發(fā)明背景

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化的領(lǐng)域。特別是本發(fā)明涉及通過在預(yù)過濾工藝中組合使用內(nèi)毒素去除和陽離子交換基質(zhì)，增加病毒濾器的過濾容量的方法。

相關(guān)技術(shù)的描述

由于能夠進(jìn)行正確的蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾(例如糖基化(Chu和Robinson Current Opinion in Biotechnology 12:180–187,2001))的能力，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系已成為重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)的主要選擇。然而，也已知這些細(xì)胞系含有逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒(Lieber等人，Science 182:56–59,1973；Lubiniecki等人，Dev Biol Stand 70:187–191,1989)，并存在潛在的外來病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)(Garnick,Dev Biol Stand.Basel:Karger 93:21–29,1998)。雖然生物制藥產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)藥物具有良好的安全性記錄，但是也有由血液和源自血漿的血液產(chǎn)品造成的病毒感染發(fā)生(Brown,Dev.Biol.Stand.81,1993；Thomas,Lancet 343:1583-1584,1994)。為了減少在重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)，設(shè)計(jì)下游的純化工藝包括去除內(nèi)源性和外來病毒的加工步驟。通過若干提供從原料流(process feed stream)中失活病毒或去除病毒的加工步驟的組合，獲得充分的病毒清除。使用例如在低pH下孵育、熱和去垢劑處理的技術(shù)實(shí)現(xiàn)病毒失活，同時(shí)通常使用層析和過濾實(shí)施病毒去除(Curtis等人，Biotechnology and Bioengineering 84(2):179–186,2003)。

與基于物理化學(xué)性質(zhì)(例如凈電荷)去除病毒的層析基質(zhì)不同，病毒過濾通過尺寸排阻去除病毒，因此被認(rèn)為是更強(qiáng)效的技術(shù)。迄今為止，在源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的生物治療劑的下游純化過程中使用病毒過濾限于去除逆轉(zhuǎn)錄病毒(80-100nm直徑)，這是因?yàn)槿鄙贅?biāo)稱孔徑小于60nm的高通量膜的結(jié)果。

近期在膜技術(shù)中的進(jìn)步使得能夠生產(chǎn)標(biāo)稱孔徑20nm的高通量膜。這些病毒濾器滯留細(xì)小病毒(18-26nm直徑)，允許通過大至160kD的蛋白質(zhì)(～8nm)，例如單克隆抗體(mAb)。

高選擇性和高通量的細(xì)小病毒濾器是通過在微孔底物上覆蓋一層薄的滯留膜層獲得的。該薄的滯留層允許非常精細(xì)的分離蛋白質(zhì)和病毒，但也易于被加工原料流中的雜質(zhì)結(jié)垢，導(dǎo)致較低的過濾容量和流動(dòng)。病毒濾器結(jié)垢歸因于污染物，例如蛋白質(zhì)聚集體和變性的蛋白質(zhì)。Bohonak和Zydney(Bohonak and Zydney,Journal of Membrane Science 254(1-2):71-79,2005)展示了濾器容量的喪失可能是由于濾餅形成或孔阻塞。其他近期的報(bào)道(Bolton等人，Biotechnol.Appl.Biochem.43:55-63,2006；Levy等人，F(xiàn)iltration in the Biopharamaceutical Industry.(Meltzer,T.H.和Jornitz,M.W.編著)第619-646頁(yè)，Marcel Dekker,New York,1998)將濾器結(jié)垢的可能原因歸因于孔壁對(duì)雜質(zhì)的吸附。一些出版物(Bolton等人，Biotechnology and Applied Biochemistry 42:133-142,2005；Hirasaki等人，Polymer Journal 26(11):1244-1256,1994；Omar和Kempf,Transfusion 42(8):1005-1010,2002)也證實(shí)過濾容量的降低或孔的堵塞可以使病毒滯留減少若干數(shù)量級(jí)，影響單位操作的耐用性(robustness)。

因而，大量的近期研究關(guān)注了鑒別預(yù)濾器(pre-filter)，所述預(yù)濾器用于從加工原料流中去除污垢以最小化病毒濾器的污垢和保證高容量、高通量和耐用的病毒滯留。Bolton等人(Bolton等人，2006)實(shí)施了充分的研究，涉及測(cè)試若干種膜作為預(yù)濾器，并證實(shí)使用Viresolve^TM深度濾膜作為預(yù)濾器，能夠使正常流量的細(xì)小病毒(NFP)膜的容量增加幾乎一個(gè)數(shù)量級(jí)。Brown等人(Brown等人，2008,Use of Charged Membranes to Identify Soluble Protein Foulants in order to Facilitate Parvovirus Filtration.IBC's 20^th Antibody Development and Production,San Diego,CA)評(píng)估了強(qiáng)陽離子交換膜吸附劑作為細(xì)小病毒滯留過濾器的預(yù)濾器，并展示了可以使11種不同的mAb流的病毒過濾容量增加若干倍。作者假設(shè)陽離子交換膜吸附劑通過競(jìng)爭(zhēng)性吸附，從原料流中去除了大分子量(～600-1500kD)的蛋白質(zhì)聚集物，阻止病毒濾器堵塞。美國(guó)專利號(hào)7,118,675(Siwak等人)描述了這樣的工藝，所述工藝?yán)秒姾尚揎椀哪牡鞍踪|(zhì)溶液中去除蛋白質(zhì)聚集物，防止病毒濾器結(jié)垢。

發(fā)明概述

本發(fā)明是基于，至少部分地基于這樣的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即細(xì)小病毒濾器的結(jié)垢可以是由除文獻(xiàn)提及以外的雜質(zhì)導(dǎo)致的，需要更綜合的預(yù)過濾溶液來改善病毒過濾容量。因此，本發(fā)明提供了新的預(yù)過濾溶液，其性能顯著優(yōu)于文獻(xiàn)中提及的最佳預(yù)過濾方法(陽離子交換膜吸附劑)。

在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在蛋白質(zhì)純化過程中改善病毒濾器過濾容量的方法，包括在通過所述病毒濾器前，以任意順序?qū)Π兓牡鞍踪|(zhì)的組合物進(jìn)行陽離子交換步驟和內(nèi)毒素去除步驟。

在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒濾器的孔徑在約15和約100nm直徑之間。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒濾器的孔徑在約15和約30nm直徑之間。

在仍然另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒濾器的孔徑是約20nm。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，待去除的病毒是細(xì)小病毒。

在仍然進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)小病毒的直徑在約18和約26nm之間。

在不同的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是抗體或抗體片段，例如通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的抗體，或其片段。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是治療性抗體。

在仍然另一個(gè)實(shí)施方案中，重組抗體或抗體片段是在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的，例如，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，待純化的包含蛋白質(zhì)的組合物在病毒過濾前，首先進(jìn)行陽離子交換步驟，再進(jìn)行內(nèi)毒素去除步驟。

在仍然進(jìn)一步的實(shí)施方案中，包含待純化的蛋白質(zhì)的組合物在病毒過濾前，首先進(jìn)行內(nèi)毒素去除步驟，再進(jìn)行陽離子交換步驟。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含待純化的蛋白質(zhì)的組合物在病毒過濾前，同時(shí)進(jìn)行陽離子交換步驟和內(nèi)毒素去除步驟，將兩種介質(zhì)共同保持在單個(gè)模塊中。

在仍然另一個(gè)實(shí)施方案中，在內(nèi)毒素去除步驟后直接進(jìn)行病毒過濾。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在陽離子交換步驟后直接進(jìn)行病毒過濾。

在不同的實(shí)施方案中，在約4和約10之間的pH下實(shí)施病毒過濾。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，在待純化的組合物中的蛋白質(zhì)濃度是約1-40g/L。

在仍然另一個(gè)實(shí)施方案中，待純化的抗體是針對(duì)選自HER1(EGFR)、HER2、HER3、HER4、VEGF、CD20、CD22、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4、VCAM、IL-17A和/或F、IgE、DR5、CD40、Apo2L/TRAIL、EGFL7、NRP1、促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和因子D的一種或多種抗原的。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體選自抗雌激素受體抗體、抗孕酮受體抗體、抗p53抗體、抗組織蛋白酶D抗體、抗Bcl-2抗體、抗E-鈣黏著蛋白抗體、抗CA125抗體、抗CA15-3抗體、抗CA19-9抗體、抗c-erbB-2抗體、抗P-糖蛋白抗體、抗CEA抗體、抗成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白抗體、抗ras癌基因蛋白質(zhì)抗體、抗Lewis X抗體、抗Ki-67抗體、抗PCNA抗體、抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD5抗體、抗CD7抗體、抗CD8抗體、抗CD9/p24抗體、抗CD10抗體、抗CD11c抗體、抗CD13抗體、抗CD14抗體、抗CD15抗體、抗CD19抗體、抗CD23抗體、抗CD30抗體、抗CD31抗體、抗CD33抗體、抗CD34抗體、抗CD35抗體、抗CD38抗體、抗CD41抗體、抗LCA/CD45抗體、抗CD45RO抗體、抗CD45RA抗體、抗CD39抗體、抗CD100抗體、抗CD95/Fas抗體、抗CD99抗體、抗CD106抗體、抗泛素抗體、抗CD71抗體、抗c-myc抗體、抗細(xì)胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、抗HPV蛋白抗體、抗κ輕鏈抗體、抗λ輕鏈抗體、抗黑素體抗體、抗前列腺特異性抗原抗體、抗S-100抗體、抗tau抗原抗體、抗纖維蛋白抗體、抗角蛋白抗體和抗Tn-抗原抗體。

附圖簡(jiǎn)介

圖1：用于病毒過濾研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)置的示意圖。

圖2：無菌和深度濾膜對(duì)Viresolve Pro細(xì)小病毒滯留濾器的容量的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)是在pH 5.5和8.5mS/cm電導(dǎo)下實(shí)施的。mAb濃度是約13g/L。

圖3(a)和(b)：陽離子交換和內(nèi)毒素去除膜吸附劑作為預(yù)濾器，對(duì)Viresolve Pro細(xì)小病毒濾器的容量的效應(yīng)。3(a)和3(b)中的數(shù)據(jù)是用mAb1分別在pH 5.0和6.5下產(chǎn)生的。

圖4(a)和(b)：同時(shí)包含陽離子交換和內(nèi)毒素去除膜吸附劑的新型預(yù)過濾鏈，對(duì)Viresolve Pro細(xì)小病毒滯留濾器的容量的效應(yīng)。4(a)和4(b)中的數(shù)據(jù)分別是在pH 5.0和6.5下用MAb1產(chǎn)生的。

圖5：同時(shí)包含陽離子交換和內(nèi)毒素去除膜吸附劑的新型預(yù)過濾鏈與陽離子交換預(yù)過濾基質(zhì)相比較，對(duì)使用MAb2的細(xì)小病毒滯留濾器的容量的效應(yīng)。

優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述

I.定義

“蛋白質(zhì)”意指鏈長(zhǎng)度足以產(chǎn)生更高水平的三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。因而，蛋白質(zhì)區(qū)別于“肽”，肽也是基于氨基酸的分子，但不具有所述結(jié)構(gòu)。典型的，本文中使用的蛋白質(zhì)具有至少約15-20kD，優(yōu)選至少約20kD的分子量。

涵蓋在本文定義中的蛋白質(zhì)的實(shí)例包含哺乳動(dòng)物蛋白，例如CD4、整聯(lián)蛋白及其亞基、例如beta7、生長(zhǎng)激素，包含人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；卵泡刺激素；降鈣素；促黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC、因子IX、組織因子和血管性假性血友病因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子例如蛋白C；心鈉素；肺表面活性劑；血纖維蛋白溶酶原激活劑，例如尿激酶或組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA，例如)；bombazine；凝血酶；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)正常激活的T細(xì)胞表達(dá)和分泌)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；米勒管抑制物質(zhì)(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；DNA酶；抑制素；激動(dòng)素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；IgE、激素或生長(zhǎng)因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如骨來源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神經(jīng)生長(zhǎng)因子，例如NGF-β；血小板來源的生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，例如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包含TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；其他的CD蛋白，例如CD3、CD8、CD19和CD20；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，例如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子(DAF)；病毒抗原，例如AIDS衣殼的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素(addressin)；調(diào)控蛋白；整聯(lián)蛋白，例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原，例如HER1(EGFR)、HER2、HER3或HER4受體；Apo2L/TRAIL；以及任何上述列舉的多肽的片段；以及與其結(jié)合的免疫粘附素和抗體；和任何上述列舉的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段或變體；

如本文定義的，定義“蛋白質(zhì)”中具體包含了治療性抗體和免疫粘附素，包含但不限于一種或多種下列抗原的抗體：HER1(EGFR)、HER2、HER3、HER4、VEGF、CD20、CD22、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4、VCAM、IL-17A和/或F、IgE、DR5、CD40、Apo2L/TRAIL、EGFL7、NRP1、促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和因子D，及其片段。

其他示例性抗體包含但不限于選自抗-雌激素受體抗體、抗-孕酮受體抗體、抗-p53抗體、抗-組織蛋白酶D抗體、抗-Bcl-2抗體、抗-E-鈣黏著蛋白抗體、抗-CA125抗體、抗-CA15-3抗體、抗-CA19-9抗體、抗-c-erbB-2抗體、抗-P-糖蛋白抗體、抗-CEA抗體、抗-成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白抗體、抗-ras癌基因蛋白質(zhì)抗體、抗-Lewis X抗體、抗-Ki-67抗體、抗-PCNA抗體、抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗-CD5抗體、抗-CD7抗體、抗-CD8抗體、抗-CD9/p24抗體、抗-CD10抗體、抗-CD11c抗體、抗-CD13抗體、抗-CD14抗體、抗-CD15抗體、抗-CD19抗體、抗-CD23抗體、抗-CD30抗體、抗-CD31抗體、抗-CD33抗體、抗-CD34抗體、抗-CD35抗體、抗-CD38抗體、抗-CD41抗體、抗-LCA/CD45抗體、抗-CD45RO抗體、抗-CD45RA抗體、抗-CD39抗體、抗-CD100抗體、抗-CD95/Fas抗體、抗-CD99抗體、抗-CD106抗體、抗-泛素抗體、抗-CD71抗體、抗-c-myc抗體、抗-細(xì)胞角蛋白抗體、抗-波形蛋白抗體、抗-HPV蛋白抗體、抗-κ輕鏈抗體、抗-λ輕鏈抗體、抗-黑素體抗體、抗-前列腺特異性抗原抗體、抗-S-100抗體、抗-tau抗原抗體、抗-纖維蛋白抗體、抗-角蛋白抗體和抗-Tn-抗原抗體。

“分離的”蛋白，例如抗體，是已經(jīng)從它的天然環(huán)境的組分中鑒別、分離和/或回收的蛋白。其天然環(huán)境的污染組分是干擾蛋白質(zhì)(例如抗體)的診斷或治療用途的材料，可包含酶、激素和其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)(例如抗體)可以被純化至：(1)由Lowry方法確定的，達(dá)到按重量計(jì)大于95％，最優(yōu)選按重量計(jì)大于99％，(2)使用離心杯式測(cè)序儀，達(dá)到足以獲得N端或中間的氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度；或者(3)在使用考馬斯亮藍(lán)或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下，達(dá)到SDS-PAGE均質(zhì)。

蛋白質(zhì)優(yōu)選是基本純的，理想的是基本均質(zhì)的(即，不含污染性蛋白質(zhì))?！盎炯兊摹钡鞍踪|(zhì)意指基于組合的總重量，包含按重量計(jì)至少約90％的蛋白質(zhì)的組合物，優(yōu)選包含按重量計(jì)至少約95％的蛋白質(zhì)。

“基本均質(zhì)的”蛋白質(zhì)意指基于組合物的總重量，包含按重量計(jì)至少約99％的蛋白質(zhì)的組合物。

術(shù)語“抗體”以最廣的含義使用，具體覆蓋了單克隆抗體(包含具有免疫球蛋白Fc區(qū)的全長(zhǎng)抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物、雙特異性抗體、雙抗體和單鏈分子，以及抗體片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab’)₂和Fv)。

基礎(chǔ)的4條鏈的抗體單位是異四聚體糖蛋白，包含兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)。IgM抗體由5個(gè)這種基礎(chǔ)的異四聚體單位以及稱為J鏈的額外多肽組成，含有10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而IgA抗體包含2-5個(gè)這種基礎(chǔ)的4條鏈單位，可以與J鏈組合而聚合形成多價(jià)的組合體(assemblage)。在IgG的情況下，4條鏈單位一般約150,000道爾頓。每條L鏈都通過一個(gè)共價(jià)的二硫鍵與H鏈連接，而兩條H鏈則通過一個(gè)或多個(gè)二硫鍵彼此連接，二硫鍵數(shù)取決于H鏈同種型。每條H和L鏈也具有規(guī)律安排的鏈內(nèi)二硫鍵。每條H鏈的N端都具有可變結(jié)構(gòu)域(V_H)，對(duì)于α和γ鏈的情況，每條在可變結(jié)構(gòu)域之后接3個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(C_H)，而對(duì)于μ和ε同種型的情況，在可變結(jié)構(gòu)域之后具有四個(gè)C_H結(jié)構(gòu)域。每條L鏈的N端都具有可變結(jié)構(gòu)域(V_L)，可變結(jié)構(gòu)域的另一端后接恒定結(jié)構(gòu)域。V_L與V_H配對(duì)，C_L與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(C_H1)配對(duì)。特定的氨基酸殘基被認(rèn)為形成輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的交界。成對(duì)的V_H和V_L共同形成單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于不同類型抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties,Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(編著)，Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994，第71頁(yè)和第6章。

基于恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，任何脊椎動(dòng)物物種的L鏈都可歸屬于兩個(gè)明確區(qū)別的類型之一，稱為κ和λ?；谄渲劓満愣ńY(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(C_H)，可以將免疫球蛋白分為不同的類別或亞類。有五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分別具有稱為α、δ、ε、γ和μ的重鏈。基于C_H序列和功能上相對(duì)細(xì)微的差異，γ和μ類進(jìn)一步分為亞類，例如，人表達(dá)下列亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

術(shù)語“可變”指這樣的事實(shí)，即抗體之間的可變結(jié)構(gòu)域的某些片段序列廣泛不同。V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合，定義特定抗體與其特定抗原的特異性。然而，變化并非均勻的分布在可變結(jié)構(gòu)域的整個(gè)區(qū)間。相反，V區(qū)由被分隔的約15-30個(gè)氨基酸殘基的稱為框架區(qū)(FR)的相對(duì)不變區(qū)段(stretches)組成，所述框架區(qū)被長(zhǎng)度分別為約9-12個(gè)氨基酸殘基的稱為“超變區(qū)”或者有時(shí)稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)的高度變化的較短區(qū)域分隔。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各包含4個(gè)FR，大部分采用β片層構(gòu)象，由3個(gè)超變區(qū)連接，超變區(qū)形成環(huán)狀連接，在一些情況下部分形成β片層結(jié)構(gòu)。每條鏈的超變區(qū)通過FR緊密連接在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)負(fù)責(zé)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出各種效應(yīng)子功能，例如參與抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。

當(dāng)用于本文中時(shí)，術(shù)語“超變區(qū)”(也已知為“互補(bǔ)決定區(qū)”或CDR)指抗體的在V區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸殘基(通常是3個(gè)或4個(gè)高度序列變化的短區(qū)域)，所述氨基酸殘基形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且是抗原特異性的主要決定因素。有至少兩種方法鑒別CDR殘基：(1)基于交叉物種序列變異性的方法(即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,MS 1991))；和(2)基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究的方法(Chothia,C.等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。然而，如果兩種殘基鑒別技術(shù)定義重疊而非相同的區(qū)域，則可以組合其以定義混合的(hybrid)CDR。

術(shù)語“單克隆抗體”在本文中指從基本均質(zhì)的抗體群體中獲得的抗體，即，群體包含的各個(gè)抗體是相同，除了可能以極小量存在的潛在天然發(fā)生的突變。單克隆抗體是高度特異的，針對(duì)單一的抗原位點(diǎn)。此外，與常規(guī)(多克隆)抗體制品相反，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇，所述常規(guī)(多克隆)抗體制品典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體。除特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)還在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)物合成的，不被其他免疫球蛋白污染。定語“單克隆”表示抗體的特征是從基本均質(zhì)的抗體群體獲得的，而不視為需要通過任何特定的方法來生產(chǎn)抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以是通過雜交瘤方法制造的，所述方法首次描述在Kohler等人，Nature,256:495(1975)中，或者可以是通過重組DNA方法制造的(參見例如美國(guó)專利號(hào)4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可以是使用例如Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技術(shù)，從噬菌體抗體文庫(kù)中分離的。

本文中的單克隆抗體具體包含“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重鏈和/或輕鏈與源自特定物種的抗體或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，同時(shí)，鏈的剩余部分與源自另一種物種的抗體或?qū)儆诹硪环N抗體類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要所述片段表現(xiàn)出理想的生物學(xué)活性(美國(guó)專利號(hào)4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。

“完整的”抗體是這樣的抗體，所述抗體包含抗原結(jié)合位點(diǎn)和CL，并至少包含重鏈結(jié)構(gòu)域C_H1、C_H2和C_H3。

“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合和/或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包含F(xiàn)ab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；雙抗體；線性抗體(參見美國(guó)專利號(hào)5,641,870，實(shí)施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。

木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，和剩余的“Fc”片段，該名稱反映了易于結(jié)晶的能力。Fab片段由完整的L鏈與H鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(V_H)和一條重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(C_H1)組成。每個(gè)Fab片段相對(duì)于抗原結(jié)合都是單價(jià)的，即，具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生單個(gè)大的F(ab')₂片段，所述F(ab')₂片段大致對(duì)應(yīng)于具有不同的抗原結(jié)合活性的兩個(gè)由二硫鍵連接的Fab片段，仍然能夠與抗原交聯(lián)。Fab'片段與Fab片段不同，在C_H1結(jié)構(gòu)域的羧基端具有若干額外的殘基，包含一個(gè)或多個(gè)來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對(duì)Fab'的命名，所述Fab'中的恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有游離的巰基。F(ab')₂抗體片段最初作為之間具有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段產(chǎn)生。還已知抗體片段的其他化學(xué)偶聯(lián)。

Fc片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩條H鏈的羧基端部分?？贵w的效應(yīng)子功能由Fc區(qū)中的序列決定，該區(qū)也被某些細(xì)胞類型上發(fā)現(xiàn)的Fc受體(FcR)識(shí)別。

“Fv”是最小抗體片段，含有完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)。該片段由緊密而非共價(jià)關(guān)聯(lián)的一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊發(fā)出6個(gè)超變環(huán)(H鏈和L鏈各3個(gè)環(huán))，提供用于抗原結(jié)合和產(chǎn)生抗體的抗原結(jié)合特異性的氨基酸殘基。然而，即使單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或者僅包含3個(gè)對(duì)抗原特異性CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，雖然比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和力低。

“單鏈Fv”也縮寫為“sFv”或“scFv”，是包含連接成單條多肽鏈的VH和VL抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選的，sFv多肽進(jìn)一步包含在V_H和V_L結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，所述接頭使sFv能夠形成用于抗原結(jié)合的理想結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述，參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore編著，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(yè)(1994)。

術(shù)語“二價(jià)體”指如下制備的小抗體片段，通過在V_H和V_L結(jié)構(gòu)域之間用短接頭(約5-10個(gè)殘基)構(gòu)建sFv片段(見上述章節(jié))，以實(shí)現(xiàn)鏈間而非鏈內(nèi)配對(duì)的V結(jié)構(gòu)域，從而獲得二價(jià)片段，即，具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異性雙抗體是兩個(gè)“交換的(crossover)”sFv片段的異二聚體，其中2個(gè)抗體的V_H和V_L結(jié)構(gòu)域是存在于不同的多肽鏈上的。雙抗體更詳細(xì)的描述在例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中。

“結(jié)合”分子靶或目標(biāo)抗原的抗體是能夠以足夠的親和力結(jié)合抗原的抗體，使所述抗體有效的靶向表達(dá)抗原的細(xì)胞。

“特異性結(jié)合”或“特異性針對(duì)”特定多肽或特定多肽上的表位的抗體是在基本不結(jié)合任何其他多肽或多肽表位的條件下，結(jié)合該特定多肽或該特定多肽上的表位的抗體。在此實(shí)施方案中，抗體與上述其他多肽或多肽表位結(jié)合的程度低于與靶多肽或表位結(jié)合的10％，根據(jù)熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所確定的。

“人源化”形式的非人(例如，小鼠)抗體是大部分是人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗體的其他抗原結(jié)合序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最少序列。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的超變區(qū)(也是CDR)的殘基被具有理想的特異性、親和力和能力的、來自非人物種(供體抗體)的超變區(qū)的殘基替代，非人物種例如是小鼠、大鼠或兔。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。此外，“人源化抗體”在本文還包含在受體抗體或供體抗體中都未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是進(jìn)一步改善和優(yōu)化抗體的性能。最佳的人源化抗體還包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，典型的是人免疫球蛋白的。關(guān)于更多細(xì)節(jié)，參見Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。

抗體的“效應(yīng)子功能”指歸因于抗體的Fc區(qū)(天然序列的Fc區(qū)或氨基酸序列變體的Fc區(qū))的那些生物學(xué)活性，并隨抗體同種型而改變?？贵w效應(yīng)子功能的實(shí)例包含：C1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體)的下調(diào)；和B細(xì)胞激活。

“抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或ADCC指一類細(xì)胞毒性，其中分泌型Ig結(jié)合到存在于某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，天然殺傷細(xì)胞(NK)、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上的Fc受體(FcR)上，使這些細(xì)胞毒性效應(yīng)子細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，之后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞?？贵w“武裝”細(xì)胞毒性細(xì)胞，并且是通過該機(jī)制殺死靶細(xì)胞所需的。介導(dǎo)ADCC的初級(jí)細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464頁(yè)的表3中概括了造血細(xì)胞上的Fc表達(dá)。為了評(píng)估目標(biāo)分子的ADCC活性，實(shí)施體外的ACDD測(cè)定，例如美國(guó)專利號(hào)5,500,362或5,821,337中描述的。此類測(cè)定的有效的效應(yīng)子細(xì)胞包含外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?？蛇x的或額外的，可以在體內(nèi)評(píng)估目標(biāo)分子的ADCC活性，例如，在Clynes等人，PNAS USA 95:652-656(1998)公開的動(dòng)物模型中。

“Fc受體”或“FcR”描述了與抗體的Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體(γ受體)的受體，包含F(xiàn)cγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包含這些受體的等位變體和備選的剪切形式，F(xiàn)cγRII受體包含F(xiàn)cγRIIA(“激活型受體”)和FcγRIIB(“抑制型受體”)，具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中。激活型受體FcγRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸類激活基序(ITAM)。抑制型受體FcγRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸類抑制基序(ITIM)(參見M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995))中綜述了FcR。其他FcR，包含未來鑒別的FcR，都涵蓋在本文的術(shù)語“FcR”中。術(shù)語還包含新生兒受體FcRn，其負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移到胎兒中(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。

“人效應(yīng)子細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的，細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包含外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，其中PBMC和MNK細(xì)胞是優(yōu)選的。可以從天然來源(例如，血液)中分離效應(yīng)子細(xì)胞。

“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指在存在補(bǔ)體的條件下，靶細(xì)胞的裂解。經(jīng)典補(bǔ)體通路的激活是由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(C1q)與結(jié)合其相應(yīng)抗原的(恰當(dāng)亞類的)抗體結(jié)合來起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以實(shí)施CDC測(cè)定，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中描述的。

術(shù)語“綴合”、“綴合的”和“綴合作用”指任何和所有形式的共價(jià)或非共價(jià)連接，包含但不限于直接的遺傳或化學(xué)融合、通過接頭或交聯(lián)劑的偶聯(lián)，和非共價(jià)關(guān)聯(lián)，例如使用亮氨酸拉鏈?？贵w綴合物具有與抗體或抗體片段連接的另一種實(shí)體，例如細(xì)胞毒性化合物、藥物、組合物、化合物、放射性元素或可檢測(cè)的標(biāo)記。

“治療”既指治療性處理，又指預(yù)防或阻止性手段。需要治療的包含已經(jīng)患有功能障礙的，以及需要阻止功能障礙的。

用于治療目的的“哺乳動(dòng)物”指任何分類為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包含人、非人高等靈長(zhǎng)類、家畜和農(nóng)業(yè)動(dòng)物，以及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)或?qū)櫸飫?dòng)物，例如狗、馬、兔、牛、豬、倉(cāng)鼠、小鼠、貓等。優(yōu)選的，哺乳動(dòng)物是人。

“功能障礙”是任何從使用蛋白質(zhì)治療受益的適應(yīng)癥。包含慢性和急性的功能障礙或疾病，包含使哺乳動(dòng)物易患所討論的功能障礙的病理性適應(yīng)癥。

“治療有效量”至少是使特定功能障礙產(chǎn)生可測(cè)量的改善或預(yù)防所需的最低濃度。已知蛋白質(zhì)的治療有效量是本領(lǐng)域普遍已知的，而下文發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的治療有效量可以用落入本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如普通醫(yī)生)技能范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定。

II.執(zhí)行發(fā)明的模式

A.蛋白質(zhì)制備

根據(jù)本發(fā)明，通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域普遍已知的，即，通過培養(yǎng)用含有編碼蛋白質(zhì)的核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

可以如下實(shí)現(xiàn)通過重組手段制備蛋白質(zhì)，通過用表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，并在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)適合誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼理想序列的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不進(jìn)行過度的實(shí)驗(yàn)的條件下，選擇培養(yǎng)條件，例如基質(zhì)、溫度、pH等。一般而言，使細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力最大化的原則、規(guī)程和實(shí)踐技術(shù)可見于Mammalian Cell Biotechnology:A Practical Approach,M.Butler編著(IRL Press,1991)和Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press中。轉(zhuǎn)染的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，包含例如CaPO₄和CaCl₂轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射等。合適的技術(shù)也描述在Sambrook等人，見上文中。其他轉(zhuǎn)染技術(shù)描述在Shaw等人，Gene 23:315(1983)；WO 89/05859；Graham等人，Virology 52:456-457(1978)和U.S.P.4,399,216中。

可以將編碼理想蛋白質(zhì)的核酸插入到用于克隆或表達(dá)的可復(fù)制載體中。合適的載體是公眾可獲得的，并可采用質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w的形式?？梢酝ㄟ^多種程序?qū)⑶‘?dāng)?shù)暮怂嵝蛄胁迦氲捷d體中。一般而言，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將DNA插入到恰當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶位點(diǎn)中。載體組件一般包含但不限于信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志物基因和增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列的一種或多種。含有一種或多種這些組件的合適載體的構(gòu)建應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。

可以從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞裂解液中回收蛋白質(zhì)形式。如果是膜結(jié)合的，則可以使用合適的去垢劑或通過酶促切割從膜中釋放。還可以通過多種物理或化學(xué)手段破壞用于表達(dá)的細(xì)胞，例如凍融循環(huán)、超聲、機(jī)械破壞或細(xì)胞裂解劑。

可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適技術(shù)純化蛋白質(zhì)，例如在離子交換柱上分級(jí)、乙醇沉淀、逆向HPLC、在硅石或陽離子交換樹脂(例如DEAE)上層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、使用蛋白A瓊脂糖柱(例如G-75)凝膠過濾來去除污染物，例如IgG、和金屬螯合柱結(jié)合表位標(biāo)記的形式。

B.抗體制備

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，選定的蛋白質(zhì)是抗體。用于生產(chǎn)抗體(包含多克隆、單克隆、人源化、雙特異性和異源綴合抗體)的技術(shù)如下。

(i)多克隆抗體

一般通過在動(dòng)物中多次皮下(SC)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來產(chǎn)生多克隆抗體。有效的是將相關(guān)抗原與對(duì)待免疫的物種是免疫原性的蛋白質(zhì)綴合，例如匙孔蟲戚(limpet)血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑?？蓱?yīng)用的佐劑的實(shí)例包含弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷脂A、合成的海藻糖dicorynomycolate)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)的條件下選擇免疫規(guī)程。

一個(gè)月后，用弗氏完全佐劑中1/5至1/10初始量的肽或綴合物在多個(gè)位點(diǎn)皮下注射進(jìn)行加強(qiáng)。7至14天后，將動(dòng)物放血，測(cè)定血清中的抗體滴度。加強(qiáng)動(dòng)物直到滴度平臺(tái)期。優(yōu)選的，用相同抗原但與不同蛋白質(zhì)綴合和/或通過不同交聯(lián)劑綴合的綴合物加強(qiáng)動(dòng)物。還在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合體制造綴合物。此外，凝聚劑例如明礬適合用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

(ii)單克隆抗體

單克隆抗體是從基本均質(zhì)的抗體群體中獲得的，即，包含單種抗體的群體是相同的，除了可能以極小量存在的潛在天然發(fā)生的突變以外。因而，定語“單克隆”表示抗體的特征不是不同抗體的混合物。

例如，可以使用雜交瘤方法制造單克隆抗體，所述方法首次描述在Kohler等人，Nature,256:495(1975)中，或者可以是通過重組DNA方法制造的(美國(guó)專利號(hào)4,816,567)。

在雜交瘤方法中，如前所述免疫小鼠或其他恰當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物，例如倉(cāng)鼠，引發(fā)生產(chǎn)或能夠生產(chǎn)抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性的結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)?？蛇x的，可在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，例如聚乙二醇，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103頁(yè)(Academic Press,1986))。

免疫劑典型的包含待配制的蛋白質(zhì)。一般而言，如果人來源細(xì)胞是理想的，則使用外周血淋巴細(xì)胞(“PBL”)，或者如果非人哺乳動(dòng)物來源細(xì)胞是理想的，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后，使用合適的融合試劑(例如聚乙二醇)將淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合，形成雜交瘤細(xì)胞。Goding，Monoclonal antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986)，第59-103頁(yè)。永生化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒類、牛和人來源的骨髓瘤細(xì)胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。將因此制備的雜交瘤細(xì)胞接種，并在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的、親代骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型地將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，所述物質(zhì)阻止HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。

優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是有效融合、支持經(jīng)選擇的抗體生產(chǎn)細(xì)胞穩(wěn)定高水平生產(chǎn)抗體的細(xì)胞，并且對(duì)培養(yǎng)基(例如HAT培養(yǎng)基)敏感。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是小鼠骨髓瘤系，例如源自可獲得自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的小鼠骨髓瘤系，和可獲得自美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心，Rockville,Maryland USA的SP-2細(xì)胞的小鼠骨髓瘤系。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系用于生產(chǎn)人單克隆抗體(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(yè)(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。

測(cè)定生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中生產(chǎn)的針對(duì)抗原的單克隆抗體。優(yōu)選的，通過免疫沉淀或體外結(jié)合測(cè)定(例如，放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))，來確定由雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性。

可以通過例如Munson等人，Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析，來確定單克隆抗體的結(jié)合親和力。

在鑒別出生產(chǎn)具有理想的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可以通過有限稀釋程序亞克隆所述克隆，并用標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding，見上文)生長(zhǎng)。用于該目的的合適培養(yǎng)基包含例如DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可以在動(dòng)物中作為腹水腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)。

免疫試劑典型地包含抗體所結(jié)合的表位蛋白。一般而言，如果人來源細(xì)胞是理想的，則使用外周血淋巴細(xì)胞(“PBL”)，或者如果非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源是理想的，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后，使用合適的融合試劑(例如聚乙二醇)將淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合，形成雜交瘤細(xì)胞。Goding，Monoclonal antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986)，第59-103頁(yè)。

永生化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒類、牛和人來源的骨髓瘤細(xì)胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。雜交瘤細(xì)胞可以培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的永生化細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親代細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型地將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，所述物質(zhì)阻止HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。

優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是有效融合、支持經(jīng)選擇的抗體生產(chǎn)細(xì)胞穩(wěn)定高水平表達(dá)抗體的細(xì)胞，并且對(duì)培養(yǎng)基(例如HAT培養(yǎng)基)敏感。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是小鼠骨髓瘤系，其可獲得自例如Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California和美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心，Rockville,Maryland。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系用于生產(chǎn)人單克隆抗體。Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker,Inc.,New York(1987)第51-63頁(yè)。

測(cè)定培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對(duì)配制的蛋白質(zhì)的單克隆抗體的存在。優(yōu)選的，通過免疫沉淀或體外結(jié)合測(cè)定(例如，放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA))，來確定由雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性。這樣的測(cè)定和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。可以通過例如Munson和Pollard，Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析，來確定單克隆抗體的結(jié)合親和力。

在鑒別出理想的雜交瘤細(xì)胞后，可以通過有限稀釋程序亞克隆所述克隆，并用標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding，見上文)培養(yǎng)。用于該目的的合適培養(yǎng)基包含例如Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基。可選的，雜交瘤細(xì)胞可以在動(dòng)物中作為腹水在體內(nèi)生長(zhǎng)。

通過常規(guī)的免疫球蛋白純化程序，例如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，從培養(yǎng)基、腹水或血清中合適地分離由亞克隆分泌的單克隆抗體。

使用常規(guī)程序可以任意地分離的和測(cè)序編碼單克隆抗體的DNA(例如，通過使用能夠與編碼小鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞作為此類DNA的優(yōu)選來源發(fā)揮作用。一旦分離，DNA可被置于表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)，例如E.coli細(xì)胞、類人猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，或者不另外生產(chǎn)免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以獲得在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。關(guān)于細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述文獻(xiàn)包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。

在其他實(shí)施方案中，可以從使用McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫(kù)，分離小鼠和人抗體。后續(xù)出版物描述了通過鏈改組生產(chǎn)高親和力(nM范圍)的人抗體(Marks等人，Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為對(duì)策構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.,21:2265-2266(1993))。因而，這些技術(shù)是傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行備選方案，用于單克隆抗體的分離。

還可以修飾DNA，例如，通過用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列替代同源的小鼠序列(美國(guó)專利號(hào)4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通過共價(jià)連接免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分的編碼序列。

典型的，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者替代抗體的可變結(jié)構(gòu)域的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，來產(chǎn)生嵌合的二價(jià)抗體，所述二價(jià)抗體包含具有對(duì)一種抗原的特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和對(duì)不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。

還可以使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中已知的方法體外制備嵌合或雜合抗體，包括涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可以使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫酯鍵構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的合適試劑的實(shí)例包括硫醇亞胺(iminothiolate)和甲基-4-巰基丁酸鹽(mercaptobutyrimidate)。

(iii)人源化和人抗體

用于配制方法的抗體可進(jìn)一步包含人源化抗體或人抗體。非人(例如小鼠)抗體的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最少序列。人源化抗體包含人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被具有理想的特異性、親和力和能力的、來自非人物種(供體抗體)的CDR的殘基替代，非人物種例如小鼠、大鼠或兔。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。人源化抗體還包含在受體抗體或輸入的CDR或框架序列中都未發(fā)現(xiàn)的殘基。一般而言，人源化抗體包含基本上完整的至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，所述可變結(jié)構(gòu)域中所有或基本上所有的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，而所有或基本上所有的FR區(qū)對(duì)應(yīng)于人免疫球蛋白的共有序列。人源化抗體最佳地還將包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，典型的是人免疫球蛋白的。Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)和Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

用于人源化非人抗體的方法是本領(lǐng)域普遍已知的。一般而言，人源化抗體具有從非人來源導(dǎo)入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入的”殘基，通常來自“輸入的”可變結(jié)構(gòu)域。人源化可以基本按Winter及同事Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536(1988)的方法來實(shí)施，或通過用人抗體的相應(yīng)序列取代嚙齒類的CDR或CDR序列。相應(yīng)的，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利號(hào)4,816,567)，其中基本上少于完整的人可變結(jié)構(gòu)域被來自非人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐上，人源化抗體典型的是這樣的人抗體，其中一些CDR殘基以及可能一些FR殘基被來自嚙齒類抗體的類似位點(diǎn)的殘基取代。

選擇用于制造人源化抗體中的輕鏈和重鏈的人可變結(jié)構(gòu)域，對(duì)降低抗原性是非常重要的。根據(jù)所謂的“最適”方法，在已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個(gè)文庫(kù)中篩選嚙齒類抗體的可變結(jié)構(gòu)域序列。然后，接受與嚙齒類序列最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(FR)。Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901(1987)。另一種方法使用特定框架，所述框架源自特定亞類的輕鏈或重鏈的所有人抗體的共同序列。相同的框架可用于若干不同的人源化抗體。Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人，J.Immnol.,151:2623(1993)。

更重要的是人源化抗體保持了對(duì)抗原的高親和力和其他有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，根據(jù)優(yōu)選的方法，通過使用親代和人源化序列的三維模型，分析親代序列和多種概念性人源化產(chǎn)物的方法，制備人源化抗體。三維的免疫球蛋白模型是公眾可獲得的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。提示并展現(xiàn)所選定的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可獲得的。對(duì)這些展示的檢視允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列中發(fā)揮功能的可能角色，即分析殘基影響候選免疫球蛋白結(jié)合它的抗原的能力。以此方式，可以從受體中選擇和組合FR殘基，并輸入序列，使得獲得理想的抗體特征，例如與靶抗原增加的親和力。一般而言，CDR殘基直接且大部分實(shí)質(zhì)上涉及影響抗原結(jié)合。

可選的，可以生產(chǎn)這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在缺失內(nèi)源性免疫球蛋白生產(chǎn)的條件下，基于免疫，能夠生產(chǎn)全面的人抗體儲(chǔ)庫(kù)。例如，已描述了在嵌合和種系突變小鼠中純合刪除抗體重鏈連接區(qū)(J_H)基因，獲得對(duì)內(nèi)源性抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到此類種系突變小鼠中，將導(dǎo)致基于抗原刺激的人抗體生產(chǎn)。參見例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.,7:33(1993)。人抗體還可以源自噬菌體展示文庫(kù)(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))。

還可以使用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)生產(chǎn)人抗體，包含噬菌體展示文庫(kù)。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(yè)(1985)和Boerner等人，J.Immunol.147(1):86-95(1991))。相似的，可以通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，來制造人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如是內(nèi)源性免疫球蛋白基因已經(jīng)部分或完全失活的小鼠?；诖碳?，觀察到人抗體生產(chǎn)，其在所有方面密切的模擬了在人中所觀察到的，包括基因重排、裝配和抗體儲(chǔ)庫(kù)。該方法描述在例如美國(guó)專利號(hào)5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016中，和下列科學(xué)出版物中：Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)；Morrison，Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。

(iv)抗體依賴性酶介導(dǎo)的前藥療法(ADEPT)

本發(fā)明的抗體還可用于ADEPT，通過將抗體與前藥-激活的酶綴合，所述酶將前藥(例如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。參見例如WO 88/07378和美國(guó)專利號(hào)4,975,278。

用于ADEPT的免疫綴合物的酶組分包含任何能夠作用于前藥的酶，所述作用方式使前藥轉(zhuǎn)化為更活性的細(xì)胞毒性形式。

可用于本發(fā)明方法中的酶包含但不限于糖苷酶、葡萄糖氧化酶、人溶菌酶、人葡糖醛酸糖苷酶、用于將含磷酸的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含硫酸的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；用于將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶(例如羧肽酶G2和羧肽酶A)和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)，用于將含肽的前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物；D-丙氨酰羧肽酶，用于轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代的前藥；碳水化合物切割酶，例如用于將糖基化前藥轉(zhuǎn)化為游離藥物的β半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸苷酶；用于將β內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β內(nèi)酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，分別用于將胺氮衍生為苯氧乙?；虮揭阴；乃幬镛D(zhuǎn)化為游離藥物?？蛇x的，具有酶活性的抗體，在本領(lǐng)域中也已知為“抗體酶(abzymes)”，可用于將本發(fā)明的前藥轉(zhuǎn)化為游離的活性藥(參見例如，Massey，Nature 328:457-458(1987))。可以按本文所述制備抗體-抗體酶綴合物，用于將抗體酶遞送至腫瘤細(xì)胞群體。

本發(fā)明的酶可以通過本領(lǐng)域普遍已知的技術(shù)與抗IL-17或抗LIF抗體共價(jià)結(jié)合，例如使用上文所討論的異雙官能交聯(lián)劑?？蛇x的，可以使用本領(lǐng)域普遍已知的重組DNA技術(shù)(參見例如Neuberger等人，Nature 312:604-608(1984))構(gòu)建融合蛋白，所述融合蛋白包括本發(fā)明抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)，與本發(fā)明的酶的至少功能活性部分連接。

(v)雙特異性和多特異性抗體

雙特異性抗體(BsAb)是與至少兩種不同的表位具有結(jié)合特異性的抗體。此類抗體可源自全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab')₂雙特異性抗體)。

制造雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)是基于共表達(dá)兩種免疫球蛋白的重鏈-輕鏈對(duì)，其中兩條鏈具有不同的特異性。Millstein等人，Nature,305:537-539(1983)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)搭配，這些雜交瘤(quadromas)生產(chǎn)可能是10種不同的抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。純化正確的分子是相當(dāng)繁瑣的，通常通過親和層析步驟進(jìn)行，而產(chǎn)物產(chǎn)量低。相似的程序公開在WO 93/08829中和Traunecker等人，EMBO J.,10:3655-3659(1991)中。

具有理想結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))可以與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。融合優(yōu)選是與免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合，包含至少部分的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選的是在至少一個(gè)融合體中存在第一重鏈恒定區(qū)(CH1)，該區(qū)含有輕鏈結(jié)合必需的位點(diǎn)。將編碼免疫球蛋白重鏈(以及需要時(shí)，免疫球蛋白輕鏈)融合體的DNA插入到不同的表達(dá)載體中，共轉(zhuǎn)染合適的宿主生物。關(guān)于產(chǎn)生雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，參見例如Suresh等人，Methods in Enzymology 121:210(1986)。

根據(jù)不同的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。融合體優(yōu)選是具有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的，包括鉸鏈的至少一部分、CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選含有輕鏈結(jié)合必需位點(diǎn)的第一個(gè)重鏈恒定區(qū)(CH1)存在于至少一個(gè)融合體中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體和視情況而定的免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體中，并且共同轉(zhuǎn)染至合適的宿主生物體中。當(dāng)構(gòu)建中使用不等比例的三種多肽鏈以提供最佳產(chǎn)量時(shí)，這為調(diào)節(jié)實(shí)施方案中的三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，當(dāng)以相等的比例表達(dá)至少兩種多肽導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)，或者當(dāng)比例不是特別重要時(shí)，可以將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入到一個(gè)表達(dá)載體中。

根據(jù)WO 96/27011中描述的另一種方法，可以改造成對(duì)抗體分子之間的界面，使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域的至少一部分CH3區(qū)。在該方法中，用較大的側(cè)鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替代第一抗體分子的界面中的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈。通過用較小側(cè)鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)替代大氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的界面上創(chuàng)造補(bǔ)償大側(cè)鏈的相同或相似尺寸的“空洞”。這提供了用于增加異二聚體相對(duì)于其他不需要的副產(chǎn)物(例如，同二聚體)的產(chǎn)量的機(jī)制。

在該方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性抗體包含在一條臂上具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈，和在另一臂上的雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)。發(fā)現(xiàn)該不對(duì)稱的結(jié)構(gòu)有利于從不需要的免疫球蛋白鏈組合中分離理想的雙特異性化合物，因?yàn)閮H在一半的雙特異性分子中存在的免疫球蛋白輕鏈提供了易于實(shí)施的分離方式。該方法公開在1994年3月3日公開的WO 94/04690中。關(guān)于產(chǎn)生雙特異性抗體的其他細(xì)節(jié)，參見例如Suresh等人，Methods in Enzymology,121:210(1986)。

雙特異性抗體包含交聯(lián)的或“異源綴合的”抗體。例如，可以將異源綴合物中的一種抗體與抗生物素蛋白偶聯(lián)，另一種與生物素偶聯(lián)。例如此類抗體已被提議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向至不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4,676,980)，以及用于治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373)?？梢允褂萌魏畏奖愕慕宦?lián)方法，制造異源綴合的抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域普遍已知的，公開在美國(guó)專利號(hào)4,676,980中，同時(shí)有多種交聯(lián)技術(shù)。

用于從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)也已描述在文獻(xiàn)中。還可以使用下列技術(shù)生產(chǎn)不一定是雙特異性的二價(jià)抗體片段。例如，可以在體外化學(xué)偶聯(lián)從E.coli回收的Fab'片段，形成二價(jià)抗體。參見Shalaby等人，J.Exp.Med.,175:217-225(1992)。

雙特異性抗體可以制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab’)₂雙特異性抗體)。從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)已描述在文獻(xiàn)中。例如，可以使用化學(xué)連接制備雙特異性抗體。Brennan等人，Science 229:81(1985)描述了這樣的程序，其中完整的抗體被蛋白水解切割，產(chǎn)生F(ab’)₂片段。在存在二巰醇復(fù)合試劑亞砷酸鈉的條件下，還原這些片段，穩(wěn)定鄰位的二巰基，阻止形成分子間二硫鍵。然后，將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。然后，將一種Fab’-TNB衍生物再轉(zhuǎn)化為Fab’-TNB衍生物，形成雙特異性抗體。所生產(chǎn)的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定的試劑。

可以從E.coli直接回收Fab'片段，并化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab’)₂分子的生產(chǎn)。每種Fab'片段從E.coli分別分泌，并在體外進(jìn)行直接化學(xué)偶聯(lián)，形成雙特異性抗體。因而所形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常的人T細(xì)胞，以及觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞抗人乳腺腫瘤靶的裂解活性。

還已經(jīng)描述了用于直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制造和分離雙價(jià)抗體片段的各種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生產(chǎn)二價(jià)異二聚體。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通過基因融合，將Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab'部分連接。在鉸鏈區(qū)還原抗體同二聚體，形成單體，然后再氧化形成抗體異二聚體。Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的“二價(jià)體”技術(shù)提供了制造雙特異性/二價(jià)抗體片段的備選機(jī)制。片段包含通過接頭與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(V_L)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(V_H)，接頭太短而不允許在同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)。因此，一個(gè)片段的V_H和V_L結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段的互補(bǔ)的V_L和V_H結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體，制造雙特異性/二價(jià)抗體片段的另一對(duì)策。參見Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994)。

考慮了具有兩個(gè)效價(jià)以上的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)。

示例性的雙特異性抗體可以結(jié)合給定分子上的兩種不同的表位?？蛇x的，可以將抗蛋白質(zhì)的臂與結(jié)合白細(xì)胞上的觸發(fā)分子的臂組合，所述觸發(fā)分子例如T細(xì)胞受體分子(如，CD2、CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受體(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，使得細(xì)胞防御機(jī)制關(guān)注表達(dá)特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞。還可以使用雙特異性抗體將細(xì)胞毒性劑定位于表達(dá)特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞。此類抗體具有蛋白質(zhì)結(jié)合臂，和結(jié)合細(xì)胞毒性劑或放射性核素螯合劑(例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。另一種目的雙特異性抗體結(jié)合目的蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步結(jié)合組織因子(TF)。

(vi)異源綴合的抗體

異源綴合的抗體也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源綴合的抗體包含兩個(gè)共價(jià)連接的抗體。此類抗體被提議例如將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向至不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4,676,980)，以及用于治療HIV感染。WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089?？紤]使用任何合成蛋白質(zhì)化學(xué)中已知的方法，在體外制備所述抗體，包含涉及交聯(lián)劑的那些。例如，可以使用二硫鍵交換反應(yīng)或通過形成硫酯鍵，構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的合適試劑的實(shí)例包含硫醇亞胺(iminothiolate)和甲基-4-mercaptobutyrimidate，以及在例如美國(guó)專利號(hào)4,676,980中公開的。

C.蛋白質(zhì)純化，包含抗體

當(dāng)在人以外來源的重組細(xì)胞中表達(dá)靶多肽時(shí)，靶多肽完全不含人來源的蛋白質(zhì)或多肽。然而，必須從重組細(xì)胞蛋白質(zhì)或多肽中純化靶多肽，獲得靶多肽基本均質(zhì)的制品。作為第一步，通常離心培養(yǎng)基或裂解液，去除顆粒狀的細(xì)胞殘片。然后，分離膜和可溶的蛋白質(zhì)級(jí)分。然后，從可溶的蛋白質(zhì)級(jí)分中和從培養(yǎng)裂解液的膜級(jí)分中純化靶多肽，這取決于靶多肽是否是膜結(jié)合的。下列程序是合適的純化程序的示例：基于免疫親合或離子交換柱分級(jí)；乙醇沉淀；逆相HPLC；在硅石上或在陽離子交換樹脂(例如DEAE)上層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝膠過濾；和蛋白A瓊脂糖柱以去除污染物，例如IgG。

大多數(shù)公司目前使用三柱平臺(tái)方法生產(chǎn)單克隆抗體(MAb)，所述方法包含用于產(chǎn)物捕獲的蛋白A親合層析、后接流通(flow-through)模式的陰離子交換層析，抽提帶負(fù)電荷的污染物，例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)、內(nèi)毒素、宿主DNA和泄露的蛋白A，然后是滯留模式的陽離子交換層析或疏水相互作用層析(HIC)，以去除帶正電荷的污染物類型，包含殘余的HCP和產(chǎn)物聚集物。

可能存在于蛋白質(zhì)溶液中的病毒大于蛋白質(zhì)本身。因而假設(shè)可以根據(jù)尺寸，通過過濾從蛋白質(zhì)中去除病毒。

病毒過濾可以去除較大的病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒(80-100nm直徑)，通常使用標(biāo)稱孔徑約60nm的高通量膜。由于具有20nm標(biāo)稱孔徑的高通量膜也是可商購(gòu)的，它可以通過過濾去除更小的病毒，例如細(xì)小病毒(18-26nm直徑)，同時(shí)允許通過大至160kD(～8nm)的蛋白質(zhì)，例如單克隆抗體。本發(fā)明主要意圖是解決使用較小孔徑的病毒去除濾器，而與此類較小病毒過濾相關(guān)的問題。

典型的，可以在給定的下游工藝中若干節(jié)點(diǎn)中的任一個(gè)執(zhí)行病毒過濾步驟。例如，在典型的單克隆抗體純化工藝中，可以在低pH病毒失活步驟后，或者在中間的柱層析步驟后，或者在最終的柱層析步驟后進(jìn)行病毒過濾。

根據(jù)本發(fā)明，可以在下游工藝的任何階段進(jìn)行病毒過濾單元操作。在單克隆抗體的下游加工過程中的病毒過濾通常在親和層析步驟(捕獲步驟)或離子交換純化步驟(精制步驟)后實(shí)施。

圖1中示例了在本文公開的實(shí)驗(yàn)中使用的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。然而，應(yīng)強(qiáng)調(diào)本發(fā)明不限于此。其他本領(lǐng)域普遍已知的裝置也是適合的，并可用于本發(fā)明的方法中。

在切向流病毒過濾中，蛋白質(zhì)溶液通常大約以恒定的流速泵至滯留側(cè)。在病毒去除濾器兩側(cè)產(chǎn)生的壓力差使得蛋白質(zhì)溶液滲透通過濾器，而病毒停留在滯留側(cè)。

在所謂的“法向流(normal-flow)”或“盲端(dead-end)”病毒過濾的情況下，可以使用切向病毒過濾中使用的相同的病毒濾器，但是周圍的儀器和操作程序比切向流病毒過濾的情況下的更簡(jiǎn)單且更便宜。因而原則上，“法向流”過濾涉及在過濾前，將含大分子的溶液放置在壓力容器中，并在壓力源(合適的是氮(氣)或空氣)的幫助下壓迫溶液通過病毒去除濾器?？蛇x的，可以在滯留側(cè)使用泵使液體以預(yù)定的流速濾過病毒去除濾器。

濾器的靈敏程度(fineness)一般用孔徑或?yàn)V器所停留分子的近似分子量(相對(duì)分子量)來表示，因而所述分子量被稱為截留的。

病毒濾器是本領(lǐng)域已知的，并由Massachusetts,USA的Millipore和日本的Asahi Chemical Industry Co.,Ltd.等供應(yīng)。合適的細(xì)小病毒滯留濾器包括Pro(Millipore Corp.,Billerica,MA)。Pro膜具有不對(duì)稱的雙層結(jié)構(gòu)，是用聚醚砜(PES)制造的。所述膜結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為停留尺寸大于20nm的病毒，同時(shí)允許分子量小于180kDa的蛋白質(zhì)滲透通過膜。其他適合從蛋白質(zhì)溶液中去除小病毒(包含細(xì)小病毒)的濾器包括Novasip^TM DV20和DV50病毒去除濾膜(Filter Capsule)(Pall Corp.,East Hills,NY)、CPV、Planova 20 N(Asahi Kasei)和BioEX(Asahi Kasei)。Novasip DV20梯度膜濾器利用Ultipor VF-級(jí)DV20級(jí)折疊膜套管(pleated membrane cartridge)從多達(dá)5-10升的蛋白質(zhì)溶液中去除細(xì)小病毒和其他小至20nm的病毒。Novasip DV50級(jí)膜式濾器整合了Ultipor VF DV50級(jí)膜套管，用于去除40-50nm和更大的病毒。供應(yīng)的Novasip Ultipor VF膜式濾器是無菌的，還可以是γ-照射過的。CPV利用雙層的聚醚砜不對(duì)稱膜，滯留超過4log的細(xì)小病毒和6log的逆轉(zhuǎn)錄病毒。

對(duì)原料溶液的預(yù)過濾對(duì)過濾性能具有令人驚訝的影響。預(yù)過濾典型的目的是去除可能導(dǎo)致病毒濾器結(jié)垢的雜質(zhì)和污染物，例如蛋白質(zhì)聚集物、DNA和其他痕量材料。

根據(jù)本發(fā)明，可以通過預(yù)過濾步驟實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒濾器效率的顯著增強(qiáng)，包括使用陽離子交換和內(nèi)毒素去除基質(zhì)。在上下文中，術(shù)語“媒介”或“基質(zhì)”分別用于覆蓋任何用于實(shí)施陽離子交換和內(nèi)毒素去除步驟的手段。因而，術(shù)語“陽離子交換媒介”具體包含但不限于陽離子交換樹脂、矩陣(matrices)、吸附劑等。術(shù)語“內(nèi)毒素去除媒介”包含但不限于任何帶正電的膜表面，包含例如層析的內(nèi)毒素去除基質(zhì)、內(nèi)毒素親和去除基質(zhì)等。

適用于本發(fā)明的預(yù)過濾步驟中的陽離子交換媒介包含但不限于S、S、Shield、SPFF、SPXL、S、50 HS、S、D等，都是可商購(gòu)的。

適用于本發(fā)明的預(yù)過濾步驟中的內(nèi)毒素去除基質(zhì)包含但不限于E、Q、Q、Q、QSFF、Q、Q等，都是可商購(gòu)的。

可以通過例如采用待處理的層析液(pool)，并在包含內(nèi)毒素去除和陽離子交換基質(zhì)和細(xì)小病毒濾器的過濾鏈(filtration train)上處理所述液，來實(shí)施預(yù)過濾步驟。內(nèi)毒素去除和陽離子交換基質(zhì)作為預(yù)過濾步驟發(fā)揮作用，細(xì)小病毒濾器的容量不依賴于過濾鏈中該兩個(gè)步驟的順序。過濾鏈可以作為單個(gè)步驟連續(xù)工作，或者可以作為不同的操作單位來操作。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，首先將層析液通過內(nèi)毒素去除基質(zhì)，然后將收集到的液通過陽離子交換基質(zhì)，之后用細(xì)小病毒濾器過濾所述液。如上所述，在處理序列中應(yīng)用陽離子交換基質(zhì)和內(nèi)毒素去除基質(zhì)的順序不影響細(xì)小病毒過濾容量。所述處理可以在寬pH范圍下操作，例如在4-10的pH范圍內(nèi)，最佳過濾容量依賴于針對(duì)的雜質(zhì)組成和產(chǎn)物屬性。相似的，蛋白質(zhì)濃度可以在大范圍內(nèi)變化，例如1-40g/L，而不限制細(xì)小病毒濾器的質(zhì)量通量。

通過參考下列實(shí)施例將更全面的理解本發(fā)明。但所述實(shí)施例不應(yīng)被視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。公開內(nèi)容全文中的所有引用文獻(xiàn)都通過引用明確整合到本文中。

實(shí)施例

材料和方法

1.蛋白質(zhì)溶液

由于在單克隆抗體的下游加工過程中的病毒過濾是在親和層析(捕獲步驟)和離子交換步驟(精制(polishing)步驟)之后實(shí)施的，因此所有的過濾實(shí)驗(yàn)都是以商業(yè)上相關(guān)的待加工的離子交換(陽離子或陰離子交換)層析液進(jìn)行實(shí)施的。mAb濃度和陽離子交換液的電導(dǎo)與陰離子交換液的電導(dǎo)分別是10mg/ml和10mS/cm，與8mg/ml和4ms/cm。用新鮮的原料(在生產(chǎn)后24小時(shí)內(nèi)使用)，或用生產(chǎn)后冷凍在-70℃并在使用前在4-8℃解凍的原料來實(shí)施過濾實(shí)驗(yàn)。用新鮮的或凍融的原料獲得的結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)顯著的差異。使用UV-vis分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000，NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)在280nm測(cè)量吸光值，確定蛋白質(zhì)濃度。

2.膜

用Pro(Millipore Corp.、Billerica、MA)細(xì)小病毒滯留濾器實(shí)施過濾實(shí)驗(yàn)。Pro膜具有不對(duì)稱的雙層結(jié)構(gòu)，是用聚醚砜(PES)制成的。所設(shè)計(jì)的膜結(jié)構(gòu)留下尺寸大于20nm的病毒，同時(shí)允許分子量小于180kDa的蛋白質(zhì)滲透通過膜。在本研究中評(píng)估的Pro的預(yù)過濾包含Optiscale 40深度濾膜(Millipore Corp.，Billerica，MA)、Fluorodyne EX Mini 0.2μm無菌濾膜(Pall Corp.，East Hills，NY)和家族的膜吸附劑(Pall Corp.，East Hills，NY)。膜吸附劑是以完全封裝的單位，從銷售商獲得的。表1總結(jié)了本研究中使用的所有預(yù)過濾器的關(guān)鍵性質(zhì)(官能團(tuán)、柱床體積、孔徑等)。

表1：預(yù)過濾器的關(guān)鍵性質(zhì)

3.實(shí)驗(yàn)設(shè)置

用圖1顯示的定制裝置實(shí)施過濾實(shí)驗(yàn)。將裝載材料(即，待加工的mAb液)置于裝載儲(chǔ)液槽中，并通過由不同的預(yù)過濾器和可商購(gòu)的細(xì)小病毒濾器組合構(gòu)成的過濾鏈過濾。在所有的過濾實(shí)驗(yàn)中，使用恒定過濾流速(P_max)方法。壓力傳感器置于每個(gè)濾器的上游，并與Millidaq或Netdaq系統(tǒng)偶聯(lián)，記錄作為時(shí)間或質(zhì)量通量的函數(shù)的不同壓力數(shù)據(jù)。將細(xì)小病毒濾器的濾液收集在儲(chǔ)液槽中，所述儲(chǔ)液槽保持在裝載室上，以記錄作為時(shí)間函數(shù)的質(zhì)量通量。

結(jié)果和討論

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的mAb的下游純化典型的利用離心和深度濾膜作為去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片的第一步，之后再親和層析進(jìn)行mAb捕獲和去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)，之后再進(jìn)行陽離子交換層析、病毒過濾和陰離子交換層析，進(jìn)一步去除雜質(zhì)，例如聚集物、病毒、泄露的蛋白A和HCP。該研究中的大部分實(shí)驗(yàn)都是用陽離子交換液實(shí)施的，以陽離子交換層析作為第二個(gè)層析步驟。

圖2顯示使用治療性mAb原料流和不同的預(yù)過濾器，在200L/m²/hr的恒流、Viresolve Pro兩側(cè)不同壓力下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。X軸代表每平方米病毒濾器裝載的mAb質(zhì)量。Y軸代表作為質(zhì)量通量的函數(shù)的病毒濾器兩側(cè)不同壓力。數(shù)據(jù)清楚地表示，相比無菌濾膜，深度濾膜在病毒過濾容量上提供了若干數(shù)量級(jí)的增加。Bolton等人(Bolton等人，Appl.Biochem.43:55-63、2006)作出了相似的觀察結(jié)果，當(dāng)其評(píng)估Viresolve Prefilter^TM——一種深度濾膜基質(zhì)——作為多克隆IgG溶液的NFP細(xì)小病毒滯留濾器(Millipore Corp.)的預(yù)濾器時(shí)。作者將容量的增加歸因于由于疏水性相互作用導(dǎo)致污垢物——變性蛋白質(zhì)——的選擇性吸附。

雖然深度濾膜傳統(tǒng)上已成功的用于澄清細(xì)胞培養(yǎng)液，然而當(dāng)在下游捕獲步驟使用時(shí)，例如作為細(xì)小病毒滯留濾器的預(yù)過濾器，仍有相當(dāng)一些值得額外考慮的限制。

(a)深度濾膜不是堿穩(wěn)定的，阻止了在安裝后對(duì)處理鏈進(jìn)行消毒處理，導(dǎo)致開放式加工和潛在的生物負(fù)荷生長(zhǎng)。

(b)深度濾膜的組成包含硅藻土作為關(guān)鍵組分，硅藻土一般是食品級(jí)的，存在質(zhì)量關(guān)注。

(c)硅藻土一般是天然來源——缺少明確定義的化學(xué)方法——因而可以具有批次變化。

(d)深度濾膜還傾向于泄露金屬、β聚糖和其他雜質(zhì)，需要使用下游操作證實(shí)和驗(yàn)證這些雜質(zhì)的清除。

上述限制對(duì)加工進(jìn)程施加了額外的負(fù)擔(dān)，因而需要設(shè)計(jì)深度濾膜下游的操作單位來提供可泄漏物的適當(dāng)清除。然而，即使?jié)M足了所需的泄漏物清除，也需要考慮這樣的原因，即特定批次的深度濾膜可能具有明顯高于方法能夠清除的泄漏物，因?yàn)殛P(guān)鍵組分是源自天然的，換言之，它們?nèi)狈γ鞔_定義的化學(xué)合成方法。

因而，對(duì)于開發(fā)不存在這些限制的預(yù)濾器具有明顯的興趣。如上所述，Brown等人(Brown等人，IBC's 20^th Antibody Development and Production、San Diego、CA、2008)近期顯示，一種帶強(qiáng)負(fù)電荷的離子交換劑Mustang S當(dāng)用作預(yù)濾器時(shí)，可以使細(xì)小病毒滯留濾器的容量增加數(shù)倍。因而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同預(yù)過濾基質(zhì)對(duì)Pro的效應(yīng)。在pH 5.0和6.5的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在圖3(a)和(b)中。數(shù)據(jù)顯示盡管在pH 5.0，陽離子交換基質(zhì)表現(xiàn)出比內(nèi)毒素去除吸附劑略微的優(yōu)勢(shì)，該優(yōu)勢(shì)在pH 6.5下消失。雖然用兩種基質(zhì)的整體容量都高于用無菌濾器的(圖2)；但仍然明顯短缺在生產(chǎn)規(guī)模成功進(jìn)行單位操作所需的容量。

基于這樣的假設(shè)，即陽離子交換和內(nèi)毒素去除基質(zhì)都可以去除兩種不同的污垢物；所述污垢物兩者都可導(dǎo)致濾器結(jié)垢，用新的預(yù)過濾鏈設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，所述預(yù)過濾鏈同時(shí)包括陽離子交換和內(nèi)毒素去除基質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在圖4(a)和(b)中，分別在pH 5.0和pH 6.5下完成。數(shù)據(jù)清楚地表示，兩種基質(zhì)的組合明顯優(yōu)于每種基質(zhì)本身。例如，在pH 5.0，在20psi壓力差異下，陽離子交換和內(nèi)毒素去除基質(zhì)的組合提供了大于一個(gè)數(shù)量級(jí)的容量改善。在pH 6.5也可見相似的傾向，但整體容量低于在pH 5.0所獲得的。這可能是由于在較低pH下更有效的去除了雜質(zhì)。

圖5中顯示了使用mAb2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與圖4中的數(shù)據(jù)一致，同時(shí)含有內(nèi)毒素去除基質(zhì)和陽離子交換基質(zhì)的新型預(yù)過濾鏈實(shí)質(zhì)上增加了容量，提示內(nèi)毒素去除基質(zhì)和陽離子交換基質(zhì)協(xié)同作用，去除兩種不同類型的污垢物。

結(jié)論

大部分之前的工作關(guān)注于使用深度濾膜或陽離子交換膜吸附劑作為預(yù)濾器，來增加細(xì)小病毒滯留濾器的容量。雖然深度濾膜提供了強(qiáng)有力的增加病毒過濾容量的機(jī)制，但與之相關(guān)的限制(例如泄漏物)限制它們應(yīng)用于下游純化序列中的特定階段。陽離子交換膜吸附劑可以增加一些單克隆抗體(mAb)原料流的細(xì)小病毒濾器容量，但根據(jù)本研究中的數(shù)據(jù)可見，它們不是可以普遍應(yīng)用的，提示可能存在多種污垢物，需要解決所述污垢物以進(jìn)一步改善細(xì)小病毒去除濾器的性能。

如上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)的，本發(fā)明強(qiáng)調(diào)兩個(gè)方面——(1)當(dāng)用于預(yù)過濾時(shí)，內(nèi)毒素去除基質(zhì)自身可以有效增加細(xì)小病毒濾器的容量，和(2)在預(yù)過濾鏈中偶聯(lián)內(nèi)毒素去除和陽離子交換基質(zhì)可以提供增加若干倍的細(xì)小病毒過濾容量，降低原料消耗和在生產(chǎn)規(guī)模促進(jìn)成功的病毒過濾操作。