本發(fā)明涉及免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胰高血糖素卵黃抗體的制備方法。

背景技術(shù)：

胰高血糖素(升糖素)是一種由胰臟胰島α-細(xì)胞分泌的激素，是由29個(gè)氨基酸組成直鏈多肽，分子量為3485道爾頓。胰高血糖素是一種促進(jìn)分解代謝的激素，它具有很強(qiáng)的促進(jìn)糖原分解和糖異生作用，使血糖明顯升高，1mol/l的激素可使3×10⁶mol/l的葡萄糖迅速從糖原分解出來。胰高血糖素還可激活脂肪酶，促進(jìn)脂肪分解，同時(shí)又能加強(qiáng)脂肪酸氧化，使酮體生成增多。

胰高血糖素分泌過多會(huì)使血糖濃度增大，所以2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展中不僅是胰島素功能和分泌異常所致，胰高血糖素也在發(fā)揮重要作用，而且也可能是糖尿病發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立因素。胰高血糖素異常升高是導(dǎo)致2型糖尿病患者血糖偏高的重要因素，檢測胰高血糖素水平有助于臨床準(zhǔn)確判斷糖尿病患者病情。目前已知檢測胰高血糖素的方法主要是放射性免疫法(ria)，也有報(bào)道采用胰高血糖素單抗依據(jù)免疫學(xué)原理進(jìn)行檢測的方法，如專利cn105116140a。

卵黃抗體是近年來受到廣大關(guān)注的一個(gè)方向，通過免疫母雞得到免疫后的雞蛋，從雞蛋中提取抗體。單抗的制備具有不確定性，細(xì)胞的融合與亞克隆的過程中都有可能出現(xiàn)不可預(yù)料的現(xiàn)象，如果出現(xiàn)這些現(xiàn)象都要進(jìn)行重新去做。而卵黃抗體很少會(huì)出現(xiàn)這種不可控現(xiàn)象，相比單抗其操作簡單，穩(wěn)定性好，得到的產(chǎn)率較高。卵黃抗體是一種生產(chǎn)工藝較為簡單的廉價(jià)抗體，具有較強(qiáng)的耐酸耐堿耐熱能力。一般的卵黃抗體的制備方法與多克隆抗體的制備方法相同，區(qū)別在于卵黃抗體避免提取動(dòng)物血清，只需從雞蛋中獲取。然而這種一般的制備方法用來制備胰高血糖素抗體，其抗體量較少。目前，尚沒有關(guān)于制備胰高血糖素卵黃抗體的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種胰高血糖素卵黃抗體的制備方法，使得所述制備方法能夠提高卵黃抗體量，并且具備較高的效價(jià)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種胰高血糖素卵黃抗體的制備方法，包括：

步驟1、利用碳二亞胺法將胰高血糖素與牛血清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫抗原；

步驟2、將免疫抗原免疫產(chǎn)蛋雞，取雞蛋蛋黃提取抗體，獲得卵黃抗體粗提物；

步驟3、將卵黃抗體粗提物進(jìn)行純化，獲得胰高血糖素卵黃抗體純品。

針對現(xiàn)有工藝中缺少胰高血糖素卵黃抗體的制備方法的問題，本發(fā)明通過胰高血糖素與牛血清蛋白偶聯(lián)形成免疫抗原，同時(shí)優(yōu)化免疫抗原免疫、提取抗體、抗體純化等工藝步驟，獲得效價(jià)較高、抗體量較多的胰高血糖素卵黃抗體。

作為優(yōu)選，步驟1為：

稱取胰高血糖素和n-羥基琥珀酰亞胺完全溶于dmf中，再加入dcc反應(yīng)，反應(yīng)液離心后收取上清液，將上清液滴加到溶有bsa的緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，然后將所得反應(yīng)液透析，得到免疫抗原。

在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，步驟1為：

稱取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羥基琥珀酰亞胺完全溶于1ml的dmf中，再加入0.12mmol的dcc，置于4℃下反應(yīng)攪拌12小時(shí)或攪拌過夜；反應(yīng)后將反應(yīng)液10000r/min離心10min，離心后收取上清液，將上清液緩慢滴加到溶有2mmolbsa的pbs中，4℃下反應(yīng)攪拌12小時(shí)或攪拌過夜；反應(yīng)后將反應(yīng)液放入透析袋中，在4℃條件下用磷酸緩沖鹽溶液透析三天，每天換三次透析液，得到免疫抗原。

作為優(yōu)選，步驟2為：

步驟2.1、將免疫抗原免疫產(chǎn)蛋雞；

步驟2.2、取免疫雞蛋蛋黃采用peg6000三步提純法進(jìn)行粗提純，獲得卵黃抗體粗提物。

在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，步驟2為：

步驟2.1、將免疫抗原免疫產(chǎn)蛋雞；

步驟2.2、將所得的免疫雞蛋消毒清洗，雞蛋破殼，收集蛋黃并除去殘留卵白蛋白，破卵黃膜收集卵黃液，加入3倍卵黃液體積的含有3.5％peg6000的pbs，攪拌均勻后4℃下過夜；第二天離心取上清液，過濾，在濾液中加入固體peg6000至最終濃度為12％，攪拌均勻，在4℃下離心棄去上清液，收集沉淀部分，獲得卵黃抗體粗提物。

其中，步驟2.1可具體如下：

首次免疫采用弗氏完全佐劑與免疫抗原1:1乳化，在產(chǎn)蛋雞的雙翅、胸肌位置采用多點(diǎn)注射；其余四次免疫采用弗氏不完全佐劑與免疫抗原1:1乳化，共免疫五次；每次間隔15天，免疫劑量為0.5ml/只；從第二次免疫后開始收集免疫雞蛋。

作為優(yōu)選，步驟3為：

將卵黃抗體粗提物用飽和硫酸銨法純化，最后進(jìn)行透析，獲得胰高血糖素卵黃抗體純品。

在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，步驟3為：

將卵黃抗體粗提物用pbs溶解，攪拌下加入固體硫酸銨至最終濃度為50％飽和度，4℃靜置過夜；離心后，棄去上清液，收集沉淀部分以少量pbs溶解，邊攪拌邊加入固體硫酸銨至飽和度為33％，4℃靜置2h，10℃離心，收集沉淀，將沉淀溶用pbs中進(jìn)行透析，每隔12h換一次透析液，透析三天，收集透析袋中液體，真空冷凍干燥，獲得胰高血糖素卵黃抗體純品。

采用常規(guī)的卵黃抗體制備方法與本發(fā)明所述方法進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述制備方法能夠獲得較多的胰高血糖素卵黃抗體，并具備較高的效價(jià)。同時(shí)，和其他蛋白偶聯(lián)形成的免疫抗原相比，本發(fā)明胰高血糖素和牛血清蛋白偶聯(lián)形成免疫抗原更適合制備高效價(jià)、高抗體量的卵黃抗體。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過胰高血糖素與牛血清蛋白偶聯(lián)形成免疫抗原，同時(shí)優(yōu)化免疫抗原免疫、提取抗體、抗體純化等工藝步驟，獲得效價(jià)較高、抗體量較多的胰高血糖素卵黃抗體。

附圖說明

圖1所示為本發(fā)明所述的免疫抗原與bsa電泳檢測圖；其中，1為免疫抗原，2為bsa；

圖2所示為本發(fā)明制備的胰高血糖素卵黃抗體粗提物和純品的電泳圖；其中，1為粗提物，2為純品；

圖3所示為本發(fā)明制備的胰高血糖素卵黃抗體效價(jià)圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種胰高血糖素卵黃抗體的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述制備方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

以下就本發(fā)明所提供的一種胰高血糖素卵黃抗體的制備方法做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：本發(fā)明制備胰高血糖素卵黃抗體的方法

1、免疫抗原合成

稱取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羥基琥珀酰亞胺(nhs)完全溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，再加入0.12mmol的二環(huán)己基碳二亞胺(dcc),置于4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。第二天把反應(yīng)液10000r/min,10min離心,離心后收取上清液，將上清液緩慢滴加到溶有bsa(2mmol)的pbs(8ml,10mmol,ph7.4)中，4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。將所得反應(yīng)液放入透析袋中，在4℃條件下用磷酸緩沖鹽溶液透析(pbs，0.01mol/lph7.4)三天，每天換三次透析液，得到免疫抗原。

免疫抗原電泳檢測(圖1)，結(jié)果顯示，免疫抗原的電泳圖與bsa相比發(fā)生了明顯變化，說明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。

2、卵黃抗體粗提

免疫抗原免疫產(chǎn)蛋母雞(白羽雞)，首次免疫采用弗氏完全佐劑與免疫抗原1:1乳化，在產(chǎn)蛋雞的雙翅、胸肌位置采用多點(diǎn)注射；其余四次免疫采用弗氏不完全佐劑與免疫抗原1:1乳化，共免疫五次；每次間隔15天，免疫劑量為0.5ml/只；從第二次免疫后開始收集免疫雞蛋，取未免疫的雞蛋作為陰性對照，將每日收集的免疫雞蛋進(jìn)行編號，于4℃保存。

將所得的雞蛋用75％酒精消毒清洗，雞蛋破殼，收集蛋黃并在無菌定性濾紙上滾動(dòng)以除去殘留卵白蛋白，破卵黃膜收集卵黃液，測卵黃液體積，加入含有3.5％(即3.5gpeg/100mlpbs)的peg-pbs，體積為蛋黃體積的3倍，在室溫下用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?0min后，4℃下過夜。第二天10000r/min離心30min，取上清液，4層紗布過濾，測定濾出液的體積；在濾液中加入固體peg6000至最終濃度為12％(即100ml加入12gpeg6000)，室溫下磁力損拌器充分?jǐn)嚢枞芑笤贁嚢?0min，在4℃下以10000r/min離心棄去上清液，收集沉淀部分，即卵黃抗體粗提物(電泳檢測結(jié)果見圖2)。

3、卵黃抗體純化

將卵黃抗體粗提物用20-50mlpbs溶解；在磁力攪拌器攪拌下加入固體硫酸銨至最終濃度為50％飽和度，4℃靜置過夜；離心后，棄去上清液，收集沉淀部分以少量pbs溶解；邊攪拌邊加入固體硫酸銨至飽和度為33％，4℃靜置2h，10℃8000r/min離心20min，收集沉淀，將沉淀溶于5-10ml的0.01mol/l的pbs中進(jìn)行透析，每隔12h換一次透析液，透析三天，收集透析袋中液體，真空冷凍干燥，將干燥成品研磨成粉末即為胰高血糖素卵黃抗體純品，于-20℃保存。經(jīng)檢測，本發(fā)明方法每個(gè)卵黃可獲得100mg以上的igy(卵黃抗體，電泳檢測結(jié)果見圖2)。

實(shí)施例2：本發(fā)明胰高血糖素卵黃抗體的效價(jià)檢測

采用間接elisa法檢測卵黃抗體的效價(jià)

1、包被抗原的制備

稱取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羥基琥珀酰亞胺(nhs)完全溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，再加入0.12mmol的二環(huán)己基碳二亞胺(dcc),置于4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。第二天把反應(yīng)液10000r/min,10min離心,離心后收取上清液，將上清液緩慢滴加到溶有ova(2mmol)的pbs(8ml,10mmol,ph7.4)中，4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。將所得反應(yīng)液放入透析袋中，在4℃條件下用磷酸緩沖鹽溶液透析(0.01mol/lph7.4)三天，每天換三次透析液，得到包被抗原；

2、包被：將包被抗原用碳酸鹽緩沖液(cbs)稀釋至最佳包被濃度4ug/ml并充分混勻，使用移液槍以100μl/孔添加到微孔板中，置于37℃水浴鍋溫浴1小時(shí)后，再放置于4℃冰箱中包被過夜；

3、清洗：將孔中的液體甩干，用pbst洗滌液清洗3次，再將孔中剩余的液體在吸水紙上拍干；

5、封閉：用含濃度為30mg/ml的脫脂奶粉磷酸緩沖鹽溶液，270μl/孔加入到微孔板中，37℃溫浴1小時(shí)，重復(fù)步驟3；

6、競爭反應(yīng)：將實(shí)施例1最后所得的胰高血糖素卵黃抗體用磷酸緩沖鹽溶液，按體積倍比稀釋成1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000的溶液，以100μl/孔加入到微孔板中，同時(shí)增加空白對照，37℃溫浴1小時(shí)，重復(fù)步驟3；

7、加酶標(biāo)二抗：加入用磷酸緩沖鹽溶液稀釋5000倍數(shù)的酶標(biāo)二抗，按照100μl/孔添加到微孔板中，放置于37℃溫浴1小時(shí)，重復(fù)步驟3；

8、顯色：在已配制的10ml底物緩沖液中，加入10μl30％過氧化氫并充分混勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)，按照100μl/孔加到微孔板中，置于37℃下避光溫育15分鐘。

9、終止和讀數(shù)：向酶標(biāo)版的微孔中加入50μl/孔的2m硫酸終止反應(yīng)。設(shè)定酶標(biāo)儀測定波長參數(shù)為450nm，并測定其光密度(od)值。陽性的判定原則：樣品孔o(hù)d值大于空白處讀數(shù)的2.1倍即可判定為陽性。

10、結(jié)果見圖3，由圖3可以看出，隨著免疫天數(shù)的增加，抗體的效價(jià)也在不斷增加，當(dāng)免疫天數(shù)為56-84天的時(shí)候抗體效價(jià)最高為1:16000。

實(shí)施例3：不同多抗體制備方法的對比

方法1：實(shí)施例1方法；

方法2：以klh偶聯(lián)胰高血糖素作為免疫抗原按照實(shí)施例1方法制備；

方法3：以bas偶聯(lián)胰高血糖素做為免疫抗原制備胰高血糖素兔多抗

方法4：以bas偶聯(lián)胰高血糖素做為免疫抗原制備鼠多抗；

表1

依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)的報(bào)道，在制備多抗時(shí)klh作為載體蛋白偶聯(lián)半抗原的免疫原性要好于bsa偶聯(lián)半抗原，但是從上表可以看出，在制備胰高血糖素多抗時(shí)，與現(xiàn)有的常識并不一致，本發(fā)明方法所產(chǎn)生的抗體量是多于方法2的，效價(jià)一致。

同時(shí)，與兔多抗和鼠多抗相比，雖然在效價(jià)上不如，但是在抗體量上，每一個(gè)雞蛋的抗體量都遠(yuǎn)大于每只兔子和小鼠的抗體量，而免疫產(chǎn)蛋母雞一次可產(chǎn)多枚蛋，總體的抗體量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通方法的鼠多抗或兔多抗。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。