重鏈或其部分，例如，單結(jié)構(gòu)域抗體(dab)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中描述的或通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的人源化ig可變區(qū)存在于單鏈抗體(scfv)或微小抗體(minibody)(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利5,837,821或wo94/09817a1)中。微小抗體是由兩條多肽鏈構(gòu)成的二聚體分子，所述多肽各自包含scfv分子(包含一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合部位的單個(gè)多肽，例如，通過(guò)柔性接頭連接的vl結(jié)構(gòu)域和vh結(jié)構(gòu)域(通過(guò)連接肽融合至ch3結(jié)構(gòu)域))?？梢砸詖h-接頭-vl方向或vl-接頭-vh方向構(gòu)建scfv分子。連接組成抗原結(jié)合部位的vl和vh結(jié)構(gòu)域的柔性鉸鏈優(yōu)選包含大約10至大約50個(gè)氨基酸殘基。用于該目的的示例性連接肽是(gly4ser)3(huston等人(1988).pnas，85:5879)。其他連接肽在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。制備單鏈抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，例如，ho等人(1989)，gene，77:51；bird等人(1988)，science242:423；pantoliano等人(1991)，biochemistry30:10117；milenic等人(1991)，cancerresearch，51:6363；takkinen等人(1991)，proteinengineering4:837?？赏ㄟ^(guò)使用本領(lǐng)域中描述的方法(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5,837,821或wo94/09817a1)構(gòu)建scfv組分和連接肽-ch3組分來(lái)制造微小抗體。可以以限制性片段的形式從分開(kāi)的質(zhì)粒分離此類組分，然后將其連接并且再克隆入適當(dāng)?shù)妮d體。可通過(guò)限制性降解和dna序列分析來(lái)驗(yàn)證適當(dāng)?shù)难b配。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的微小抗體包含連接肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接肽包含gly/ser接頭例如gggssgggsgg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可構(gòu)建四價(jià)微小抗體。除了使用柔性接頭(其例如具有氨基酸序列(g4s)4g3as)連接兩個(gè)scfv分子外，可以以與微小抗體相同的方式構(gòu)建四價(jià)微小抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中描述的或通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的人源化可變區(qū)可存在于雙抗體(diabody)中。雙抗體與scfv分子相似，但通常具有連接兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的短的(少于10個(gè)，優(yōu)選1至5個(gè))氨基酸殘基接頭，以便相同多肽鏈上的vl和vh結(jié)構(gòu)域不能相互作用。相反，一個(gè)多肽鏈的vl和vh結(jié)構(gòu)域與第二多肽鏈上的vh和vl結(jié)構(gòu)域(分別地)相互作用(wo02/02781)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化可變區(qū)存在于有效地連接至fcr結(jié)合部分的抗體的免疫反應(yīng)性片段或部分(例如，scfv分子、微小抗體、四價(jià)微小抗體或雙抗體)中。在示例性實(shí)施方案中，fcr結(jié)合部分是完全fc區(qū)域。優(yōu)選，本文中描述的人源化方法產(chǎn)生其中對(duì)于抗原的親和力與供體抗體相比較基本上未改變的ig可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的可變區(qū)的多肽以大于(或等于)大約105m-1、106m-1、107m-1、108m-1、109m-1、1010m-1、1011m-1或1012m-1(包括介于這些值之間的親和力)的結(jié)合常數(shù)ka的結(jié)合親和力結(jié)合抗原。可以以多種方法測(cè)量親和力、親合力和/或特異性。通常，無(wú)論其中確定和測(cè)量親和力的確切方法如何，本發(fā)明的方法，當(dāng)它們產(chǎn)生在其臨床應(yīng)用的任何方面優(yōu)于其所源自的抗體的抗體時(shí)，提高了抗體的親和力(例如，當(dāng)修飾的抗體可以以比其所源自的抗體更低的劑量或更低的頻率或通過(guò)更方便的施用途徑施用時(shí)，本發(fā)明的方法被認(rèn)為是有效或成功的)。更特別地，抗體與其結(jié)合的抗原之間的親和力可通過(guò)各種測(cè)定(包括例如elisa測(cè)定、biacore測(cè)定或kinexatm3000測(cè)定(可從sapidyneinstruments(boise，id)獲得))來(lái)測(cè)量。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)共價(jià)連接用抗原(用于本發(fā)明的方法的抗原可以是任何目的抗原(例如，癌癥抗原；細(xì)胞表面蛋白或分泌蛋白；病原體的抗原(例如細(xì)菌或病毒抗原(例如，hiv抗原、流感抗原或肝炎抗原))或變應(yīng)原))包被sepharose珠粒。制備待測(cè)試的抗體的稀釋物，并且將各稀釋物加至板上指定的孔中。然后向各孔中加入檢測(cè)抗體(例如，山羊抗人igg-hrp綴合物)，然后加入生色底物(例如hrp)。然后在450nm處在elisa酶標(biāo)儀中讀取板，并且計(jì)算ec50值。(然而，應(yīng)理解，此處描述的方法是可普遍應(yīng)用的；它們不限于產(chǎn)生結(jié)合任何特定抗原或抗原種類的抗體)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，測(cè)定親和力并非總是如看單個(gè)圖那樣簡(jiǎn)單。因?yàn)榭贵w具有兩個(gè)臂，因此它們的表觀親和力通常比可變區(qū)與抗原之間的固有親和力高得多(這據(jù)信歸因于親合力)?？墒褂胹cfv或fab片段測(cè)量固有親和力。在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包含本發(fā)明的人源化兔抗體或其片段的雙特異性分子?？蓪⒈景l(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分衍生或連接至另一種功能性分子例如另一種肽或蛋白質(zhì)(例如，受體的另一種抗體或配體)以產(chǎn)生結(jié)合至少兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)或靶分子的雙特異性分子?？蓪⒈景l(fā)明的抗體衍生或連接至超過(guò)一個(gè)的其他功能性分子以產(chǎn)生結(jié)合超過(guò)兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)和/或靶分子的多特異性分子；此類多特異性分子也意欲包括在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“雙特異性分子”中。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，可將本發(fā)明的抗體功能性地連接(例如，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價(jià)結(jié)合或其他方法)至一個(gè)或多個(gè)其他結(jié)合分子例如另一個(gè)抗體、抗體片段、腫瘤特異性或病原體特異性抗原、肽或結(jié)合模擬物，以便產(chǎn)生雙特異性分子。因此，本發(fā)明包括包含至少一個(gè)對(duì)于第一靶具有特異性的第一結(jié)合分子和對(duì)于一個(gè)或多個(gè)另外的靶表位具有特異性的第二結(jié)合分子的雙特異性分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一個(gè)抗體或其抗體片段(包括例如fab、fab'、f(ab')2、fv或單鏈fv)作為結(jié)合特異性。抗體還可以是輕鏈或重鏈二聚體，或其任何最小片段例如fv或單鏈構(gòu)建體，如ladner等人的美國(guó)專利4,946,778(其內(nèi)容通過(guò)引用合并入本文)中所描述的。雖然人單克隆抗體是優(yōu)選的，但可用于本發(fā)明的雙特異性分子的其他抗體是鼠單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和人源化單克隆抗體。本發(fā)明的雙特異性分子可通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的方法綴合組分結(jié)合特異性來(lái)制備。例如，可分開(kāi)地產(chǎn)生雙特異性分子的各結(jié)合特異性，然后將其彼此綴合。當(dāng)結(jié)合特異性是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，可將多種偶聯(lián)或交聯(lián)劑用于共價(jià)綴合。交聯(lián)劑的實(shí)例包括蛋白a、碳二亞胺、n-琥珀酰亞胺基-s-乙?；?硫代乙酸酯(sata)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)、鄰-苯二馬來(lái)酰亞胺(opdm)、n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)和4-(n-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-smcc)(參見(jiàn)例如，karpovsky等人(1984)j.exp.med.160:1686；liu，ma等人(1985)proc.natl.acad.sciusa82:8648)。其他方法包括paulus(1985)behringins.mitt.no.78，118-132；brennan等人(1985)science229:81-83)，和glennie等人(1987)j.immunol.139：2367-2375)中描述的方法。優(yōu)選的綴合劑是sata和磺基-smcc，兩者都可從piercechemicalco.(rockford，il)獲得。當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時(shí)，可通過(guò)兩個(gè)重鏈的c端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合來(lái)綴合它們。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾鉸鏈區(qū)以在綴合前包含奇數(shù)個(gè)(優(yōu)選1個(gè))巰基殘基?？蛇x擇地，可在相同的載體中編碼兩個(gè)結(jié)合特異性，并且在相同的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)和裝配。該方法在雙特異性是mabxmab、mabxfab、fabxf(ab')2或配體xfab融合蛋白的情況下特別有用。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一個(gè)單鏈抗體和結(jié)合決定簇的單鏈分子，或包含兩個(gè)結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個(gè)單鏈分子。用于制備雙特異性分子的方法描述于例如美國(guó)專利5,260,203；美國(guó)專利5,455,030；美國(guó)專利4,881,175；美國(guó)專利5,132,405；美國(guó)專利5,091,513；美國(guó)專利5,476,786；美國(guó)專利5,013,653；美國(guó)專利5,258,498和美國(guó)專利5,482,858。雙特異性分子對(duì)它們的特異性靶的結(jié)合可通過(guò)例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、放射性免疫測(cè)定(ria)、基于流式細(xì)胞術(shù)的單細(xì)胞分選(例如facs分析)、生物測(cè)定(例如，生長(zhǎng)抑制)或通過(guò)western印跡測(cè)定來(lái)確認(rèn)。每一種此類測(cè)定通常通過(guò)利用特異于目的復(fù)合物的標(biāo)記試劑(例如，抗體)來(lái)檢測(cè)特定目的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。例如，可使用例如識(shí)別并且特異性結(jié)合抗體-vegf復(fù)合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段檢測(cè)抗體復(fù)合物。可選擇地，可使用多種其他的免疫測(cè)定的任一種檢測(cè)復(fù)合物。例如，可放射性標(biāo)記抗體并且將其用于放射免疫測(cè)定(ria)(參見(jiàn)，例如，weintraub，b.，principlesofradioimmunoassays，seventhtrainingcourseonradioligandassaytechniques，theendocrinesociety，march，1986，其通過(guò)引用合并入本文)。可通過(guò)這樣的方法如使用γ計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或通過(guò)放射自顯影檢測(cè)放射性同位素。在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了綴合至治療性部分例如細(xì)胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素的人源化兔抗體或其片段。此類綴合物在本文中稱為“免疫綴合物”。包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒素的免疫綴合物稱為“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑(cytotoxicagent)包括對(duì)細(xì)胞有害(例如，殺死細(xì)胞)的任意試劑。實(shí)例包括泰素、細(xì)胞松弛素b、短桿菌肽d、溴乙啶、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基蒽二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素d、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素以及其類似物或同源物。治療劑還包括例如抗代謝物(例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達(dá)卡巴嗪)、烷化劑(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素c和順-二氯二胺鉑(ii)(ddp)順鉑)、蒽環(huán)類(例如，柔紅霉素(以前稱為道諾霉素)和多柔比星)、抗生素類(例如，放線菌素d(以前稱為放線菌素)、博來(lái)霉素、光輝霉素和氨茴霉素(amc))以及抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)?？删Y合至本發(fā)明的抗體的治療性細(xì)胞毒素的其他優(yōu)選的實(shí)例包括多卡米星、卡奇霉素(calicheamicin)、美坦辛和auristatin及其衍生物。卡奇霉素抗體綴合物的實(shí)例是可商購(gòu)獲得的(mylotargtm；wyeth-ayerst)?？墒褂每稍诒绢I(lǐng)域內(nèi)獲得的接頭技術(shù)將細(xì)胞毒素綴合至本發(fā)明的抗體。已用于將細(xì)胞毒素綴合至抗體的接頭類型的實(shí)例包括但不限于腙類、硫醚、酯類、二硫化物類和包含肽的接頭。可選擇例如對(duì)溶酶體區(qū)室中的低ph導(dǎo)致的切割易感或?qū)Φ鞍酌咐缒[瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶例如組織蛋白酶類(例如，組織蛋白酶b、c、d)導(dǎo)致的切割易感的接頭。關(guān)于細(xì)胞毒素的類型、將治療劑綴合至抗體的接頭和方法的論述，也參見(jiàn)saito，g.等人(2003)adv.drugdeliv.rev.55:199-215；trail，p.a.等人(2003)cancerimmunol.immunother.52:328-337；payne，g.(2003)cancercell3:207-212；allen，t.m.(2002)nat.rev.cancer2:750-763；pastan，i.和kreitman，r.j.(2002)curr.opin.investig.drugs3:1089-1091；senter，p.d.和springer，c.j.(2001)adv.drugdeliv.rev.53:247-264。還可將本發(fā)明的抗體綴合至放射性同位素以產(chǎn)生也稱為放射免疫綴合物的細(xì)胞毒性放射性藥物?？杀痪Y合至用于診斷或治療的抗體的放射性同位素的實(shí)例包括但不限于碘131、銦111、釔90和镥177。本領(lǐng)域已建立了用于制備免疫綴合物的方法。放射免疫綴合物的實(shí)例是可商購(gòu)獲得的，包括zevalintm(idecpharmaceuticals)和bexxartm(corixapharmaceuticals)，并且可使用相似的方法，使用本發(fā)明的抗體來(lái)制備放射免疫綴合物。本發(fā)明的抗體綴合物可用于改變給定的生物學(xué)應(yīng)答，并且藥物部分不被解釋為限定于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有期望的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。此類蛋白質(zhì)可包括例如酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白a、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)例如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑例如淋巴因子、白細(xì)胞介素-1("il-1")、白細(xì)胞介素-2("il-2")、白細(xì)胞介素-6("il-6")、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子("gm-csf")、粒細(xì)胞集落刺激因子("g-csf")或其他生長(zhǎng)因子。用于將此類治療性部分綴合至抗體的技術(shù)是熟知的，參見(jiàn)，例如，arnon等人，"monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy"，inmonoclonalantibodiesandcancertherapy，reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(alanr.liss，inc.1985)；hellstrom等人，"antibodiesfordrugdelivery"，incontrolleddrugdelivery(第2版)，robinson等人(eds.)，pp.623-53(marceldekker，inc.1987)；thorpe，"antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy：areview"，inmonoclonalantibodies'84：biologicalandclinicalapplications，pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985)；"analysis，results，andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy"，inmonoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy，baldwin等人(eds.)，pp.303-16(academicpress1985)，和thorpe等人，"thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates"，immunol.rev.，62:119-58(1982)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有用于治療疾病的人源化兔抗體的藥物制劑。術(shù)語(yǔ)"藥物制劑"是指以這樣的形式存在的制劑，所述形式允許抗體或抗體衍生物的生物學(xué)活性明確有效，并且所述制劑不包含對(duì)將給其施用所述制劑的受試者有毒的另外的成分?！八帉W(xué)上可接受的”賦形劑(媒介物、添加劑)是可適當(dāng)?shù)亟o受試哺乳動(dòng)物施用以提供有效劑量的使用的活性成分的那些?！胺€(wěn)定的”制劑是其中的抗體或抗體衍生物在貯存時(shí)基本上保持其物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物學(xué)活性的制劑。用于測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是可獲得的并且綜述于例如peptideandproteindrugdelivery，247-301，vincentleeed.，marceldekker，inc.，newyork，n.y.，pubs.(1991)和jones，a.adv.drugdeliveryrev.10:29-90(1993)中?？稍谶x擇的溫度下測(cè)量穩(wěn)定性，并進(jìn)行選擇的時(shí)間。優(yōu)選，制劑在室溫(大約30℃)或在40℃下穩(wěn)定至少1個(gè)月和/或在大約2-8℃下穩(wěn)定至少1年，至少2年。此外，制劑優(yōu)選在制劑的冷凍(至例如，-70℃)和解凍后穩(wěn)定。如果抗體或抗體衍生物在顏色和/或澄清度的目測(cè)檢查時(shí)或如通過(guò)uv光散射或通過(guò)尺寸排阻層析所測(cè)量的，沒(méi)有顯示聚集、沉淀和/或變性的跡象，那么其在藥物制劑中“保持其物理穩(wěn)定性”。如果在給定的時(shí)間上化學(xué)穩(wěn)定性是使蛋白質(zhì)被認(rèn)為仍然保持其生物學(xué)活性(如下文中所定義的)的化學(xué)穩(wěn)定性，那么抗體或抗體衍生物在藥物制劑中“保持其化學(xué)穩(wěn)定性”?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)和定量蛋白質(zhì)的化學(xué)改變的形式來(lái)估量化學(xué)穩(wěn)定性?；瘜W(xué)變化可包括大小改變(例如，剪切(clipping))，其可使用例如尺寸排阻層析、sds-page和/或基質(zhì)輔助激光解吸附電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi/tofms)來(lái)評(píng)估。其他類型的化學(xué)變化包括可通過(guò)例如離子交換層析來(lái)評(píng)估的電荷變化(例如，由于脫酰胺作用而發(fā)生的)。如果在給定的時(shí)間上抗體的生物學(xué)活性在制備藥物制劑時(shí)所展示的生物學(xué)活性的大約10％內(nèi)(在測(cè)定的誤差內(nèi))(如在例如抗原結(jié)合測(cè)定中所測(cè)定的)，那么抗體或抗體衍生物在藥物制劑中“保持其生物學(xué)活性”。在下文中詳盡地闡述抗體的其他“生物學(xué)活性”測(cè)定?！暗葷B的”意指目的制劑具有與人血液大體上相同的滲透壓。等滲制劑通常具有大約250至350mosm的滲透壓。可使用例如蒸汽壓或冰冷凍型滲透計(jì)(ice-freezingtypeosmometer)測(cè)量等滲性?！岸嘣肌笔蔷哂卸鄠€(gè)羥基的物質(zhì)，其包括糖(還原性和非還原性糖)、糖醇和糖酸。本文中優(yōu)選的多元醇具有小于大約600kd(例如，在大約120至大約400kd的范圍內(nèi))的分子量?！斑€原性糖”是包含可還原金屬離子或與蛋白質(zhì)中的賴氨酸和其他氨基共價(jià)反應(yīng)的半縮醛基團(tuán)的糖，“非還原性糖”是不具有還原性糖的此類性質(zhì)的糖。還原性糖的實(shí)例是果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非還原性糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、蘇糖醇、山梨糖醇和甘油是糖醇的實(shí)例。至于糖酸，其包括l-葡糖酸和其金屬鹽。在期望制劑是冷凍-融化穩(wěn)定的情況下，多元醇優(yōu)選是在冷凍溫度(例如-20℃)下不結(jié)晶(結(jié)晶使得制劑中的抗體不穩(wěn)定)的多元醇。非還原性糖例如蔗糖和海藻糖是本文中優(yōu)選的多元醇，并且由于海藻糖的優(yōu)良的溶液穩(wěn)定性，海藻糖優(yōu)于蔗糖。如本文中使用的，“緩沖液”是指通過(guò)其酸堿共軛成分的作用抗ph變化的經(jīng)緩沖的溶液。本發(fā)明的緩沖液具有范圍在大約4.5至大約6.0、優(yōu)選大約4.8至大約5.5內(nèi)的ph；和最優(yōu)選具有大約5.0的ph?？煽刂苝h在該范圍內(nèi)的緩沖液的實(shí)例包括乙酸鹽(例如，乙酸鈉)、琥珀酸鹽(例如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸緩沖液。在期望冷凍-融化穩(wěn)定的制劑的情況下，緩沖液優(yōu)選不是磷酸鹽。在藥理學(xué)意義上，在本發(fā)明的背景中，抗體或抗體衍生物的“治療有效量”是指在預(yù)防或治療病癥(所述抗體或抗體衍生物對(duì)于其的治療是有效的)中有效的量?！凹膊?病癥”是可受益于使用抗體或抗體衍生物的治療的任何病況。其包括慢性和急性病癥或疾病，包括使哺乳動(dòng)物易患所述病癥的那些病理學(xué)狀況。“防腐劑”是可包含在制劑中以顯著減弱其中的細(xì)菌作用，從而有助于例如多用途制劑的產(chǎn)生的化合物?？赡艿姆栏瘎┑膶?shí)例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯己雙銨、苯扎氯銨(其中烷基是長(zhǎng)鏈化合物的烷基芐基二甲基氯化銨的混合物)和芐索氯銨。其他類型的防腐劑包括芳香醇例如酚、丁基和苯甲醇、對(duì)羥苯甲酸烷基酯例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間-甲酚。本文中最優(yōu)選的防腐劑是苯甲醇。本發(fā)明還提供了包含一種或多種抗體或抗體衍生物化合物以及至少一種生理上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。藥物組合物可包含例如水、緩沖液(例如，中性緩沖鹽溶液或磷酸緩沖鹽溶液)、乙醇、礦物油、植物油、二甲基亞砜、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白質(zhì)、佐劑、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化劑、螯合劑例如edta或谷胱甘肽和/或防腐劑中的一種或多種。如上文中所指出的，其他活性成分可以(但不是必須)包含在本文提供的藥物組合物中。載體是可在施用給患者前與抗體或抗體衍生物結(jié)合的物質(zhì)(通常用于控制化合物的穩(wěn)定性或生物利用度)。用于此類制劑中的載體通常是生物相容性的，并且還可以是生物可降解的。載體包括例如單價(jià)或多價(jià)分子例如血清白蛋白(例如，人或牛)、卵白蛋白、肽、多聚賴氨酸和多糖例如氨基葡聚糖和聚酰胺胺(polyamidoamine)。載體還可包括固體支持材料例如包含例如聚乳酸聚乙醇酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、膠乳、淀粉、纖維素或葡聚糖的珠粒和微粒。載體可以以多種方式(包括共價(jià)結(jié)合(直接地或經(jīng)由接頭基團(tuán))、非共價(jià)相互作用或混合)攜帶化合物?？膳渲扑幬锝M合物以用于任何適當(dāng)?shù)氖┯梅绞剑ɡ缇植?、口服、?jīng)鼻、直腸或胃腸外施用。在某些實(shí)施方案中，以適合于口服使用的形式存在的組合物是優(yōu)選的。此類形式包括例如丸劑、片劑、糖錠、錠劑、水性或油性懸浮劑、可分散粉劑或粒劑、乳劑、硬或軟膠囊或糖漿劑或酏劑。在其他實(shí)施方案中，可將本文提供的組合物配制為凍干劑(lyophilizate)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)胃腸外包括皮下、皮內(nèi)、血管內(nèi)(例如，靜脈內(nèi))、肌內(nèi)、經(jīng)脊柱、顱內(nèi)、鞘內(nèi)和腹膜內(nèi)注射以及任何相似的注射或輸注技術(shù)。可按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的用于制造藥物組合物的任何方法制備意欲用于口服施用的組合物，其可包含一種或多種試劑例如甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑以提供吸引人且可口的制劑。片劑包含與生理上可接受的適合用于制造片劑的賦形劑混合的活性成分。此類賦形劑包括例如惰性稀釋劑(例如，碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉)、?；瘎┖捅澜鈩?例如，玉米淀粉或海藻酸)、粘合劑(例如，淀粉、明膠或阿拉伯膠)和潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石)。片劑可以是無(wú)包被的，或它們可利用在胃腸道中延遲崩解和吸收從而在更長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)提供持續(xù)作用的已知技術(shù)進(jìn)行包被。例如，可使用時(shí)間延遲材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服施用的制劑還可以以硬明膠膠囊(其中將活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合)的形式或以軟明膠膠囊(其中將活性成分與水或油介質(zhì)(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合)的形式提供。水性懸浮劑包含與適合用于制造水性懸浮劑的賦形劑混合的抗體或抗體衍生物。此類賦形劑包括混懸劑(例如，羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羧丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠(gumtragacanth)和阿拉伯膠)；和分散劑或濕潤(rùn)劑(例如，天然存在的磷脂例如卵磷脂、烯烴氧化物與脂肪酸的縮合物例如聚氧乙烯硬脂酸酯、環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪族醇的縮合物例如十七乙烯基氧鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、環(huán)氧乙烷與從脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的縮合物例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與從脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯的縮合物例如聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)。水性懸浮劑還可包含一種或多種防腐劑例如乙基或正丙基對(duì)羥基苯甲酸、一種或多種著色劑、一種或多種調(diào)味劑以及一種或多種甜味劑例如蔗糖或糖精?？捎锰鹞秳├绺视?、丙二醇、山梨醇或蔗糖配制糖漿劑和酏劑。此類制劑還可包含一種或多種緩和劑(demulcent)、防腐劑、調(diào)味劑和/或著色劑?？赏ㄟ^(guò)將活性成分懸浮于植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)中或礦物油例如液體石蠟中來(lái)配制油性懸浮劑。油性懸浮劑可包含增稠劑例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？杉尤胩鹞秳├缟鲜鎏鹞秳┖?或調(diào)味劑以提供可口的口服制劑?？赏ㄟ^(guò)加入抗氧化劑例如抗壞血酸來(lái)保存此類懸浮劑。適合于通過(guò)加入水來(lái)制備水性懸浮劑的可分散粉劑和粒劑提供了與分散劑或濕潤(rùn)劑、混懸劑和一種或多種防腐劑混合的活性成分。適當(dāng)?shù)姆稚┗驖駶?rùn)劑和混懸劑是例如上文提及的試劑。還可存在另外的賦形劑例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。藥物組合物還可以以水包油乳劑的形式存在。油相可以是植物油(例如橄欖油或花生油)、礦物油(例如，液體石蠟)或其混合物。適當(dāng)?shù)娜榛瘎┌ㄌ烊淮嬖诘哪z(例如，阿拉伯膠和黃蓍膠)、天然存在的磷脂(例如，大豆、卵磷脂和從脂肪酸和己糖醇衍生的酯或部分酯)、酐類(例如，去水山梨糖醇單油酸酯)以及從脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯與環(huán)氧乙烷的縮合物(例如，聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)。乳劑還可包含一種或多種甜味劑和/或調(diào)味劑。可將藥物組合物配制為無(wú)菌注射水性或油性懸浮液，其中取決于所用的媒介物和濃度，將調(diào)節(jié)劑懸浮或溶解在媒介物中。還可按照現(xiàn)有技術(shù)，使用適當(dāng)?shù)姆稚?、濕?rùn)劑和/或混懸劑例如上文提及的那些來(lái)配制這樣的組合物。其中可使用的可接受的媒介物和溶劑是水、1,3-丁二醇、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌不揮發(fā)性油可用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可使用任何非刺激性的不揮發(fā)性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，可將脂肪酸例如油酸用于制備可注射的組合物，并且可將佐劑例如局部麻醉藥、防腐劑和/或緩沖劑溶解于媒介物中。還可將藥物組合物配制為持續(xù)釋放制劑(即，在施用后進(jìn)行調(diào)節(jié)劑的緩慢釋放的制劑例如膠囊)。通?？墒褂檬熘募夹g(shù)制備此類制劑，并且可通過(guò)例如口服、直腸或皮下植入，或通過(guò)在期望的靶位置植入來(lái)施用所述制劑。用于此類制劑中的載體是生物相容性的，并且還可以是生物可降解的；優(yōu)選地制劑提供相對(duì)恒定水平的調(diào)節(jié)劑釋放。持續(xù)釋放制劑中包含的抗體或抗體衍生物的量取決于例如植入的位置、釋放的速率和預(yù)期的持續(xù)時(shí)間以及待治療或預(yù)防的疾病/病癥的性質(zhì)。通常以在體液(例如，血液、血漿、血清、csf、滑液、淋巴、細(xì)胞間隙液、眼淚或尿)中獲得足以可檢測(cè)地結(jié)合靶例如vegf以及預(yù)防或抑制此類靶介導(dǎo)的疾病/病癥例如vegf介導(dǎo)的疾病/病癥的濃度的量施用本文中提供的抗體或抗體衍生物。如果劑量導(dǎo)致如本文中描述的可辨別的患者益處，則其被認(rèn)為是有效的。優(yōu)選全身性劑量的范圍是大約0.1mg至大約140mg/千克體重/天(大約0.5mg至大約7g/患者/天)，且口服劑量通常為靜脈內(nèi)劑量的約5至20倍?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單個(gè)劑型的抗體或抗體衍生物的量將隨治療的宿主和具體的施用模式的變化而變化。劑量單位形式通?？砂蠹s1mg至大約500mg的活性成分?？砂b藥物組合物以治療響應(yīng)抗例如vegf的抗體或抗體衍生物的病癥。包裝的藥物組合物可包括容器(其裝有有效量的至少一種本文中所述的抗體或抗體衍生物)和說(shuō)明書(例如，標(biāo)簽)(其說(shuō)明包含的組合物將用于治療響應(yīng)一種抗體或抗體衍生物(在施用給患者后)的疾病/病癥)。還可化學(xué)修飾本發(fā)明的抗體或抗體衍生物。優(yōu)選的修飾基團(tuán)是聚合物，例如任選地取代的直鏈或支鏈聚烯烴、polyalkenylene或聚氧烯烴聚合物或分支或不分支的多糖。此類效應(yīng)物基團(tuán)可增加抗體的體內(nèi)半衰期。合成的聚合物的具體實(shí)例包括任選地取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)(peg)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物。特定的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。需要時(shí)可改變聚合物的大小，但其平均分子量通常在500da至50000da的范圍內(nèi)。對(duì)于其中抗體設(shè)計(jì)用于滲透組織的局部應(yīng)用，聚合物的優(yōu)選分子量是約5000da?？蓪⒕酆衔锓肿舆B接至抗體，特別是經(jīng)由wo0194585中所述的共價(jià)連接的鉸鏈肽連接至fab片段重鏈的c末端。關(guān)于peg部分的連接，參見(jiàn)“poly(ethyleneglycol)chemistry，biotechnologicalandbiomedicalapplications”，1992，j.miltonharris(ed)，plenumpress，newyork和“bioconjugationproteincouplingtechniquesforthebiomedicalsciences”，1998，m.aslam和a.dent，grovepublishers，newyork。在如上所述制備目的抗體或抗體衍生物后，制備包含其的藥物制劑。待配制的抗體未經(jīng)歷在前的冷凍干燥并且本文中的目的制劑是水性制劑。優(yōu)選制劑中的抗體或抗體衍生物是抗體片段，例如scfv。通過(guò)考慮例如期望的劑量容積和施用模式來(lái)確定存在于制劑中的抗體的治療有效量。大約0.1mg/ml至大約50mg/ml，優(yōu)選大約0.5mg/ml至大約25mg/ml和最優(yōu)選大約2mg/ml至大約10mg/ml是制劑中的示例性抗體濃度。在ph緩沖劑中制備包含抗體或抗體衍生物的水性制劑。本發(fā)明的緩沖劑具有大約4.5至大約6.0，優(yōu)選大約4.8至大約5.5的ph，最優(yōu)選具有大約5.0的ph?？煽刂苝h在該范圍內(nèi)的緩沖劑的實(shí)例包括乙酸鹽(例如，乙酸鈉)、琥珀酸鹽(例如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸緩沖劑。緩沖劑的濃度可以是大約1mm至大約50mm，優(yōu)選大約5mm至大約30mm，取決于例如緩沖劑和制劑的期望的等滲性。優(yōu)選的緩沖劑是乙酸鈉(大約10mm)，ph5.0。將可用作張力劑(tonicifier)和可穩(wěn)定抗體的多元醇包含在制劑中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，制劑不包含緊張(tonicifying)量的鹽例如氯化鈉，因?yàn)檫@可引起抗體或抗體衍生物沉淀和/或可導(dǎo)致在低ph下的氧化作用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，多元醇是非還原性糖例如蔗糖或海藻糖。以可根據(jù)制劑的期望的等滲性而變化的量向制劑中加入多元醇。優(yōu)選水性制劑是等滲的，在該情況下制劑中適當(dāng)?shù)亩嘣紳舛仍诶绱蠹s1％至大約15％w/v的范圍內(nèi)，優(yōu)選在大約2％至大約10％whv的范圍內(nèi)。然而，高滲或低滲制劑也可以是合適的。加入的多元醇的量還根據(jù)多元醇的分子量而改變。例如，與二糖(例如海藻糖)相比較，可加入更低量的單糖(例如，甘露醇)。還可向抗體或抗體衍生物制劑中加入表面活性劑。示例性表面活性劑包括非離子型表面活性劑例如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。加入的表面活性劑的量是使其減少配制的抗體/抗體衍生物的聚集和/或使制劑中顆粒的形成降至最低和/或減少吸附的量。例如，表面活性劑可以以大約0.001％至大約0.5％，優(yōu)選大約0.005％至大約0.2％和最優(yōu)選大約0.01％至大約0.1％的量存在于制劑中。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包含上文中鑒定的試劑(即，抗體或抗體衍生物、緩沖劑、多元醇和表面活性劑)并且基本上不含一種或多種防腐劑，例如苯甲醇、苯酚、間-甲酚、氯丁醇和芐索氯銨。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在制劑中包含防腐劑，特別是在制劑為多劑量制劑的情況下。防腐劑的濃度可在大約0.1％至大約2％，最優(yōu)選大約0.5％至大約1％的范圍內(nèi)?？稍谥苿┲邪环N或多種其他藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑例如remington'spharmaceuticalsciences第21版，osol，a.ed.(2006)中描述的試劑，只要其不會(huì)不利地影響期望的制劑特征?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度上對(duì)接受者無(wú)毒，并且包括：另外的緩沖劑；共溶劑；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；螯合劑例如edta；金屬?gòu)?fù)合物(例如zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；生物可降解的聚合物例如聚酯；和/或形成鹽的抗衡離子例如鈉。用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。這可通過(guò)在配制制劑之前或之后利用無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾來(lái)容易地實(shí)現(xiàn)。按照已知的方法，例如以推注的形式靜脈內(nèi)施用或通過(guò)在一段時(shí)間內(nèi)的持續(xù)輸注，通過(guò)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑給需要使用所述抗體的治療的哺乳動(dòng)物優(yōu)選人施用制劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈內(nèi)施用給哺乳動(dòng)物施用制劑。為此，可使用例如注射器或通過(guò)iv線注射制劑?？贵w的適當(dāng)劑量(“治療有效量”)將取決于例如待治療的病癥、疾病的嚴(yán)重度和進(jìn)程、是為了預(yù)防目的還是為了治療目的而施用抗體、以前的治療、患者的臨床史和對(duì)抗體的應(yīng)答、使用的抗體類型以及主治醫(yī)生的判斷。適當(dāng)?shù)卦谝淮位蛟谝幌盗兄委熤薪o患者施用抗體或抗體衍生物，并且可在診斷后任何時(shí)間給患者施用抗體或抗體衍生物?？贵w或抗體衍生物還可作為單一治療或與用于治療所述病癥的其他藥物或治療劑結(jié)合進(jìn)行施用。作為一般建議，施用的抗體或抗體衍生物的治療有效量可在大約0.1至大約50mg/kg患者體重的范圍內(nèi)(無(wú)論通過(guò)一次還是多次施用)，且使用的抗體的常見(jiàn)范圍為例如大約0.3至大約20mg/kg，更優(yōu)選大約0.3至大約15mg/kg(每天施用一次)。然而，可以使用其他給藥方案?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)容易地監(jiān)控該治療的進(jìn)展。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含容器的制品，所述容器裝有本發(fā)明的藥物制劑，優(yōu)選水性制劑，并且任選地提供關(guān)于其使用的說(shuō)明書。適當(dāng)?shù)娜萜靼ɡ缙孔印⑿∑亢妥⑸淦?。容器可由多種材料例如塑料或玻璃制成。示例性容器是3-20cc的一次性玻璃小瓶。可選擇地，對(duì)于多劑量制劑，容器可以是3-100cc的玻璃小瓶。容器裝有制劑，并且在其上或與其結(jié)合的標(biāo)簽可標(biāo)明使用指導(dǎo)。制品還可包括從商業(yè)和用戶立場(chǎng)來(lái)看期望的其他材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、濾器、針、注射器和具有使用說(shuō)明的產(chǎn)品說(shuō)明書。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，制品包括本文中描述的或通過(guò)本文中描述的方法產(chǎn)生的凍干的免疫結(jié)合劑。實(shí)施例本公開(kāi)內(nèi)容還通過(guò)下列實(shí)施例來(lái)舉例說(shuō)明，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋為進(jìn)一步限定。本申請(qǐng)中提及的所有圖和所有參考資料、專利和公開(kāi)的專利申請(qǐng)的內(nèi)容以它們的全文通過(guò)引用明確地合并入本文。材料和方法一般而言，除非另外指出，否則本發(fā)明的實(shí)施使用化學(xué)、分子生物學(xué)、重組dna技術(shù)、免疫學(xué)(尤其是例如抗體技術(shù))的常規(guī)技術(shù)和多肽制備的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。參見(jiàn)，例如，sambrook，fritsch和maniatis，molecularcloning:coldspringharborlaboratorypress(1989)；antibodyengineeringprotocols(methodsinmolecularbiology)，510，paul，s.，humanapr(1996)；antibodyengineering:apracticalapproach(practicalapproachseries，169)，mccafferty，ed.，irlpr(1996)；antibodies:alaboratorymanual，harlow等人，c.s.h.l.press，pub.(1999)；和currentprotocolsinmolecularbiology，eds.ausubel等人，johnwiley&sons(1992)。用于將來(lái)自兔和其他非人單克隆抗體的cdr移植入選擇的人抗體構(gòu)架的方法在上文中進(jìn)行了詳細(xì)描述。此類移植實(shí)驗(yàn)的實(shí)例示于下文中。為了更好地理解，命名為"min"的移植物是其中cdr被移植至構(gòu)架1.4或其可變結(jié)構(gòu)域的移植物，而稱為"max"的移植物是其中cdr被移植至構(gòu)架1.4或其可變結(jié)構(gòu)域并且其中所述構(gòu)架還包含與抗原相互作用的供體構(gòu)架殘基的移植物。實(shí)施例1:rfw1.4的設(shè)計(jì)1.1.一級(jí)序列分析和數(shù)據(jù)搜索1.1.1.兔免疫球蛋白序列的收集從不同的開(kāi)源數(shù)據(jù)庫(kù)(例如kabat數(shù)據(jù)庫(kù)和imgt)收集兔成熟抗體和種系的可變結(jié)構(gòu)域序列并且將其以單字母代碼氨基酸序列的形式輸入定制的數(shù)據(jù)庫(kù)。為了進(jìn)行完整的分析，我們只使用相應(yīng)于v(可變)區(qū)的氨基酸部分。棄去kdb數(shù)據(jù)庫(kù)中低于70％完整性或在構(gòu)架區(qū)中包含多個(gè)未確定的殘基的序列。也排除與數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的任何其他序列具有超過(guò)95％同一性的序列以在分析中避免隨機(jī)嗓音。1.1.2.兔序列的比對(duì)和編號(hào)使用基于needleman-wunsch算法和blossum矩陣的常規(guī)序列比對(duì)工具比對(duì)兔抗體序列。按照免疫球蛋白的可變結(jié)構(gòu)域的aho編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行缺口的引入和殘基位置的命名(honegger和pluckthun，2001)。還平行地使用kabat編號(hào)方案，因?yàn)槠涫亲顝V泛采用的用于編號(hào)抗體中的殘基的標(biāo)準(zhǔn)。使用subim程序分配kabat編號(hào)。該程序分析抗體序列的可變區(qū)并且按照由kabat和同事(deret等人1995)建立的系統(tǒng)給序列編號(hào)。按照基于序列可變性的最常用的kabat定義進(jìn)行構(gòu)架和cdr區(qū)的界定。然而，cdr-hl命名是不同定義(包括abm's、kabat's、通過(guò)分析一組3d復(fù)合物結(jié)構(gòu)的抗體與抗原之間接觸而產(chǎn)生的平均接觸數(shù)據(jù)(maccallum等人，1996)和基于結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域的定位的chotia's)之間的妥協(xié)(上述的和圖1中顯示的)。1.1.3.殘基位置的頻率和保守性使用一組423個(gè)兔序列(來(lái)自kabat數(shù)據(jù)庫(kù))分析氨基酸序列多樣性。通過(guò)將在數(shù)據(jù)組中觀察到的特定殘基的次數(shù)除以序列的總數(shù)來(lái)計(jì)算成熟兔序列中每一個(gè)位置i的殘基頻率f(r)。使用辛普森指數(shù)(其考慮了不同氨基酸存在的數(shù)目以及各殘基的相對(duì)豐度)計(jì)算各位置i的保守程度。其中:n表示氨基酸的總數(shù),r是存在于各位置處的不同氨基酸的數(shù)目以及n是特定氨基酸種類的殘基的數(shù)目。1.1.4.兔v區(qū)的譜系分析使用系統(tǒng)發(fā)生分析工具研究兔庫(kù)集(repertoire)。使用聚類和拓?fù)鋵W(xué)算法對(duì)v區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行聚類。計(jì)算整個(gè)陣列的距離矩陣并且將其用作種系使用(germlineusage)的指標(biāo)。計(jì)算各聚類的共有序列并且鑒定最接近的兔種系序列對(duì)應(yīng)物。還推算整個(gè)序列組的總體共有序列。1.1.5.人亞組的分配對(duì)于不同聚類的各兔代表性序列，使用序列分析算法和分類方法的excel工具(knappik等人，2000)基于人抗體庫(kù)集的分析鑒定最同源的人亞組。1.2.人受體構(gòu)架的設(shè)計(jì)利用來(lái)自上述序列分析的兔庫(kù)集的藍(lán)圖，鑒定構(gòu)架中通常參與兔cdr的定位的殘基。在相對(duì)于兔庫(kù)集和各個(gè)聚類具有較高的同源性的構(gòu)架中，具有良好生物物理性質(zhì)的一個(gè)構(gòu)架選自完全人序列的庫(kù)。用作受體構(gòu)架的所選擇的構(gòu)架屬于可變輕鏈亞組κ1和可變重鏈亞組iii(相應(yīng)地具有esbatech'sidki27，a43)。已使用稱為“質(zhì)量控制”系統(tǒng)的基于酵母的篩選方法(aufdermaur等人，2004)通過(guò)篩選人脾scfv文庫(kù)，鑒定了該穩(wěn)定且可溶的抗體構(gòu)架，并且將其命名為“fw1.4”。雖然穩(wěn)定且可溶的構(gòu)架序列fw1.4展示高同源性，但其不是可獲得的最同源的序列。將鑒定的殘基整合入所述受體構(gòu)架以產(chǎn)生rfw1.4。利用關(guān)于兔抗體的氨基酸序列多樣性、種系使用和結(jié)構(gòu)特征的信息，我們就在新型人構(gòu)架中保持cdr構(gòu)象所需的殘基位置的相容性分析了fw1.4。我們就下列特征的相容性檢查了fw1.4的可變區(qū)：i.作為環(huán)結(jié)構(gòu)的經(jīng)典序列的一部分的殘基。ii.位于vl/vh界面的構(gòu)架殘基iii.在cdr正下方的殘基的平臺(tái)iv.上核心殘基和下核心殘基v.確定亞型的構(gòu)架殘基。1.3.兔cdr的移植通過(guò)簡(jiǎn)單地將來(lái)自一個(gè)抗體的cdr序列(按照上述定義)與fw1.4或rfw1.4的構(gòu)架序列組合來(lái)產(chǎn)生移植物。鑒定潛在地參與結(jié)合的殘基。對(duì)于每一個(gè)兔可變結(jié)構(gòu)域序列，鑒定最接近的兔種系對(duì)應(yīng)物。如果不能確定最接近的種系，那么將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分?jǐn)?shù)的兔序列的共有序列相比較。罕見(jiàn)構(gòu)架殘基被認(rèn)為可能是體細(xì)胞高突變的結(jié)果，從而在結(jié)合中起作用。因此，將此類殘基移植至受體構(gòu)架上。1.4結(jié)果通過(guò)在結(jié)構(gòu)、氨基酸序列多樣性和種系使用方面分析兔抗體庫(kù)集，在fw1.4的輕鏈中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)經(jīng)改造維持兔cdr的環(huán)構(gòu)象的殘基位置。這些位置在兔抗體中是高度保守的。根據(jù)兔庫(kù)集推導(dǎo)出這5個(gè)位置的共有殘基并且將其引入人受體構(gòu)架1.4。通過(guò)改造這些保守位置，所述構(gòu)架實(shí)際上變得與任何兔cdr的所有6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)相容。包含不同兔cdr的rfw1.4，與野生型單鏈相反，良好地表達(dá)和良好地產(chǎn)生。產(chǎn)生通過(guò)組合該構(gòu)架與兔cdr而衍生的16個(gè)成員，并進(jìn)行詳細(xì)地表征，其顯示功能性。實(shí)施例2:b細(xì)胞篩選系統(tǒng)為了選擇通過(guò)其b細(xì)胞受體(bcr)結(jié)合目的靶的b細(xì)胞，在esbatech建立了基于facs(基于流式細(xì)胞術(shù)的單細(xì)胞分選)的篩選系統(tǒng)。一個(gè)靶是例如可溶性蛋白質(zhì)，即用熒光染料(pe和percp)標(biāo)記的單鏈抗體(esba903)。從用重組靶免疫的兔的脾制備淋巴細(xì)胞懸浮液。然后將細(xì)胞與pe和percp標(biāo)記的esba903以及與特異于igg(apc-標(biāo)記的)或igm(fitc標(biāo)記的)的抗體一起溫育。在96孔板中分選在其表面上表達(dá)igg而非igm的esba903陽(yáng)性b細(xì)胞(圖3；表2)。通過(guò)胸腺瘤輔助細(xì)胞系(el4-b5:參見(jiàn)zubler等人，1985，j.immunol，134(6):3662-3668)，選擇的b細(xì)胞增殖、分化成漿細(xì)胞并且分泌抗體。通過(guò)elisa和biacore測(cè)量確認(rèn)此類igg對(duì)于靶的親和力。7個(gè)選擇的克隆的動(dòng)力學(xué)參數(shù)描述于表1中。來(lái)自大約200個(gè)分選的細(xì)胞的混合物的這些克隆顯示低納摩爾至皮摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力。最后，從6個(gè)目的克隆分離mrna，并且將cdr移植在單鏈構(gòu)架fw1.4上。表1:7個(gè)b細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的動(dòng)力學(xué)值。表2:分選統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)實(shí)施例3:用抗tnfα抗體包被的珠粒與表達(dá)膜結(jié)合tnfα的cho細(xì)胞之間的相互作用的檢測(cè)。為了評(píng)估流式細(xì)胞儀液流的高壓是否破壞兩個(gè)細(xì)胞之間的非共價(jià)結(jié)合，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。將用膜結(jié)合tnfα穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞(b-220細(xì)胞)與用pe-標(biāo)記的抗tnfα抗體包被的珠粒一起溫育。在該設(shè)置中，珠粒模擬記憶b細(xì)胞(它們具有大致相同的大小)。作為陰性對(duì)照，使用未轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞，以及用apc標(biāo)記的不相關(guān)抗體(抗-cd19)包被的珠粒。在攪拌的條件下在4℃下溫育2小時(shí)后，通過(guò)facs(使用130um噴嘴)分析細(xì)胞-珠粒懸浮液。圖4顯示，抗tnfα珠粒與tnfα轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞之間的特異性結(jié)合是可使用facs明確地檢測(cè)到的。事實(shí)上，在該樣品(上圖)中，大約三分之二的珠粒結(jié)合至細(xì)胞(585個(gè)結(jié)合的對(duì)267個(gè)未結(jié)合的)。相反，在對(duì)照樣品(中圖和下圖)中，幾乎沒(méi)有珠粒結(jié)合cho細(xì)胞。此外，將兩個(gè)珠粒群體(抗tnfα-pe和抗cd19-apc)與tnfα轉(zhuǎn)染的cho細(xì)胞混合在一起。圖5和表4顯示，大約一半的抗tnfα珠粒結(jié)合cho細(xì)胞，然而，絕大部分抗cd19珠粒仍未結(jié)合。各樣品中結(jié)合細(xì)胞的珠粒的百分?jǐn)?shù)詳細(xì)地示于表5中。因此，證明了，可使用流式細(xì)胞術(shù)特異性地選擇通過(guò)其b細(xì)胞受體結(jié)合完整膜靶蛋白的單個(gè)b細(xì)胞。表3a：分選統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(也參見(jiàn)圖4)群體#事件％親本％總數(shù)所有事件10.000###100，0p19.69296，996，9p35856，05，9p410，00，0p22672，72，7表3b：分選統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(也參見(jiàn)圖4)群體#事件％親本％總數(shù)所有事件10.000###100，0p19.39994，094，0p330，00，0p460，10，1p25505，65，6表3c：分選統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(也參見(jiàn)圖4)群體#事件％親本％總數(shù)所有事件10.000###100，0p19.00190，090，0p3130，10，1p470，10，1p28118，18，1表4：分選統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(也參見(jiàn)圖5)群體#事件％親本％總數(shù)所有事件10.000###100，0p19.09691，091，0p34014，44，0p420，00，op28568，68，6表5：各樣品中結(jié)合cho細(xì)胞的珠粒的百分?jǐn)?shù)實(shí)施例4：抗tnfα兔供體抗體的cdr移植和功能性人源化選擇4個(gè)抗tnfα兔抗體″rabmab″(epi-1、epi-15、ep-34、ep-35和ep-42)用于cdr移植。如說(shuō)明書部分所概述的進(jìn)行用于人源化兔供體抗體的cdr移植、人源化和初步表征的一般實(shí)驗(yàn)方案。與使用與非人供體抗體共有最大序列同源性的人抗體受體構(gòu)架的常規(guī)人源化方法不同，將兔cdr移植入使用質(zhì)量控制測(cè)定(wo0148017)就期望的功能性質(zhì)(溶解性和穩(wěn)定性)預(yù)先選擇的人構(gòu)架fw1.4。這些穩(wěn)定和可溶的構(gòu)架序列展示與rabmab的高同源性。使用本文中描述的方法針對(duì)每一個(gè)rabmab產(chǎn)生cdr移植物。在″min″移植物中，只將兔cdr從兔供體抗體的vl和vh結(jié)構(gòu)域移植至人受體構(gòu)架fw1.4?！錷ax″移植物是指將兔cdr移植至rfw1.4。如下產(chǎn)生本文中描述和表征的scfv。通過(guò)seqidno.8的接頭將人源化的vl序列連接至人源化的vh序列以產(chǎn)生下列方向的scfv：nh2-vl-接頭-vh-cooh。在許多情況下，由服務(wù)提供商entelechongmbh(www.entelechon.com)從頭合成編碼各個(gè)scfv的dna序列。通過(guò)分別在scfvdna序列的5'和3'末端上引入的ncoi和hindiii限制性位點(diǎn)將所得的dna插入物克隆入細(xì)菌表達(dá)載體pgmp002。bamhi限制性位點(diǎn)位于vl結(jié)構(gòu)域與vh結(jié)構(gòu)域的dna序列之間。在一些情況下，不從頭合成編碼scfv的dna，而通過(guò)結(jié)構(gòu)域改組來(lái)克隆表達(dá)scfv的構(gòu)建體。因此，切取vl結(jié)構(gòu)域并且通過(guò)ncoi和bamhi限制性位點(diǎn)將其引入新構(gòu)建體，通過(guò)bamhi和hindiii限制性位點(diǎn)將vh結(jié)構(gòu)域引入新構(gòu)建體。在其他情況下，使用現(xiàn)有技術(shù)組裝pcr法將點(diǎn)突變引入vh和/或vl結(jié)構(gòu)域。gmp002的克隆描述于wo2008006235的實(shí)施例1中。與wo2008006235的實(shí)施例1中對(duì)于esba105的描述類似，產(chǎn)生scfv。表3描述了4個(gè)兔單克隆(ep6，ep19，ep34，ep35和ep43)和其cdr移植的變體的詳細(xì)表征數(shù)據(jù)的概述。雖然cdr移植物在biacore結(jié)合測(cè)定和l929，tnfα介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測(cè)定中展示了廣泛的活性，但4個(gè)最大("max")移植物中的3個(gè)展示了治療相關(guān)活性。ep43max在細(xì)胞毒性測(cè)定中展示了最有利的結(jié)合親和力(0.25nm的kd)和優(yōu)良的ec50。該數(shù)據(jù)顯示fw1.4(seqidno:1和2)是用于移植兔cdr的示例性可溶且穩(wěn)定的人受體構(gòu)架區(qū)。潛能測(cè)定在l929tnfα介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測(cè)定中估量抗tnfα結(jié)合劑的中和活性。用重組人tnf(htnf)誘導(dǎo)用放線菌素處理的小鼠l929成纖維細(xì)胞的毒性。在1000pg/ml的tnf濃度上檢測(cè)到90％的最大htnf誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。將所有l(wèi)929細(xì)胞培養(yǎng)在具有酚紅，具有l(wèi)-谷氨酰胺培養(yǎng)基、補(bǔ)充有胎牛血清(10％v/v)的rpmi1640中。在不含酚紅的rpmi1640和5％胎牛血清中估量抗tnfa結(jié)合劑的中和活性。在1000pg/mlhtnf存在的情況下，向l929細(xì)胞中加入不同濃度(0-374ng/ml)的抗tnf結(jié)合劑以測(cè)定拮抗作用達(dá)到半最大抑制(ec50％)時(shí)所處的濃度。用具有可變斜率的非線性s形回歸擬合劑量響應(yīng)曲線并且計(jì)算ec50。抗tnfscfv的biacore結(jié)合分析為了測(cè)量結(jié)合親和力，使用nta傳感器芯片和帶his標(biāo)簽的tnf(在esbatech產(chǎn)生的)來(lái)應(yīng)用使用biacoretm-t100的表面等離子體共振測(cè)量。nta傳感器芯片的表面由預(yù)先固定有次氮基三乙酸(nta)(其經(jīng)由ni2+nta螯合作用捕獲組氨酸標(biāo)記的分子)的羧甲基化的葡聚糖基質(zhì)組成。人tnfan-his三聚體(5nm)通過(guò)其n末端的his-標(biāo)簽被鎳捕獲，以范圍在30nm至0.014nm之間的幾個(gè)濃度(3倍系列稀釋梯度)注射esba105(分析物)。在再生步驟中，洗除由鎳、配體和分析物形成的復(fù)合物。對(duì)于不同樣品，允許使用相同的再生條件。通過(guò)表面等離子體共振(spr)技術(shù)產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)并且將其測(cè)量為共振單位(ru)。所有測(cè)量在25℃下進(jìn)行。在進(jìn)行內(nèi)聯(lián)(in-line)參照室修正，然后扣除緩沖液樣品后產(chǎn)生每一個(gè)抗tnfscfv樣品的傳感圖。使用一對(duì)一langmuir結(jié)合模型利用biacoret100評(píng)估軟件版本1.1計(jì)算表觀解離速率常數(shù)(kd)、表觀結(jié)合速率常數(shù)(ka)和表觀解離平衡常數(shù)(kd)。表3:tnfα的第二代結(jié)合劑實(shí)施例5:抗vegf兔供體抗體的cdr移植和功能性人源化選擇8個(gè)抗vegfrabmab(375，435，509，511，534，567，578和610)用于cdr移植。與使用與非人供體抗體共有最大序列同源性的人抗體受體構(gòu)架的常規(guī)人源化方法不同，將兔cdr移植入使用質(zhì)量控制測(cè)定(wo0148017)就期望的功能性質(zhì)(溶解性和穩(wěn)定性)預(yù)先選擇的人受體構(gòu)架fw1.4(seqidno:1和2)。使用本文中描述的方法(參見(jiàn)實(shí)施例4)針對(duì)每一個(gè)rabmab(兔抗體)產(chǎn)生許多cdr移植物。"min"移植物包含最小移植物，其中只將兔cdr從兔供體抗體的vl和vh結(jié)構(gòu)域移植至人受體構(gòu)架fw1.4(seqidno:1)。"max"移植物不僅包含vl和vh的兔cdr而且還包含來(lái)自兔供體的經(jīng)預(yù)測(cè)對(duì)于抗原結(jié)合非常重要的一些另外的構(gòu)架殘基。在578max的情況下，fw1.4的重鏈可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)在kabat位置23h，49h，73h，78h和94h處具有另外的氨基酸改變。表4顯示關(guān)于"min"和"max"cdr移植的變體的詳細(xì)表征數(shù)據(jù)的概述。描述了使用vegfr競(jìng)爭(zhēng)性elisa和/或huvec測(cè)定測(cè)量的它們作為vegf抑制劑的潛能。數(shù)據(jù)顯示，fw1.4(seqidno:1和2)是用于移植兔cdr的示例性可溶且穩(wěn)定的人受體構(gòu)架區(qū)?？箆egfscfv的biacore結(jié)合分析測(cè)定scfv的biacore結(jié)合能力，利用biacoretm-t100使用示例性表面等離子體共振法測(cè)量結(jié)合親和力。在本實(shí)施例和后面的實(shí)施例中，就此類scfv候選物的結(jié)合而進(jìn)行測(cè)試的vegf蛋白包括純化的大腸桿菌表達(dá)的重組人vegf165(peprotechecltd.)、重組人vegf121(peprotechecltd.)、重組人vegf110(esbatechag)、重組小鼠vegf164(peprotechecltd.)、重組大鼠vegf164(biovision)、重組兔vegf110(esbatechag)和重組人plgf(peprotechecltd.)。關(guān)于表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)，按照制造商的說(shuō)明書用鹽酸n-乙基-n'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺活化羧甲基化的葡聚糖生物傳感器芯片(cm4，gehealthcare)。使用標(biāo)準(zhǔn)胺-偶聯(lián)方法，將上文中舉例說(shuō)明的6個(gè)不同的vegf形式的每一個(gè)形式偶聯(lián)至cm4傳感器芯片上的4個(gè)不同的流動(dòng)池之一。在偶聯(lián)和封閉后，使用這些固定的vegf分子獲得的響應(yīng)的范圍是大約250-500響應(yīng)單位(ru)(對(duì)于hvegf165)、大約200ru(對(duì)于hvegf110、hvegf121、鼠vegf164、大鼠vegf164和兔vegf110)和大約400ru(對(duì)于plgf)。除了在封閉之前不固定蛋白質(zhì)外，類似地處理各芯片的第4流動(dòng)池，并且將該流動(dòng)池用作內(nèi)聯(lián)參照。將不同濃度的在hbs-ep緩沖液(0.01mhepes，ph7.4，0.15mnacl，3mmedta，0.005％表面活性劑p20)中的抗vegfscfv(例如90nm，30nm，10nm，3.33nm，1.11nm，0.37nm，0.12nm和0.04nm)以30μl/分鐘的流速注射入流動(dòng)池，進(jìn)行5分鐘。讓抗vegfscfv與cm4芯片上的vegf在25℃下解離10分鐘。在進(jìn)行內(nèi)聯(lián)參照池修正，然后扣除緩沖液樣品后，產(chǎn)生各抗vegfscfv樣品的傳感圖。使用一對(duì)一langmuir結(jié)合模型(one-to-onelangmuirbindingmodel)利用biacoret100評(píng)估軟件版本1.1計(jì)算表觀解離速率常數(shù)(kd)、表觀結(jié)合速率常數(shù)(ka)和表觀解離平衡常數(shù)(kd)。vegf抑制的huvec測(cè)定huvec測(cè)定是測(cè)量公開(kāi)的抗vegfscfv候選物作為vegf抑制劑的潛能的方法。使用從幾個(gè)供體匯集的第2代至第14代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)(promocell)。將細(xì)胞以1000個(gè)細(xì)胞/孔接種于50μl完全內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(ecgm)(promocell)，該培養(yǎng)基含有0.4％ecgs/h，2％胎牛血清，0.1ng/ml表皮生長(zhǎng)因子，1μg/ml氫化可的松，1ng/ml堿性成纖維細(xì)胞因子和1％青霉素/鏈霉素(gibco)。7至8小時(shí)后，向細(xì)胞中加入50μl饑餓培養(yǎng)基(不含含有0.5％熱滅活的fcs和1％青霉素/鏈霉素的補(bǔ)充物的ecgm)，將細(xì)胞饑餓15至16小時(shí)。在饑餓培養(yǎng)基中制備抗vegfscfv的3倍系列稀釋物(0.023-150nm)和下列之一：重組人vegf165(0.08nm)、重組小鼠vegf164(0.08nm)或重組大鼠vegf164(0.3nm)，并且在室溫下預(yù)溫育30-60分鐘。不同濃度的vegf用于補(bǔ)償它們的不同的相對(duì)生物學(xué)活性。使用刺激次最大vegf誘導(dǎo)的增殖的濃度(ec90)。向含有huvec懸浮液的96孔組織培養(yǎng)板中加入100μl混合物，并于37℃/5％co2潮濕的培養(yǎng)箱中溫育4天。在加入20μl/孔的wst-1細(xì)胞增殖試劑(roche)后，使用sunrise酶標(biāo)儀(tecan)通過(guò)測(cè)量450nm處的吸光度(620nm用作參照波長(zhǎng))來(lái)估量huvec的增殖。使用4參數(shù)邏輯曲線擬合來(lái)分析數(shù)據(jù)，根據(jù)抑制曲線推算出抑制50％的huvec增殖所需的抗vegfscfv的濃度(ec50)。表4等同物根據(jù)前述說(shuō)明，本發(fā)明的許多變化和備選實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的。因此，本說(shuō)明書被解釋為僅示例性的并且是用于教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員的用于進(jìn)行本發(fā)明的最佳模式。結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)可顯著改變而不背離本發(fā)明的精神，并且保留落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)的所有變化的排他性使用。本發(fā)明意欲只限定至所附權(quán)利要求和適用的法律法規(guī)要求的程度。本說(shuō)明書中引用的所有文獻(xiàn)和類似材料包括專利、專利申請(qǐng)、文章、書籍、論文、學(xué)術(shù)論文、網(wǎng)頁(yè)、圖和/或附件，無(wú)論此類文獻(xiàn)和類似材料的形式如何，都以其全文通過(guò)引用明確地合并入本文。如果一個(gè)或多個(gè)合并的文獻(xiàn)和類似材料與本申請(qǐng)不同或相矛盾，包括定義的術(shù)語(yǔ)、術(shù)語(yǔ)的用法、描述的技術(shù)等，那么以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。序列表<110>esbatechag<120>使用通用抗體構(gòu)架進(jìn)行的兔抗體的人源化<130>rabbitization<160>25<170>patentinversion3.5<210>1<211>232<212>prt<213>人工序列<220><223>fw1.4的可變重鏈構(gòu)架(a43)<220><221>cdr<222>(26)..(75)<223>cdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(90)..(139)<223>cdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(172)..(221)<223>cdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<400>1gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa202530xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa354045xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa505560xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaatrpvalargglnala65707580proglylysglyleuglutrpvalserxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa859095xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa100105110xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa115120125xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaargphethrileser130135140argaspasnserlysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuarg145150155160alagluaspthralavaltyrtyrcysalalysxaaxaaxaaxaaxaa165170175xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa180185190xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa195200205xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaatrpglygln210215220glythrleuvalthrvalserser225230<210>2<211>231<212>prt<213>人工序列<220><223>fw1.4的可變輕鏈構(gòu)架(ki27)<220><221>cdr<222>(24)..(73)<223>cdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(89)..(138)<223>cdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(171)..(220)<223>cdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<400>2gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilethrcysxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa202530xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa354045xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa505560xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaatrptyrglnglnlysprogly65707580lysalaprolysleuleuiletyrxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa859095xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa100105110xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa115120125xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaglyvalproserargphe130135140serglyserglyserglyalagluphethrleuthrileserserleu145150155160glnproaspaspphealathrtyrtyrcysxaaxaaxaaxaaxaaxaa165170175xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa180185190xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa195200205xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaapheglyglngly210215220thrlysleuthrvalleugly225230<210>3<211>483<212>prt<213>人工序列<220><223>fw1.4的構(gòu)架<220><221>cdr<222>(24)..(73)<223>lcdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(89)..(138)<223>lcdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(171)..(220)<223>lcdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(277)..(326)<223>hcdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(341)..(390)<223>hcdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(423)..(472)<223>hcdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<400>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<210>4<211>232<212>prt<213>人工序列<220><223>rfw1.4的可變重鏈構(gòu)架<220><221>cdr<222>(26)..(75)<223>cdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(90)..(139)<223>cdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(172)..(221)<223>cdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<400>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<210>5<211>483<212>prt<213>人工序列<220><223>rfw1.4的構(gòu)架<220><221>cdr<222>(24)..(73)<223>lcdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(89)..(138)<223>lcdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(171)..(220)<223>lcdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(277)..(326)<223>hcdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(341)..(390)<223>lcdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(423)..(472)<223>hcdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<400>5gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilethrcysxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa202530xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa354045xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa505560xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaatrptyrglnglnlysprogly65707580lysalaprolysleuleuiletyrxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa859095xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa100105110xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa115120125xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaglyvalproserargphe130135140serglyserglyserglythrgluphethrleuthrileserserleu145150155160glnproaspaspphealathrtyrtyrcysxaaxaaxaaxaaxaaxaa165170175xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa180185190xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa195200205xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaapheglyglngly210215220thrlysleuthrvalleuglyglyglyglyglyserglyglyglygly225230235240serglyglyglyglyserglyglyglyglysergluvalglnleuval245250255gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser260265270cysthralaserxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa275280285xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa290295300xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa305310315320xaaxaaxaaxaaxaaxaatrpvalargglnalaproglylysglyleu325330335glutrpvalglyxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa340345350xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa355360365xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa370375380xaaxaaxaaxaaxaaxaaargphethrileserargaspthrserlys385390395400asnthrvaltyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthrala405410415valtyrtyrcysalaargxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa420425430xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa435440445xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa450455460xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaatrpglyglnglythrleuvalthr465470475480valserser<210>6<211>232<212>prt<213>人工序列<220><223>rfw1.4(v2)的可變重鏈構(gòu)架<220><221>cdr<222>(26)..(75)<223>cdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(90)..(139)<223>cdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(172)..(221)<223>cdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<400>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<210>7<211>483<212>prt<213>人工序列<220><223>rfw1.4(v2)的構(gòu)架<220><221>cdr<222>(24)..(73)<223>lcdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(89)..(138)<223>lcdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(171)..(220)<223>lcdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(277)..(326)<223>hcdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(341)..(390)<223>hcdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(423)..(472)<223>hcdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<400>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<210>8<211>20<212>prt<213>人工序列<220><223>接頭<400>8glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly151015glyglyglyser20<210>9<211>231<212>prt<213>人工序列<220><223>fw1.4的經(jīng)置換的可變輕鏈構(gòu)架<220><221>cdr<222>(24)..(73)<223>cdr1;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(89)..(138)<223>cdr2;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<220><221>cdr<222>(171)..(220)<223>cdr3;可存在或不存在至少3個(gè)和直至50個(gè)氨基酸；xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸<400>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<210>10<211>122<212>prt<213>人工序列<220><223>vh43_fw1.4_mod<400>10gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthrvalserglypheserleusersergly202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045glyvalileileserserglyalathrtyrtyralasertrpalalys505560glyargphethrileserlysaspthrserlysasnthrvaltyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095argglyglyproaspaspserasnsermetglythrpheaspprotrp100105110glyglnglythrleuvalthrvalserser115120<210>11<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>vl43_fw1.4_mod<400>11gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilelyscysglnalaserglnserileserasptrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrglyalaserargleualaserglypheproserargphesergly505560serglyserglyalagluphethrleuthrileserglyleuglupro65707580alaaspphealathrtyrtyrcysglnglnglytrpseraspsertyr859095valaspasnleupheglyglnglythrlysleuthrvalleugly100105110<210>12<211>119<212>prt<213>人工序列<220><223>vh511_fw1.4_mod<400>12gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthrvalserglypheserleuasnthrtyr202530tyrmetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045glyileilealaproaspaspthrthrtyrtyralasertrpalalys505560serargserthrileserargaspthrserlysasnthrvaltyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095argserglyaspthrthralatrpglyalaaspiletrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserser115<210>13<211>112<212>prt<213>人工序列<220><223>vl511_fw1.4_mod<400>13gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilethrcysglnalaserglnserileasniletrp202530leusertrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrargalaserthrleualaserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro65707580aspaspphealathrtyrtyrcysglnalaasntyralatyrserala859095glytyrglyalaalapheglyglnglythrlysleuthrvalleugly100105110<210>14<211>120<212>prt<213>人工序列<220><223>vh578_fw1.4_mod<400>14gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthralaserglypheserleuthrasptyr202530tyrtyrmetthrtrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrp354045valglypheileaspproaspaspaspprotyrtyralathrtrpala505560lysglyargphethrileserargaspthrserlysasnthrvaltyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaglyglyasphisasnserglytrpglyleuaspiletrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserser115120<210>15<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>vl578_fw1.4_mod<400>15gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilethrcysglnalasergluileilehissertrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrleualaserthrleualaserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrglnphethrleuthrileserserleuglnpro65707580aspaspphealathrtyrtyrcysglnasnvaltyrleualaserthr859095asnglyalaasnpheglyglnglythrlysleuthrvalleugly100105110<210>16<211>119<212>prt<213>人工序列<220><223>vh534_fw1.4_mod<400>16gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthralaserglypheserleusertyrtyr202530tyrmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045glyileileglyproglyasptyrthrasptyralasertrpalalys505560glyargphethrileserlysaspthrserlysasnthrvaltyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095argglyaspaspasnserglytrpglygluaspiletrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserser115<210>17<211>110<212>prt<213>人工序列<220><223>vl534_fw1.4_mod<400>17gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilethrcysglnalaserglnserileasntrpleu202530sertrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuiletyr354045lysgluserthrleualaserglyvalproserargpheserglyser505560glyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnproasp65707580aspphealathrtyrtyrcysglnasnasntyraspserglyasnasn859095glyphepropheglyglnglythrlysleuthrvalleugly100105110<210>18<211>119<212>prt<213>人工序列<220><223>vh509_fw1.4_mod<400>18gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthralaserglypheserleusersertyr202530tyrmetcystrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045glycysleuasptyrvalglyaspthrasptyralasertrpalalys505560glyargphethrileserlysaspalaserlysasnthrvaltyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095argthraspaspserargglytrpglyleuasniletrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserser115<210>19<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>vl509_fw1.4_mod<400>19gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilethrcysglnalaserglnasnileargiletrp202530leusertrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrlysalaserthrleugluserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro65707580aspaspphealathrtyrtyrcysglnasnasnalahistyrserthr859095asnglyglythrpheglyglnglythrlysleuthrvalleugly100105110<210>20<211>120<212>prt<213>人工序列<220><223>vh578rfw1.4<400>20gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthralaserglypheserleuthrasptyr202530tyrtyrmetthrtrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrp354045valglypheileaspproaspaspaspprotyrtyralathrtrpala505560lysglyargphethrileserargaspthrserlysasnthrvaltyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglyasphisasnserglytrpglyleuaspiletrpglygln100105110glythrleuvalthrvalserser115120<210>21<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>vl578rfw1.4<400>21gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilethrcysglnalasergluileilehissertrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrleualaserthrleualaserglyvalproserargphesergly505560serglyserglyalagluphethrleuthrileserserleuglnpro65707580aspaspphealathrtyrtyrcysglnasnvaltyrleualaserthr859095asnglyalaasnpheglyglnglythrlysleuthrvalleugly100105110<210>22<211>119<212>prt<213>人工序列<220><223>vh511rfw1.4<400>22gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthralaserglypheserleuasnthrtyr202530tyrmetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045glyileilealaproaspaspthrthrtyrtyralasertrpalalys505560serargphethrileserargaspthrserlysasnthrvaltyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095argserglyaspthrthralatrpglyalaaspiletrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserser115<210>23<211>112<212>prt<213>人工序列<220><223>vl511rfw1.4<400>23gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilethrcysglnalaserglnserileasniletrp202530leusertrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrargalaserthrleualaserglyvalproserargphesergly505560serglyserglyalagluphethrleuthrileserserleuglnpro65707580aspaspphealathrtyrtyrcysglnalaasntyralatyrserala859095glytyrglyalaalapheglyglnglythrlysleuthrvalleugly100105110<210>24<211>122<212>prt<213>人工序列<220><223>vh43rfw1.4<400>24gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysthralaserglypheserleusersergly202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045glyvalileileserserglyalathrtyrtyralasertrpalalys505560glyargphethrileserargaspthrserlysasnthrvaltyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095argglyglyproaspaspserasnsermetglythrpheaspprotrp100105110glyglnglythrleuvalthrvalserser115120<210>25<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>vl43rfw1.4<400>25gluilevalmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly151015aspargvalileilethrcysglnalaserglnserileserasptrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrglyalaserargleualaserglyvalproserargphesergly505560serglyserglyalagluphethrleuthrileserserleuglnpro65707580aspaspphealathrtyrtyrcysglnglnglytrpseraspsertyr859095valaspasnleupheglyglnglythrlysleuthrvalleugly100105110當(dāng)前第1頁(yè)12