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一種二肽基肽酶?4抑制肽及其制備方法與其應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):12776944閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種二肽基肽酶-4的抑制肽,其特征在于,該抑制肽具有下述的氨基酸序列:Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly-Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp。

2.權(quán)利要求1所述的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)雜色蛤酶解物的制備:

將雜色蛤軟體洗凈泥沙,加水煎煮,分離煎煮液與肉渣,瀝干;取肉渣,加3至8倍量水勻漿后,加入生物酶酶解,酶解結(jié)束后,于沸水浴滅活,然后加入無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉,靜置,再離心取上清液,濃縮,冷凍干燥,得到凍干粉;

(2)離子交換色譜純化:

取步驟(1)酶解得到的凍干粉,用去離子水溶解后,經(jīng)離子交換色譜分離,流動(dòng)相:A相為水,B相為0.8mol/L的氯化鈉溶液,梯度洗脫,流速:2mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):220nm;經(jīng)過離子交換色譜分離得到不同組分的酶解物,分別測(cè)定各組分對(duì)二肽基肽酶-4的抑制活性,取活性最好的部分,冷凍干燥,得凍干粉;

(3)反向色譜分離純化:

取步驟(2)分離后的凍干粉以甲醇溶解,經(jīng)過反相高效液相色譜分離,流動(dòng)相:A相為體積濃度0.1%甲酸;B相為甲醇,梯度洗脫;流速:10mL/min;柱溫:30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm,分離收集得到二肽基肽酶-4的抑制肽,該抑制肽氨基酸序列為Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly-Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法,其特征在于,步驟(1)所述的生物酶為中性蛋白酶,所述中性蛋白酶活性為10000至50000U/g。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法,其特征在于,步驟(1)生物酶的加入重量為肉渣重量的0.01%-2.0%,酶解的溫度為37至50℃,酶解的pH為7至9,酶解反應(yīng)時(shí)間為2至6h。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法,其特征在于,步驟(1)生物酶的加入重量為肉渣重量的0.1~1%,酶解的溫度為40~60℃,酶解的pH為6~9,酶解反應(yīng)時(shí)間為1~5h。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法,其特征在于,步驟(1)生物酶的加入重量為肉渣重量的2%,酶解的溫度為45℃,酶解的pH為7.5,酶解反應(yīng)時(shí)間為4h。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法,其特征在于,步驟(2)梯度洗脫條件為:0~40min內(nèi)0.8mol/L氯化鈉溶液體積比為0%,40~140min內(nèi)0.8mol/L氯化鈉溶液體積比為0%~100%。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法,其特征在于,步驟(3)梯度洗脫程序?yàn)椋?~10min,B相甲醇比例由2%至10%,10~20min,B相甲醇比例由20%至40%,20~25min B相甲醇體積由40%至100%。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法,其特征在于,步驟(1)將雜色蛤軟體洗凈泥沙,加入3至8倍重量的水煎煮1至3次,每次30分鐘至120分鐘,分離煎煮液與肉渣,瀝干。

10.權(quán)利要求1所述的二肽基肽酶-4抑制肽在制備防治糖尿病藥物中的應(yīng)用。

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