技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及藥物化學(xué)合成領(lǐng)域，具體是指知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物、其藥物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(AD)是一種最常見(jiàn)的老年癡呆癥，是一種與年齡高度相關(guān)，以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶損傷為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病。早期的癥狀經(jīng)常被錯(cuò)誤的認(rèn)為是與年齡有關(guān)的問(wèn)題或是壓力的臨床表現(xiàn)。癥狀前期，最常見(jiàn)的是記憶與閱讀能力的減退。隨著病情的發(fā)展，將會(huì)出現(xiàn)困惑、易怒、情緒不穩(wěn)定、語(yǔ)言障礙以及長(zhǎng)期的記憶喪失等癥狀，甚至身體機(jī)能逐漸喪失最終導(dǎo)致死亡。

到目前為止，阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明該病與腦內(nèi)的老年斑塊與神經(jīng)纖維纏結(jié)有關(guān)。目前的治療僅僅緩解阿爾茨海默病的癥狀，而不能減緩它紊亂的進(jìn)程。迄今，人們已經(jīng)提出了很多關(guān)于阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)理的假說(shuō)，包括乙酰膽堿能假說(shuō)、Tau蛋白假說(shuō)、淀粉樣多肽(Aβ)假說(shuō)和能量代謝假說(shuō)。

氧化應(yīng)激是阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制之一，它通過(guò)產(chǎn)生自由基和氧化物來(lái)?yè)p傷細(xì)胞。它打破了活性氧與抗氧化體系之間的平衡，從而使機(jī)體過(guò)度氧化，造成機(jī)體損傷。

在人體內(nèi)，自由基的過(guò)量產(chǎn)生是有害的，它們很容易與酯類、核酸反應(yīng)，損害細(xì)胞功能。氧化過(guò)程能夠損傷細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜性質(zhì)的改變，如離子運(yùn)輸、酶活性、蛋白質(zhì)交聯(lián)等甚至可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致阿爾茨海默病、帕金森癥、心臟衰竭、癌癥以及其他疾病的重要原因之一。

最近幾年，從對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃腿祟惔竽X研究數(shù)據(jù)得出的結(jié)論表明：氧化應(yīng)激在阿爾茨海默病和帕金森癥患者大腦內(nèi)神經(jīng)元變性方面起著重要作用。在患者體內(nèi)增強(qiáng)的氧化應(yīng)激也間接支持這一觀點(diǎn)，其中氧化應(yīng)激增強(qiáng)的表現(xiàn)有：大腦表皮傳輸元素Fe、Al、Zn等數(shù)量的增加，脂質(zhì)過(guò)氧化程度增加，不飽和脂肪酸數(shù)量減少，自由基的激增，蛋白質(zhì)、DNA氧化程度的加重，能量代謝的減少，超氧化物歧化酶(SOD-1)在神經(jīng)纖維、老年斑中數(shù)量的增加。

阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制有多種假說(shuō)，比如乙酰膽堿能假說(shuō)、淀粉樣多肽假說(shuō)、能量代謝假說(shuō)、自由基損傷假說(shuō)等。因此存在多種治療阿爾茨海默病的方法，比如乙酰膽堿酯酶抑制劑(AchEI)、基于Tau蛋白的治療、淀粉樣蛋白抑制劑、β-分泌酶抑制劑、γ-分泌酶抑制劑、抗炎和神經(jīng)保護(hù)療法。

研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物成分中有很多具有清除自由基的功能(如茶多酚、黃銅、生物堿、甾體化合物等)。我國(guó)地大物博、植被眾多，這就為我們從天然產(chǎn)物中尋找抗氧化劑提供了便利條件。

知母是我國(guó)常見(jiàn)的中藥之一，它是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge.的干燥塊莖，具有消渴熱中、除邪氣、消除肢體浮腫之功效，為常用的滋陰藥之一。它的提取物已經(jīng)被證明具有利尿、抗糖尿病、抗血小板凝集、抗真菌等生物活性，而且也表現(xiàn)出對(duì)環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶的抑制作用。藥效實(shí)驗(yàn)證明知母皂苷元及其衍生物是一種新型的能改善學(xué)習(xí)記憶能力的藥物，它不同與以往的乙酰膽堿酯酶抑制劑或M受體的激動(dòng)劑、拮抗劑。它能夠使降低的腦M受體密度提高到接近正常水平，在體內(nèi)作用緩慢而持久。

知母皂苷元及其衍生物的新藥研究情況：

(1)知母皂苷元用于治療盧伽霍氏病，已進(jìn)行到臨床1期，作用機(jī)制為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑作用于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子知母皂苷元用于治療ALS。

(2)知母皂苷元衍生物用于治療老年癡呆進(jìn)行到生物學(xué)測(cè)試階段的是：知母皂苷元3位乙酰酯化衍生物。

(3)知母皂苷A-III作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑治療疾病已進(jìn)行到臨床試驗(yàn)前期實(shí)驗(yàn)。

從以上關(guān)于知母皂苷元的研究顯示，知母皂苷元是一種很好的用于治療神經(jīng)系統(tǒng)類疾病的先導(dǎo)化合物，但是現(xiàn)今對(duì)知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物的研究還不成熟，能用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)類疾病藥物如老年癡呆藥物的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物還太過(guò)稀少。

所以，用于制備治療抗老年癡呆疾病藥物的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物是十分具有實(shí)用價(jià)值的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺失，提供可用于制備治療抗老年癡呆疾病藥物的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物，其藥物組合物及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物，其主要特點(diǎn)是，所述的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物的結(jié)構(gòu)式如式(I)所示，

其中，所述的R₁為以下基團(tuán)中的任意一種，所述的以下基團(tuán)包括：

R₂為C₁-C₈直鏈或支鏈的烷基、取代或未取代的芳基中的一種，

R₃為C₁-C₈直鏈或支鏈的烷基、取代或未取代的芳基中的一種，

R₄為C₁-C₈取代或未取代直鏈或支鏈的烷基、取代或未取代的芳基中的一種，

R₅、R₆為H，

R₇為H、C₁-C₈為直鏈或支鏈的烷基、取代或未取代的芳基中的一種。

較佳地，當(dāng)R₂為取代的芳基時(shí)，取代的芳基選自C₁-C₄不飽和烷基、烷氧基中的一種；

當(dāng)R₃為取代的芳基時(shí)，取代的芳基選自C₁-C₄直鏈或支鏈烷基、鹵素中的一種；

當(dāng)R₄為取代烷基時(shí)，取代烷基為胺基或氰基中的一種，當(dāng)R₄為取代芳基時(shí)，取代芳基為鹵素或胺基中的一種；

當(dāng)R₇為取代芳基時(shí)，取代芳基為C₁-C₄不飽和烷基、烷氧基、氰基、羥基、鹵素或胺基、中的一種，其中R₈、R₉為C₁-C₈為直鏈或支鏈的烷基、取代或未取代的芳基中的一種。

較佳地，當(dāng)R₈、R₉為取代芳基時(shí)，取代芳基為C₁-C₄不飽和烷基、烷氧基、羥基中的一種。

較佳地，所述的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物為以下化合物中的一種，

本發(fā)明第二方面提供了另一種知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物，其特征在于，所述的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物的結(jié)構(gòu)式如式(II)所示，

其中，所述的R₁為以下基團(tuán)中的任意一種，所述的以下基團(tuán)包括：

R₂為鹵素，

R₃為H或者C₁-C₈直鏈或支鏈的烷基，取代或未取代的芳基，

X為O或NH，R₄為C₁-C₈取代或?yàn)橹辨溁蛑ф湹耐榛?、取代或未取代的芳基或芳雜環(huán)中的一種，

R₅為H時(shí)，R₆為C₁-C₈取代或?yàn)橹辨溁蛑ф湹耐榛?/p>

較佳地，當(dāng)R₃為取代的芳基時(shí)，取代的芳基為C₁-C₄飽和烷基中的一種；

R₄為取代芳基時(shí)，取代芳基為鹵素或烷氧基或硝基中的一種；

R₆為取代烷基時(shí)，取代烷基為羥基、取代或未取代的芳基或芳雜環(huán)。

較佳地，當(dāng)R₆為取代芳基時(shí)，取代芳基為芳雜環(huán)胺基，R₅和R₆連接在一起形成一個(gè)含有C、N、O的雜環(huán)G，所述雜環(huán)G是飽和的并且有取代基

較佳地，所述的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物為以下化合物中的一種，

本發(fā)明第三方面提供了一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及任選的藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明第四方面提供了上述的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物在制備治療抗老年癡呆疾病藥物中的應(yīng)用。

采用本發(fā)明的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物，其藥物組合物及其應(yīng)用，首次對(duì)該先導(dǎo)化合物進(jìn)行了系統(tǒng)的針對(duì)3位和26位兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)修飾，合成了一系列的新化合物，這些新合成的化合物通過(guò)針對(duì)AD相關(guān)靶點(diǎn)的活性測(cè)試，很多顯示出優(yōu)于先導(dǎo)化合物的活性。對(duì)于治療老年癡呆癥十分具有實(shí)用價(jià)值。彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物的不足，十分具有意義。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例15的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例16 NO測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例16 TNF-α測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例16 PGE2測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例17的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例18的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例19的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方法作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

知母皂苷元AA的制備的方法如下：

按知母根莖藥于50％-90％的乙醇的重量份數(shù)1:2-1:4回流提取三次，過(guò)濾，揮干乙醇。乙醇粗提物分散于5％的H₂SO₄中，加熱水解4-10小時(shí)，酸水解產(chǎn)物用DCM萃取多次，除去DCM得到知母皂苷元的粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物用石油醚-丙酮(20:1)洗脫，得到知母皂苷元AA。

知母皂苷元AA

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.42(m,1H,H-20),4.12(s,1H,H-3),3.97(d,J＝11.0Hz,1H,H-26),3.31(d,J＝11.0Hz,1H,H-26),2.07–0.98(m,37H),0.77(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ109.75,81.02,67.08,65.14,62.08,56.47,42.11,40.67,40.31,39.85,36.52,35.27(2C),33.53,31.74,29.95,27.81,27.08,26.56,26.54,25.94,25.77,23.92,20.90,16.50,16.05,14.34.MS(ESI):m/z 416.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₂₇H₄₄O₃:416.3312；Found:416.3308.

實(shí)施例2

知母皂苷元衍生物ZM1制備方法：

常溫下，將知母皂苷元AA與醋酸酐和氯化銨混合，然后將反應(yīng)升溫至50-150℃反應(yīng)4-24小時(shí)后，加入2％-10％的甲醇的氫氧化鈉溶液，常溫反應(yīng)4-24小時(shí)，經(jīng)萃取、柱層析得知母皂苷元衍生物ZM1。

知母皂苷元衍生物ZM1

1H NMR(400MHz，CDCl₃)δ4.73(ddd,J＝16.2,7.1Hz,1H),4.11(s,1H),3.47(d,J＝21.0Hz,2H),2.47(d,J＝10.0Hz,1H),1.28-1.93(m,30H),0.98(s,3H),0.92(d,3H),0.67(s,3H).13C-NMR(101MHz,CDCl₃)δ151.59,103.80,84.40,68.05,67.07,64.39,54.97,43.72,39.98,39.82,36.51,35.35,35.26,35.07,34.05,33.53,30.38,29.96,27.84,26.69,26.54,23.90,23.15,21.04,16.43,14.20,11.66,ESI-MS m/z 417.4[M+H]⁺。

實(shí)施例3

知母皂苷元衍生物ZM13制備方法：

氬氣保護(hù)下，將知母皂苷元衍生物ZM1與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)1-10h后，加入疊氮化鈉，同時(shí)將溫度升至40-100℃，反應(yīng)1-10h后，再加入三苯基膦，常溫反應(yīng)1-10h后經(jīng)萃取、柱層析得知母皂苷元衍生物ZM13。其中，ZM1與甲苯磺酰氯、疊氮化鈉、三苯基膦的摩爾比為1:1:1:1到1:10:10:10。

知母皂苷元衍生物ZM13

1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.71(m,1H),4.32(d,J＝5.6Hz,1H),4.11(s,1H),3.03(dd,J＝13.6,6.8Hz,2H),2.46(d,J＝10.0Hz,1H),1.32-1.83(m,30H),0.98(s,3H),0.91(d,J＝6.6Hz,3H),0.65(s,3H),ESI-MS:m/z 416.3[M+H]⁺。

實(shí)施例4

知母皂苷元衍生物AA1-AA5的制備，其反應(yīng)式如下：

在氬氣保護(hù)下，將知母皂苷元AA(41.6mg，0.1mmol)和三乙胺(0.1mL)溶于3mL的二氯甲烷中，在0℃的冰浴中慢慢加入相應(yīng)的酰氯(0.15mmol)然后升至室溫繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用水淬滅，用二氯甲烷萃取(3*20mL)、合并有機(jī)相、經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥、減壓濃縮后經(jīng)柱層析(乙酸乙酯/石油醚＝1:15)得到化合物AA1-AA5。

化合物AA1，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.42(m,1H,H-20),5.09(s,1H,H-3),3.96(d,J＝11.0Hz,1H,H-26),3.37(d,J＝11.0Hz,1H,H-26),2.34(s,3H,CH₃COO-)2.07–0.97(m,36H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 458.40[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₂₈H₄₆O₄:458.3412；Found:458.3411。

化合物AA2，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.41(m,1H,H-20),5.08(s,1H,H-3),3.94(d,J＝11.0Hz,1H,H-26),3.35(d,J＝11.0Hz,1H,H-26),2.24(m,2H,CH₃CH₂CH₂COO-),2.05–0.95(m,39H),0.94(s,3H),0.82(s,3H).MS(ESI):m/z 486.44[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z [M+H]⁺Calcd for C₃₀H₅₀O₄:486.3712；Found:458.3710。

化合物AA3，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.74(d,J＝15.4Hz,1H),7.23(d,J＝8.2Hz,2H),7.10(s,1H),7.03(d,J＝15.4Hz,1H),6.92(d,J＝15.4Hz,1H),5.34(s,1H),4.42(dd,J＝14.4,7.0Hz,1H),3.96(d,J＝10.9Hz,1H),3.89(s,2H),3.31(d,J＝10.9Hz,1H),2.10-0.97(m,36H),0.82–0.74(m,3H).MS(ESI):m/z 493.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₇H₅₃O₆:493.3712；Found:493.3713。

化合物AA4，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.25-7.56(m,5H),5.31(s,1H),4.44(m,1H),3.94(d,J＝10.9Hz,1H),3.30(d,J＝10.9Hz,1H),2.07–0.93(m,36H),0.78(s,3H)。

化合物AA5，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.00(d,J＝8.3Hz,2H),6.92(d,J＝8.3Hz,2H),5.30(s,1H),4.42(m,1H),3.96(d,J＝10.7Hz,1H),3.86(s,3H),3.30(d,J＝10.7Hz,1H),2.09–0.95(m,36H),0.77(s,3H).MS(ESI):m/z 551.40[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₅H₅₁O₅:551.3724；Found:551.3723。

實(shí)施例5

利用實(shí)施例4同樣的方法，以知母皂苷元衍生物ZM1為底物分別獲得知母皂苷元衍生物ZM2-ZM9，ZM28-ZM33。

化合物ZM2，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(dd,J＝15.9,7.9Hz,1H),4.13(s,1H),3.94(m,2H),2.48(d,J＝10.2Hz,1H),2.31(t,J＝7.4Hz,2H),1.44–2.08(m,23H),1.28(s,3H),1.18–1.07(m,5H),1.00(s,4H),0.97(d,J＝5.0Hz,3H),0.96(s,2H),0.68(s,3H),ESI–MS:m/z 417.3[M+H]⁺。

化合物ZM3，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(dd,J＝15.7,7.7Hz,1H),4.13(s,1H),3.93(ddd,J＝24.3,10.8,6.5Hz,2H),2.48(d,J＝10.1Hz,1H),2.32(t,J＝7.5Hz,2H),1.27-1.95(m,39H),1.00(s,3H),0.92(m,6H),0.68(s,3H),ESI–MS:m/z 543.3[M+H]⁺。

化合物ZM4，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.00(d,J＝7.9Hz,2H),7.94(d,J＝7.8Hz,2H),4.72(dd,J＝15.9,7.6Hz,1H),4.15(dd,J＝16.7,11.4Hz,3H),2.47(d,J＝9.7Hz,1H)，1.32-1.91(m,32H),1.03(d,J＝6.6Hz,3H),0.96(s,3H),0.64(s,3H),ESI-MS：m/z 535.5[M+H]⁺。

化合物ZM5，白色固體。1H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.03(d,J＝8.7Hz,2H),6.94(d,J＝8.7Hz,2H),4.75(dd,J＝15.8,7.7Hz,1H),4.16(m,3H),3.88(s，3H),2.48(d,J＝10.0Hz,1H),1.32-1.93(m,29H),1.05(d,J＝6.7Hz,3H),0.99(s,3H),0.66(s,3H),ESI-MS:m/z 551.1[M+H]⁺。

化合物ZM6，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.00(d,J＝8.4Hz,2H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),4.74(dd,J＝15.8,7.9Hz,1H),4.18(m,3H),2.48(d,J＝10.1Hz,1H),1.31-1.90(m,29H),1.05(d,J＝6.7Hz,3H),0.99(s,3H),0.65(s,3H),ESI-MS:m/z 555.3[M+H]⁺。

化合物ZM7，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.83(dd,J＝8.5,3.3Hz,1H),7.50(d,J＝2.0Hz,1H),7.32(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.75(m,1H),4.20(d,J＝6.1Hz,2H),4.13(s,1H),2.48(d,J＝10.2Hz,1H),1.35-1.90(m,29H),1.05(d,J＝6.8Hz,3H),0.99(s,3H),0.66(s,3H)。

化合物ZM8，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.83(dd,J＝8.5,3.3Hz,1H),7.50(d,J＝2.0Hz,1H),7.32(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),4.75(m,1H),4.20(d,J＝6.1Hz,2H),4.13(s,1H),2.48(d,J＝10.2Hz,1H),1.35-1.90(m,29H),1.05(d,J＝6.8Hz,3H),0.99(s,3H),0.66(s,3H),ESI-MS:m/z 557.4[M+H]⁺。

化合物ZM9，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.78(d,J＝8.2Hz,1H),7.41(s,1H),7.32(d,J＝8.2Hz,1H),4.66(m,1H),4.14(m,1H),4.06(d,J＝11.5Hz,2H),2.39(d,J＝11.6Hz,4H),1.23-1.85(m,26H),0.90(m,9H),0.57(s,3H),ESI-MS:m/z 580.7[M+H]⁺。

化合物ZM28，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.47(s,1H),4.65(dd,J＝15.2,7.5Hz,1H),4.04(s,1H),3.07(t,J＝5.8Hz,2H),2.40(d,J＝10.2Hz,1H),0.87-1.65(m,42H)0.59(s,3H),ESI-MS:m/z 486.4[M+H]⁺。

化合物ZM29，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.72(d,J＝7.7Hz,2H),7.40(d,J＝7.8Hz,2H),6.38(s,1H),4.71(m,1H),4.11(s,1H)，3.33(m,2H),2.47(d,J＝10.2Hz,1H),1.22-1.95(m,35H),0.64(s,3H),ESI-MS:m/z 554.7[M+H]⁺。

化合物ZM30，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.29(d,J＝7.9Hz,2H),7.95(d,J＝8.1Hz,2H),6.63(s,1H),4.72(s,1H),4.11(s,1H),3.36(td,J＝13.2,6.4Hz,2H),2.48(d,J＝10.0Hz,1H),2.15(dd,J＝29.8,6.6Hz,3H),1.27-1.77(m,26H),0.99(m,6H),0.65(s,3H),ESI-MS:m/z 565.7[M+H]⁺。

化合物ZM31，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.74(d,J＝7.9Hz,2H),6.92(d,J＝7.7Hz,2H),6.26(s,1H),4.72(m,1H),4.11(s,1H),3.85(s,3H),3.32(td,J＝13.6,7.0Hz,2H),2.46(d,J＝10.0Hz,1H),2.14(dd,J＝22.9,6.1Hz,3H),1.31-1.85(m,26H),0.98(d,J＝7.4Hz,6H),0.64(s,3H),ESI-MS:m/z 550.1[M+H]⁺。

化合物ZM32，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.42(s,1H),7.10(s,1H),6.49(s,2H),4.73(dd,J＝15.1,7.4Hz,1H),4.11(s,1H),3.31(m,2H),2.46(d,J＝10.1Hz,1H),2.13(dd，J＝17.7,11.1Hz,3H),1.25-1.83(m,32H),0.65(s,3H)，ESI-MS:m/z 510.3[M+H]⁺。

化合物ZM33，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.62(d，J＝16.0Hz,1H),7.50(d,J＝7.0Hz,2H),7.36(d,J＝5.9Hz,3H),6.38(d,J＝15.6Hz,1H),5.78(s,1H),4.73(s,1H),4.11(s,1H),3.27(ddd,J＝19.5,13.4,6.9Hz,2H),2.47(d,J＝10.3Hz,1H),2.17(dd,J＝13.9,7.1Hz,3H),1.20-1.81(m,32H),0.66(s,3H),ESI-MS:m/z 546.3[M+H]⁺。

實(shí)施例6

知母皂苷元衍生物AA6-AA11的制備，其反應(yīng)式如下：

在氬氣保護(hù)下，將知母皂苷元AA(41.6mg，0.1mmol)和三乙胺(0.1mL)溶于3mL的二氯甲烷中，在0℃的冰浴中慢慢加入相應(yīng)的黃酰氯(0.15mmol)然后升至室溫繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用20mL水淬滅，用二氯甲烷萃取(3*20mL)、合并有機(jī)相、經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥、減壓濃縮后經(jīng)柱層析(乙酸乙酯/石油醚＝1:10)得到化合物AA6-AA11。

化合物AA6，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.72(s,1H,H-3),4.32–4.26(m,1H),3.81(d,J＝11.0Hz,1H),3.42(m,2H),3.33(d,J＝10.2Hz,1H),0.75-1.95(m,39H),0.70(s,3H).MS(ESI):m/z 509.38[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₂₉H₄₉O₅S:509.3111；Found:507.3117。

化合物AA7，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.05(t,J＝8.2,7.8Hz,1H),7.86(d,J＝7.8Hz,2H),7.64(t,(t,J＝8.2,7.8Hz,2H),4.85(s,1H,H-3),4.33–4.26(m,1H),3.84(d,J＝11.0Hz,1H),3.32(d,J＝10.2Hz,1H),0.72-1.92(m,36H),0.68(s,3H).MS(ESI):m/z 557.35[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₃H₄₉O₅S:557.3012；Found:557.3007。

化合物AA8，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.72(d,J＝8.2Hz,2H),7.25(d,J＝8.2Hz,2H),4.75(s,1H,H-3),4.35–4.29(m,1H),3.87(d,J＝11.0Hz,1H),3.22(d,J＝11.0Hz,1H),2.37(s,3H),0.72-1.92(m,36H),0.68(s,3H).MS(ESI):m/z 571.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₄H₅₁O₅S:571.1711；Found:571.1703。

化合物AA9，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.78(s,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,2H),7.61(m,1H),7.25(d,J＝7.5Hz,2H),4.73(s,1H,H-3),4.35–4.29(m,1H),3.87(d,J＝11.0Hz,1H),3.22(d,J＝11.0Hz,1H),2.37(s,3H),0.72-1.92(m,36H),0.69(s,3H).MS(ESI):m/z 571.47[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₄H₅₁O₅S:571.1710；Found:571.1705。

化合物AA10，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.80(d,J＝8.1Hz,2H),7.23(d,J＝8.1Hz,2H),4.80(s,1H,H-3),4.32–4.28(m,1H),3.85(d,J＝11.0Hz,1H),3.21(d,J＝11.0Hz,1H),0.72-1.92(m,36H),0.71(s,3H).MS(ESI):m/z 575.35[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₃H₄₈FO₅S:575.2701；Found:575.2703。

化合物AA11，白色粉末。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.85(s,1H),7.70(m,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,1H),7.23(d,J＝7.6Hz,1H),4.81(s,1H,H-3),4.32–4.28(m,1H),3.85(d,J＝11.0Hz,1H),3.21(d,J＝11.0Hz,1H),0.72-1.92(m,36H),0.71(s,3H).MS(ESI):m/z 575.55[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₃H₄₈FO₅S:575.2700；Found:575.2705。

實(shí)施例7

知母皂苷元衍生物AA12-AA26的制備，其反應(yīng)式如下：

Reagent and conditions:(1)4-Nitrophenyl chloroformate,DCM,Py,0℃-rt,4h,95％(2)Piperazine,TEA,DCM,0℃-rt,3h(3)RCHO,Sodium triacetoxyborohydride,DCE,TEA,rt.

(1)中間體S1的制備

在氬氣保護(hù)下，將知母皂苷元AA(1.664g，40mmol)和吡啶(0.5mL)溶于20mL的二氯甲烷中，在0℃的冰浴中緩慢加入對(duì)硝基苯基氯甲酸酯(60mmol)然后升至室溫繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用100mL水淬滅，用二氯甲烷萃取(3*100mL)、合并有機(jī)相、經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥、減壓濃縮后經(jīng)柱層析(丙酮/石油醚＝1:30)得到化合物S1 2.19g(95％)。

(2)化合物AA12-AA26的制備

在氬氣保護(hù)下，將S1(58.1mg，1mmol)和三乙胺(0.05mL)溶于4mL的二氯甲烷中，在0℃的冰浴中緩慢加入相應(yīng)的胺(1.5mmol)然后升至室溫繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用30mL水淬滅，用二氯甲烷萃取(3*30mL)、合并有機(jī)相、經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥、減壓濃縮后經(jīng)柱層析(乙酸乙酯/石油醚＝1:30)得到化合物AA12-AA26(45％-85％)。

化合物AA12，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.99(s,1H),4.66(s,1H,NH),4.43(dd,J＝14.1,7.4Hz,1H),3.97(dd,J＝11.1,2.4Hz,1H),3.32(d,J＝11.1Hz,1H),3.15(m,2H),0.97–2.02(m,38H),0.95(t,J＝7.4Hz,3H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 502.35[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₁H₅₂NO₄:502.1101；Found:502.1104。

化合物AA13，白色固體¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.99(s,1H),4.70(s,1H),4.43(dd,J＝14.3,7.3Hz,1H),3.97(d,J＝10.6Hz,1H),3.32(d,J＝10.9Hz,1H),3.02(t,J＝6.3Hz,2H),1.12-2.12(m,27H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.01(m,6H),0.94(s,3H),0.93(s,3H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 516.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₂H₅₃NO₄:516.1301；Found:516.1308。

化合物AA14，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.34(m,5H),5.05(s,1H,H-3),4.97(s,1H,NH),4.46–4.33(m,3H),3.97(dd,J＝11.0,2.4Hz,1H),3.32(d,J＝11.0Hz,1H),0.84-2.12(m,35H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 550.41[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₅H₅₁NO₄:550.3810；Found:550.3806。

化合物AA15，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.30(d,J＝7.4Hz,2H),7.25(d,J＝7.4Hz,2H),5.04(s,1H,H-3),4.93(s,1H,NH),4.44(dd,J＝14.2,7.0Hz,1H),4.33(d,J＝4.7Hz,2H,CH₃Ar-CH₂-),3.97(d,J＝11.1Hz,1H),3.32(d,J＝11.1Hz,1H),2.37(s,3H),1.15-2.05(m,27H)1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.01(d,J＝6.5Hz,3H),0.97(s,3H),0.79(s,3H).MS(ESI):m/z 584.40[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₅H₅₁ClNO₄:584.3411；Found:584.3408。

化合物AA16，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.42(s,1H),7.30(m,1H),7.25(d,J＝7.4Hz,1H),7.12(d,J＝7.5Hz,1H)5.03(s,1H,H-3),4.93(s,1H,NH),4.44(dd,J＝14.2,7.0Hz,1H),4.33(d,J＝4.7Hz,2H,CH₃Ar-CH₂-),3.97(d,J＝11.1Hz,1H),3.32(d,J＝11.1Hz,1H),2.37(s,3H),1.15-2.05(m,27H)1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.02(d,J＝6.5Hz,3H),0.97(s,3H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 584.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₅H₅₁ClNO₄:584.3413；Found:584.3409。

化合物AA17，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.21(d,J＝7.2Hz,2H),7.16(d,J＝7.2Hz,2H),5.04(s,1H,H-3),4.93(s,1H,NH),4.43(dd,J＝14.2,7.0Hz,1H),4.34(d,J＝4.7Hz,2H,CH₃Ar-CH₂-),3.97(d,J＝11.0Hz,1H),3.32(d,J＝11.0Hz,1H),2.37(s,3H),1.15-2.05(m,27H)1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.01(d,J＝6.5Hz,3H),0.97(s,3H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 564.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₆H₅₄NO₄:564.4010；Found:564.4008。

化合物AA18，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.19(d,J＝7.8Hz,2H),6.81(d,J＝7.8Hz,2H),5.04(s,1H.H-3),4.92(s,1H,NH),4.43(d,J＝7.2Hz,1H),4.30(s,2H),3.98(d,J＝10.5Hz,1H),3.33(d,J＝10.5Hz,1H),1.12-2.12(m,27H),1.10(d,J＝7.2Hz,3H),1.01(d,J＝6.4Hz,3H),0.97(s,3H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 566.44[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₅H₅₂NO₄:566.3810；Found:566.3808。

化合物AA19，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.21(d,J＝7.6Hz,2H),6.82(d,J＝7.6Hz,2H),5.01(s,1H.H-3),4.94(s,1H,NH),4.44(d,J＝7.2Hz,1H),4.31(s,2H),3.97(d,J＝10.4Hz,1H),3.81(s,3H),3.32(d,J＝10.4Hz,1H),1.13-2.15(m,27H),1.11(d,J＝7.2Hz,3H),1.02(d,J＝6.4Hz,3H),0.96(s,3H),0.77(s,3H).MS(ESI):m/z 580.41[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₆H₅₄NO₄:580.3913；Found:566.3808。

化合物AA20，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.99(s,1H),4.54(s,1H),4.43(d,J＝6.6Hz,1H),3.98(d,J＝10.9Hz,1H),3.49(s,1H),3.32(d,J＝10.9Hz,1H),1.23-2.20(m,37H),1.10(d,J＝6.6Hz,3H),1.01(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 542.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₄H₅₆NO₄:542.4111；Found:542.4104。

化合物AA21，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.99(s,1H),4.41(m,1H),3.95(dd,J＝11.0,2.3Hz,1H),3.42(m,4H),3.30(d,J＝11.0Hz,1H),1.23-2.20(m,33H),1.08(d,J＝7.0Hz,3H),0.99(m,6H),0.76(s,3H).MS(ESI):m/z 528.44[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₃H₅₄NO₄:528.4014；Found:528.4015。

化合物AA22，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.02(s,1H),4.43(dd,J＝14.1,7.6Hz,1H),3.97(dd,J＝10.9,2.4Hz,1H),3.39(dd,J＝13.8,7.2Hz,4H),3.32(d,J＝10.9Hz,1H),1.23-2.21(m,31H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.04–0.97(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 514.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₂H₅₂NO₄:514.3811；Found:514.3815。

化合物AA23，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.01(s,1H),4.41(dd,J＝14.2,7.4Hz,1H),3.95(dd,J＝11.0,2.3Hz,1H),3.51–3.41(m,4H),3.30(d,J＝11.0Hz,1H),2.90–2.73(m,4H),1.23-2.15(m,27H),1.08(d,J＝7.0Hz,3H),1.01–0.93(m,6H),0.76(s,3H).MS(ESI):m/z 529.44[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₂H₅₃N₂O₄:529.3905；Found:529.3903。

化合物AA24，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.45(s,1H,NH),5.12(s,1H),4.41(dd,J＝14.2,7.2Hz,1H),3.95(dd,J＝11.0,2.3Hz,1H),3.30(d,J＝11.0Hz,1H),2.05(s,2H),1.15-2.02(m,27H),1.08(d,J＝7.2Hz,3H),0.99(d,J＝5.7Hz,6H),0.76(s,3H).MS(ESI):m/z 475.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₂₈H₄₇N₂O₄:475.3504；Found:475.3508。

化合物AA25，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.46(s,1H),4.96(s,1H),4.40(dd,J＝14.6,7.3Hz,1H),3.95(d,J＝11.0Hz,1H),3.34(m,2H),3.30(d,J＝11.3Hz,1H),3.09–2.92(m,2H),1.15-2.03(m,27H),1.08(d,J＝7.1Hz,3H),1.02–0.91(m,6H),0.76(s,3H).MS(ESI):m/z 503.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₀H₅₀N₂O₄:503.3801；Found:503.3806。

化合物AA26，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.00(s,1H),4.41(dd,J＝14.3,7.3Hz,1H),3.95(d,J＝11.0Hz,1H),3.30(m,3H),1.11-2.01(m,27H),1.08(d,J＝7.0Hz,3),0.99(d,J＝8.3Hz,6H),0.76(s,3H).MS(ESI):m/z 527.40[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₀H₄₇N₄O₄:527.3505；Found:527.3501。

實(shí)施例8

知母皂苷元衍生物AA27-AA38的制備，其反應(yīng)式如下：

Reagent and conditions:(1)4-Nitrophenyl chloroformate,DCM,Py,0℃-rt,4h,95％(2)Piperazine,TEA,DCM,0℃-rt,3h(3)RCHO,Sodium triacetoxyborohydride,DCE,TEA,rt.

(1)以醛和知母皂苷元為底物

化合物AA27-AA38的合成是從知母皂苷元經(jīng)過(guò)三步獲得，前兩步同氨基甲酸酯的制備，第三步是由化合物AA23和不同醛經(jīng)還原氨化制得。

第三步：在氬氣保護(hù)下，將AA23(53.2mg，1mmol)和相應(yīng)的醛溶于4mL的二氯乙烷中，加入三乙酰氧基硼氫化鈉(1.5mmol)，一分鐘后加入三乙胺(0.05mL)。反應(yīng)完畢后，用30mL水淬滅，用二氯甲烷萃取(3*30mL)、合并有機(jī)相、經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥、減壓濃縮后經(jīng)柱層析(丙酮/石油醚＝1:30)得到化合物AA27-AA38(50％-90％)。

化合物AA27，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.03(s,1H),4.52–4.36(m,1H),3.97(d,J＝10.5Hz,1H),3.51(m,4H),3.32(d,J＝10.5Hz,1H),2.42(m,4H),2.39–2.32(m,2H),1.12-2.08(m,29H)1.10(d,J＝6.9Hz,3H),1.01(d,J＝7.2Hz,3H),0.94-1.01(m,6H),0.78(s,4H).MS(ESI):m/z 571.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₅H₅₉N₂O₄:571.4405；Found:571.4401。

化合物AA28，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.34-7.40(m,5H),6.55(d,J＝16.1Hz,1H),6.35–6.23(m,1H),4.43(d,J＝7.8Hz,1H),3.97(d,J＝11.0Hz,1H),3.54(s,4H),3.32(d,J＝11.0Hz,1H),3.20(d,J＝6.6Hz,2H),2.50(s,4H),1.23-2.05(m,27H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.01(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 645.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₄₁H₆₁N₂O₄:645.4401；Found:645..4407。

化合物AA29，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.25-7.38(m,5H),5.02(s,1H),4.42(d,J＝7.3Hz,1H),3.95(d,J＝10.1Hz,1H),3.43-3.47(m,6H),3.33(d,J＝10.1Hz,1H),2.42(s,4H),1.23-2.05(m,27H),1.10(d,J＝6.9Hz,3H),1.05–0.96(m,6H),0.79(s,3H).MS(ESI):m/z 620.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₉N₂O₄:620.4411；Found:620.4412。

化合物AA30，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.23(d,J＝7.4Hz,2H),7.18(d,J＝7.4Hz,2H),5.03(s,1H),4.43(d,J＝7.3Hz,1H),3.96(d,J＝10.1Hz,1H),3.44-3.48(m,6H),3.32(d,J＝10.1Hz,1H),2.41(s,4H),2.36(s,3H),1.23-2.05(m,27H),1.10(d,J＝6.9Hz,3H),1.05–0.96(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 633.54[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₄₀H₆₁N₂O₄:633.4604；Found:633.4612。

化合物AA31，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7,32(m,2H),7.13(d,J＝8.3Hz,2H),5.01(s,1H),4.44(d,J＝7.3Hz,1H),3.96(d,J＝10.1Hz,1H),3.46-3.49(s,6H),3.32(d,J＝10.1Hz,1H),2.41(m,4H),1.23-2.05(m,27H),1.10(d,J＝6.9Hz,3H),1.05–0.96(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 653.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₈ClN₂O₄:653.4516；Found:653.4512。

化合物AA32，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7,32(m,2H),7.03(m,2H),5.02(s,1H),4.43(d,J＝7.2Hz,1H),3.98(d,J＝10.0Hz,1H),3.50(m,6H),3.32(d,J＝10.0Hz,1H),2.41(m,4H),1.23-2.03(m,27H),1.10(d,J＝6.9Hz,3H),1.05–0.96(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 636.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₈FN₂O₄:636.4306；Found:636.4301。

化合物AA33，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.16(d,J＝8.2Hz,2H),6.77(d,J＝8.2Hz,2H),4.41(dd,J＝14.4,7.2Hz,1H),3.95(d,J＝8.7Hz,1H),3.53–3.38(m,6H),3.30(d,J＝10.3Hz,1H),2.39(m,4H),1.17-2.07(m,27H),1.06(t,J＝10.3Hz,3H),1.01–0.92(m,6H),0.77(d,J＝10.0Hz,3H).MS(ESI):m/z 634.55[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₉N₂O₅:636.4306；Found:636.4301。

化合物AA34，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.21(t,J＝7.8Hz,1H),7.00(d,J＝7.3Hz,1H),6.83(m,2H),5.04(s,1H),4.43(d,J＝7.5Hz,1H),3.97(d,J＝10.7Hz,1H),3.75(m,2H),3.52-3.55(m,4H),3.32(d,J＝10.7Hz,1H),2.55-2.58(m,4H),1,18-2.07(m,27H),1.10(d,J＝6.9Hz,4H),1.05–0.96(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 634.53[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₉N₂O₅:636.4303；Found:636.4304。

化合物AA35，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.25(d,J＝8.0Hz,2H),6.88(d,J＝8.0Hz,2H),5.02(s,1H),4.43(dd,J＝13.8,6.8Hz,1H),3.97(d,J＝10.6Hz,1H),3.83(s,3H),3.48(m,6H),3.32(d,J＝10.6Hz,1H),2.41(m,4H),1.16-2.05(m,27H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.05–0.93(m,6H),0.79(s,3H).MS(ESI):m/z 649.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₄₀H₆₁N₂O₅:649.4513；Found:649.4512。

化合物AA36，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.85-6.89(m,2H),6.80(d,J＝8.0Hz,1H),5.58(s,1H,Ar-OH),5.02(s,1H),4.43(d,J＝7.0Hz,1H),3.98(d,J＝11.3Hz,1H),3.92(s,3H),3.46-3.50(m,6H),3.32(d,J＝11.3Hz,1H),2.41(m,4H),1.15-2.06(m,27H),1.10(d,J＝6.7Hz,3H),1.04–0.96(m,5H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 665.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₄₀H₆₁N₂O₆:664.4518；Found:664.4515。

化合物AA37，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.19(d,J＝8.0Hz,2H),6.73(d,J＝8.0Hz,2H),5.02(s,1H),4.43(d,J＝7.0Hz,1H),3.97(d,J＝10.6Hz,1H),3.47(m,6H),3.38–3.27(m,1H),2.96(s,6H),2.41(m,4H),1.13-2.03(m,27H),1.10(d,J＝6.9Hz,3H),1.04–0.97(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 661.60[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₄₁H₆₄N₃O₄:661.4613；Found:661.4615。

化合物AA38，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.24.7.28(m,2H),7.03(d,J＝8.1Hz,2H),5.02(s,1H),4.43(d,J＝7.2Hz,1H),3.98(d,J＝10.0Hz,1H),3.50(s,6H),3.32(d,J＝10.0Hz,1H),2.41(s,4H),1.12-2.05(m,27H),1.09(t,J＝9.6Hz,3H),1.06–0.96(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 643.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₄₀H₅₈N₃O₄:643.4316；Found:643.43。

實(shí)施例9

知母皂苷元衍生物AA39-AA45的制備，其反應(yīng)式如下：

其以酸和知母皂苷元為底物，化合物AA39-AA45的合成是從知母皂苷元經(jīng)過(guò)三步獲得，前兩步同氨基甲酸酯的制備，第三步是由化合物AA23和不同的酸?；频?。

第三步：在氬氣保護(hù)下，將AA23(53.2mg，1mmol)、EDCI(1.3mL)以及相應(yīng)的酸(2mmol)溶于5mL的二氯甲烷中，然后加入催化當(dāng)量的DMAP(0.5mmol)室溫繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用30mL水淬滅，用二氯甲烷萃取(3*30mL)、合并有機(jī)相、經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥、減壓濃縮后經(jīng)柱層析(丙酮/石油醚＝1:30)得到化合物AA39-AA45(50％-96％)。

化合物AA39，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.45-7.62(m,5H),5.06(s,1H),4.43(dd,J＝14.5,7.4Hz,1H),3.97(d,J＝11.0Hz,1H),3.34-3.75(m,8H),3.32(d,J＝11.0Hz,1H),1.23-2.07(m,27H),1.10(d,J＝7.1Hz,3H),1.09–0.95(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 633.55[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₇N₂O₅:633.4213；Found:633.4210。

化合物AA40，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.43(d,J＝8.3Hz,2H),7.38(d,J＝8.3Hz,2H),5.06(s,1H),4.43(d,J＝6.8Hz,1H),3.98(d,J＝11.1Hz,1H),3.45-3.75(m,8H),3.32(d,J＝11.1Hz,1H),1.23-2.05(m,27H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.02(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 667.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₆ClN₂O₅:667.3816；Found:667.3814。

化合物AA41，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.25(m,2H),6.68(d,J＝7.4Hz,2H),5.05(s,1H),4.43(d,J＝7.4Hz,1H),3.98(d,J＝10.7Hz,1H),3.90(s,2H),3.64(m,4H),3.53(m,4H),3.32(d,J＝10.7Hz,1H),1.15-2.05(m,27H),1.10(d,J＝6.9Hz,3H),1.01(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 648.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₈N₃O₅:648.4416；Found:648.4412。

化合物AA42，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.41(d,J＝8.6Hz,2H),6.95(d,J＝8.6Hz,2H),5.06(s,1H),4.46–4.39(m,1H),3.97(d,J＝11.1Hz,1H),3.86(s,3H),3.45-3.3.59(m,8H),3.32(d,J＝11.1Hz,1H),1.16-2.06(m,27H),1.09(t,J＝9.4Hz,3H),1.01-1.03(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 662.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₄₀H₅₉N₂O₆:662.4312；Found:662.4310。

化合物AA43，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.06(s,1H),4.41(m,1H),3.95(d,J＝10.9Hz,1H),3.73-3.80(m,5H),3.61–3.49(m,4H),3.42(m,2H),3.30(d,J＝10.9Hz,1H),1.15-2.06(m,31H),1.07(d,J＝7.1Hz,3H),1.03–0.93(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 513.55[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₂H₅₃N₂O₃:513.4014；Found:513.4019。

化合物AA44，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.64(d,J＝15.3Hz,1H),7.10(d,J＝8.2Hz,1H),7.00(s,1H),6.92(d,J＝8.2Hz,1H),6.70(d,J＝15.3Hz,1H),5.85(s,1H,-OH),5.04(s,1H),4.41(dd,J＝14.2,7.3Hz,1H),3.95(d,J＝11.0Hz,3H),3.70(s,4H),3.54(s,4H),3.30(d,J＝11.0Hz,1H),1.15-2.10(m,27H),1.08(d,J＝7.0Hz,3H),0.96-0.98(m,6H),0.76(s,3H).MS(ESI):m/z 704.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₄₂H₆₁N₂O₇:705.4403；Found:704.4401。

化合物AA45，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.05(s,1H),4.43(d,J＝6.8Hz,1H),3.97(d,J＝10.2Hz,1H),3.64(s,2H),3.48-3.52(m,8H),3.33(d,J＝10.2Hz,1H),1.15-2.10(m,27H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.05–0.96(m,6H),0.79(s,3H).MS(ESI):m/z 615.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₅H₅₅N₂O₇:615.4003；Found:615.4011。

實(shí)施例10

知母皂苷元衍生物AA46-AA52的制備，其反應(yīng)式如下：

Reagent and conditions:(1)4-Nitrophenyl chloroformate,DCM,Py,0℃-rt,4h,95％(2)Piperazine,TEA,DCM,0℃-rt,3h(3)RSO₂Cl,DCM,TEA,0℃-rt,3h,.

其以磺酰氯與知母皂苷元為底物，化合物AA46-AA52的合成是從知母皂苷元經(jīng)過(guò)三步獲得，前兩步同氨基甲酸酯的制備，第三步是由化合物AA23和不同的酸?；频谩?/p>

第三步：在氬氣保護(hù)下，將知母皂苷元AA23(53.2mg，0.1mmol)和三乙胺(0.1mL)溶于3mL的二氯甲烷中，在0℃的冰浴中慢慢加入相應(yīng)的黃酰氯(0.15mmol)然后升至室溫繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用20mL水淬滅，用二氯甲烷萃取(3*20mL)、合并有機(jī)相、經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥、減壓濃縮后經(jīng)柱層析(丙酮/石油醚＝1:20)得到化合物AA46-AA52。

化合物AA46，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.20-7.55(m,5H),4.98(s,1H),4.42(d,J＝7.5Hz,1H),3.97(d,J＝10.4Hz,1H),3.58(s,4H),3.32(d,J＝10.4Hz,1H),3.00(s,4H),2.46(s,3H),1.10(d,J＝6.8Hz,3H),1.15-2.05(m,26H),1.03–0.96(m,6H),0.96–0.95(m,1H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 669.53[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₈H₅₇N₂O₆S:669.3912；Found:669.3910。

化合物AA47，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.66(d,J＝7.8Hz,2H),7.36(d,J＝7.8Hz,2H),4.97(s,1H),4.42(d,J＝7.5Hz,1H),3.97(d,J＝10.4Hz,1H),3.58(s,4H),3.32(d,J＝10.4Hz,1H),3.00(s,4H),2.46(s,3H),1.10(d,J＝6.9Hz,3H),1.15-2.05(m,26H),1.03–0.96(m,6H),0.96–0.95(m,1H),0.77(s,3H).MS(ESI):m/z 683.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₉N₂O₆S:683.4017；Found:683.4015。

化合物AA48，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.81(s,1H),7.64(d,J＝7.7Hz,1H),7.56(m,1H),7.23(d,J＝7.5Hz),4.99(s,1H),4.42(d,J＝7.5Hz,1H),3.97(d,J＝10.4Hz,1H),3.58(s,4H),3.32(d,J＝10.4Hz,1H),3.00(s,4H),2.46(s,3H),1.11(d,J＝6.9Hz,3H),1.15-2.05(m,26H),1.03–0.96(m,6H),0.96–0.95(m,1H),0.79(s,3H).MS(ESI):m/z 683.50[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₉N₂O₆S:683.4017；Found:683.4015。

化合物AA49，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.80(dd,J＝7.1,5.1Hz,2H),7.25(m,2H),4.98(s,1H),4.42(d,J＝7.4Hz,1H),3.97(d,J＝10.5Hz,1H),3.59(s,4H),3.32(d,J＝10.5Hz,1H),3.02(s,4H),1.15-2.05(m,27H),1.09(t,J＝7.7Hz,3H),1.04–0.93(m,7H),0.79(d,J＝10.7Hz,3H).MS(ESI):m/z 687.40[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₈H₅₆FN₂O₆S:687.3817；Found:687.3813。

化合物AA50，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.57(s,2H),7.49(d,J＝8.1Hz,1H),7.36(s,1H),4.98(s,1H),4.42(d,J＝7.2Hz,1H),3.97(d,J＝10.4Hz,1H),3.60(s,4H),3.32(d,J＝10.4Hz,1H),3.05(s,4H),1.15-2.05(m,27H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.00(d,J＝10.3Hz,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 687.40[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₈H₅₆FN₂O₆S:687.3816；Found:687.3812。

化合物AA51，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.08(s,1H),7.88(d,J＝8.5Hz,1H),7.73(d,J＝8.5Hz,1H),4.99(s,1H),4.42(d,J＝7.6Hz,1H),3.97(d,J＝10.5Hz,1H),3.61(m,4H),3.32(d,J＝11.4Hz,1H),3.07(m,4H),1.14-2.04(m,27H),1.10(d,J＝6.9Hz,3H),1.00(d,J＝10.4Hz,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 771.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₉H₅₅ClF₃N₂O₆S:771.3310；Found:771.3314。

化合物AA52，白色固體。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.05(s,1H),4.43(dd,J＝14.4,7.1Hz,1H),3.97(d,J＝11.1Hz,1H),3.57-3.59(m,4H),3.30-3.35(m,5H),2.99(q,J＝7.3Hz,2H),1.12-2.05(m,27H),1.10(d,J＝7.0Hz,3H),1.05–0.97(m,6H),0.78(s,3H).MS(ESI):m/z 621.45[M+H]⁺；HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺Calcd for C₃₄H₅₇FN₂O₆S:621.3913；Found:621.3911。

實(shí)施例11

當(dāng)R¹為鹵素時(shí)，知母皂苷元衍生物ZM10-ZM12的合成，其反應(yīng)式如下：

第一步，在氬氣保護(hù)下，將知母皂苷元衍生物ZM1(416mg，1mmol)溶于4mL二氯甲烷中，冰浴條件下，加入1mL三乙胺，緩慢加入對(duì)甲苯磺酰氯(292mg，1.5mmol)，反應(yīng)3h后，反應(yīng)結(jié)束，用30mL水淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷(50mL*2)萃取混合液，合并有機(jī)相后，再用飽和食鹽水洗一遍，得到的有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，經(jīng)減壓濃縮后以石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)混合液作為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析，得到中間體化合物S2。

第二步，常溫下，將知母衍生物S2(57mg，0.1mmol)溶于4mLTHF中，加入相應(yīng)的鹵化鈉(0.2mmol)，將反應(yīng)升溫至60℃反應(yīng)3h后，反應(yīng)結(jié)束。用10mL水稀釋反應(yīng)液，用二氯甲烷(20mL*2)萃取混合液，合并有機(jī)相后，再用飽和食鹽水洗一遍，得到的有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，經(jīng)減壓濃縮后以石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)混合液作為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析，得到知母衍生物ZM10-ZM12。

化合物ZM10，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.75(m,1H),4.09(d,J＝34.0Hz,1H),3.51(dd,J＝10.6,4.9Hz,1H),3.44(m,1H),2.49(d,J＝10.2Hz,1H),1.32–1.98(m,29H),1.04(d，J＝6.6Hz,3H),1.00(s,3H),0.69(s,3H),ESI-MS:m/z 527.7[M+H]+。

化合物ZM11，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(m,1H),4.09(d,J＝34.0Hz,1H),3.51(dd,J＝10.6，4.9Hz,1H),3.44(m,1H),2.49(d,J＝10.2Hz,1H),1.32-1.98(m,29H),1.04(d,J＝6.6Hz,3H),1.00(s,3H),0.69(s,3H),ESI-MS:m/z 480.2[M+H]⁺。

化合物ZM12，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(dt,J＝9.7,6.8Hz,1H),4.13(s,1H),3.43(dd,J＝9.8,4.6Hz,1H),3.35(dd,J＝9.8,6.2Hz,1H),2.49(d,J＝10.2Hz,1H),1.32–1.98(m,29H),1.04(d,J＝6.6Hz,3H),1.00(s,3H),0.69(s,3H),ESI-MS:m/z 436.8[M+H]⁺。

實(shí)施例12

當(dāng)R¹為胺基時(shí)，知母皂苷元衍生物ZM14-ZM24的合成，其反應(yīng)式如下：

常溫下，將ZM10(52.6mg，0.1mmol)溶于4mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入相應(yīng)的胺(0.2mmol)，將溫度升至60℃下反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束。用10mL水稀釋反應(yīng)液，用二氯甲烷(20mL*2)萃取混合液，合并有機(jī)相后，再用飽和食鹽水洗一遍，得到的有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，經(jīng)減壓濃縮后以石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)混合液作為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析，得到知母衍生物ZM14-ZM24。

化合物ZM14，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.74(ddd,J＝10.2，7.9,5.7Hz,1H),4.13(s,1H),3.74(q,J＝7.0Hz,1H),2.58(ddd,J＝17.2,9.4,3.7Hz,3H),2.48(d,J＝10.2Hz,1H),2.40(dd,J＝11.7,7.5Hz,1H),1.28-1.96(m,33H),1.00(s,3H),0.93(m,6H),0.69(s,3H),ESI-MS:m/z 472.5[M+H]⁺。

化合物ZM15，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.72(d,J＝9.3Hz,1H),4.11(s,1H),2.58(dd,J＝11.4,5.1Hz,1H),2.42(m,3H),1.26-1.97(m,40H),0.98(s,3H),0.91(d,J＝6.2Hz,3H),0.66(s,3H),ESI-MS:m/z 498.3[M+H]⁺。

化合物ZM16，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.74(ddd,J＝10.2,7.9,5.7Hz,1H),4.13(s,1H),2.46(dd,J＝15.2,8.7Hz,5H),1.24-1.94(m,35H),1.00(s,3H),0.96(d,J＝6.5Hz,3H),0.69(s,3H),ESI-MS:m/z 470.8[M+H]⁺。

化合物ZM17，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(ddd,J＝10.2,7.9,5.7Hz,1H),4.13(s,1H),2.48(d,J＝10.2Hz,1H),2.33(m,3H),1.24-1.94(m,38H),1.02(s,3H),0.91(d,J＝6.6Hz,3H),0.69(s,3H),ESI-MS:m/z 484.4[M+H]⁺。

化合物ZM18，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.72(m,1H),4.11(s,1H),3.69(m,4H),2.46(d,J＝10.2Hz,1H),2.37(m,4H),1.24–1.94(m,31H),0.98(s,3H),0.90(d,J＝6.5Hz,3H),0.66(s,3H),ESI-MS:m/z 486.5[M+H]⁺。

化合物ZM19，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(ddd,J＝10.2,7.9,5.8Hz,1H),4.13(s,1H),2.89(m,4H),2.48(d,J＝10.4Hz,1H),2.36(s,4H),1.24-1.94(m,32H),1.00(s,3H),0.92(d,J＝6.5Hz,3H),0.68(s,3H),ESI-MS:m/z 485.3[M+H]⁺。

化合物ZM20，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(ddd,J＝10.2,7.9,5.7Hz,1H),4.13(s,1H),2.89(m,3H),2.73(d,J＝7.2Hz,2H),2.48(d,J＝10.2Hz,1H),1.32-2.00(m,34H),1.04(d,J＝6.4Hz,3H),1.00(s,3H),0.91(d,J＝6.6Hz,3H),0.69(s,3H),ESI-MS:m/z 499.7[M+H]⁺。

化合物ZM21，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.02(s,1H),7.65(d,J＝7.9Hz,1H),7.38(d,J＝8.1Hz,1H),7.21(t,J＝7.1Hz,1H),7.14(t,J＝7.5Hz,1H),7.06(d,J＝2.0Hz,1H),4.73(ddd,J＝10.1,7.9,5.8Hz,1H),4.13(s,1H),2.97(m,4H),2.61(dd,J＝11.6,5.7Hz,1H),2.45(m,2H),1.27-1.96(m,30H),1.00(s,3H),0.90(d,J＝6.6Hz,3H),0.67(s,3H),ESI-MS:m/z 559.5[M+H]⁺。

化合物ZM22，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(ddd,J＝10.2,7.9,5.7Hz,1H),4.13(s,1H),3.66(t,J＝5.2Hz,2H),2.82(m,2H),2.60(dd,J＝11.8,5.8Hz,1H),2.47(dd,J＝11.7,7.4Hz,2H),1.27-1.96(m,31H),1.00(s,3H),0.97(d,J＝6.6Hz,3H),0.68(s,3H),ESI-MS:m/z 460.7[M+H]⁺。

化合物ZM23，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.75(ddd,J＝10.2,7.9,5.7Hz,1H),4.13(s,1H),3.60(dd,J＝10.4,4.4Hz,1H),3.30(dd,J＝10.4,7.5Hz,1H),2.49(m,2H),2.37(td,J＝7.2,4.4Hz,1H),1.36-1.97(m,34H),0.97(dd,J＝13.0,5.9Hz,8H),0.90(d,J＝6.8Hz,3H),0.68(s,3H),ESI-MS:m/z 502.3[M+H]⁺。

化合物ZM24，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.76(ddd,J＝10.1,7.8,5.7Hz,1H),4.13(s,1H),3.64(m,4H),2.68(ddd,J＝13.2,6.7,4.4Hz,2H),2.59(m,2H),2.48(d,J＝10.1Hz,1H),2.40(dd,J＝12.7,7.5Hz,1H),2.26(m,1H),1.31-1.97(m,31H),0.99(s,3H),0.93(d,J＝6.6Hz,3H),0.68(s,3H),ESI-MS:m/z 504.5[M+H]⁺。

實(shí)施例13

當(dāng)R¹為醚基時(shí)，知母皂苷元衍生物ZM25-ZM27的合成

冰浴條件下，將知母皂苷元衍生物ZM1(416mg，0.1mmol)溶于無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺中，加入氫化鈉(3.6mg，0.15mmol)，最后加入對(duì)應(yīng)的溴代烴，將反應(yīng)升至室溫，反應(yīng)3h后，反應(yīng)結(jié)束。用10mL水稀釋反應(yīng)液，用二氯甲烷(20mL*2)萃取混合液，合并有機(jī)相后，再用飽和食鹽水洗一遍，得到的有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，經(jīng)減壓濃縮后以石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)混合液作為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析，得到知母衍生物ZM25-ZM27。

化合物ZM25，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.74(ddd,J＝10.2，7.9,5.7Hz,1H),4.13(s,1H),3.40(m,2H),3.29(dd,J＝9.3,5.8Hz,1H),3.18(dd,J＝9.3,7.0Hz,1H),2.48(d,J＝10.1Hz,1H),1.35-1.93(m,33H),1.00(s,3H),0.93(m,6H),0.68(s,3H),ESI-MS:m/z 573.5[M+H]⁺。

化合物ZM26，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.72(d,J＝8.3Hz,1H),4.11(s,1H),3.37(t,J＝6.4Hz,2H),3.26(m,1H),3.16(t,J＝8.4Hz,1H),2.46(d,J＝9.5Hz,1H),1.35-1.92(m,37H),0.98(s,3H),0.91(d,J＝6.8Hz,6H),0.66(s,3H),ESI-MS:m/z 501.3[M+H]⁺。

化合物ZM27，白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.35(t,J＝5.8Hz,5H),4.74(ddd,J＝10.2,7.9,5.7Hz,1H),4.52(d,J＝1.6Hz,2H),4.13(s,1H),3.36(dd,J＝9.1,5.7Hz,1H),3.26(dd,J＝9.1,6.8Hz,1H),2.47(d,J＝9.9Hz,1H),1.31-1.93(m,30H),1.00(s,3H),0.97(d,J＝6.7Hz,3H),0.68(s,3H),ESI-MS:m/z 507.1[M+H]⁺。

實(shí)施例14

知母皂苷元衍生物對(duì)H₂O₂誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞活性的影響

(1)試劑材料

PC12鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞購(gòu)于American Type Culture Collection；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、青霉素/鏈霉素、胰酶購(gòu)于Gibco；30％過(guò)氧化氫購(gòu)于國(guó)藥試劑。

(2)實(shí)驗(yàn)儀器

移液器購(gòu)于Thermo Scientific；熒光顯微鏡購(gòu)于Nikon Ti-S,Nikon；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于Thermo Scientific；96孔板購(gòu)于Jet Biofil；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)于上海一恒科學(xué)儀器儀表有限公司。

(3)MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞PC12培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。PCI2細(xì)胞培養(yǎng)于6cm培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃、5％CO₂、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)以1×10⁵個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100μL。設(shè)置調(diào)零孔，空白對(duì)照、損傷組和藥物實(shí)驗(yàn)組。

H₂O₂損傷模型：將96孔板放置過(guò)夜后，實(shí)驗(yàn)組依次加入DMEM培養(yǎng)基稀釋的不同的化合物，化合物終濃度為10μM，調(diào)零孔，空白對(duì)照、損傷組加入等體積培養(yǎng)基。兩小時(shí)后加入400μM的過(guò)氧化氫溶液處理30min，調(diào)零孔，空白對(duì)照組加入等體積D-Hank’s溶液。24小時(shí)后加入5mg/mL的MTT溶液20μL，4小時(shí)后吸去培養(yǎng)基，各孔加入二甲基亞砜(DMSO)200μL，吹打均勻后，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處吸光值。

保護(hù)率＝(A_{實(shí)驗(yàn)組}-A_{陰性對(duì)照組})/(A_空白組-A_{陰性對(duì)照組})×100％

(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例15

知母皂苷元及其衍生物對(duì)Aβ誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞保護(hù)活性

(1)材料

Aβ；D-Hank’s,其它試劑同上。

(2)Aβ?lián)p傷模型：細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)以1×10⁵個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100μL。設(shè)置調(diào)零孔，空白對(duì)照、損傷組和藥物實(shí)驗(yàn)組。將96孔板放置過(guò)夜后，實(shí)驗(yàn)組依次加入DMEM培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的化合物，調(diào)零孔，空白對(duì)照、損傷組加入等體積培養(yǎng)基。兩小時(shí)后加入1μM的Aβ寡聚物連續(xù)孵育48小時(shí)，調(diào)零孔，空白對(duì)照加入等體積D-Hank’s溶液。48小時(shí)后加入5mg/mL的MTT溶液20μL，4小時(shí)后吸去培養(yǎng)基，各孔加入二甲基亞砜(DMSO)200μL，吹打均勻后，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處吸光值。

細(xì)胞活力＝(A_{實(shí)驗(yàn)組}-A_{調(diào)零組})/(A_空白組-A_{調(diào)零組})×100％

(3)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例16

知母皂苷元及其衍生物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α和PGE2水平抑制活性研究

(1)材料

RAW264.7細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)；DMEM培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100mg/L鏈霉素)；Griess試劑(含1％的對(duì)氨基苯磺酰胺、0.1％的N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、2.5％磷酸)；TNF-α檢測(cè)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；PGE2檢測(cè)試劑盒(Cayman Chemicals,USA)，其它試劑同上。

誘導(dǎo)物為脂多糖(LPS)。

陽(yáng)性對(duì)照為氨基胍。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

NO測(cè)試：小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7于DMEM培養(yǎng)基中在37℃，5％CO₂環(huán)境下的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。試驗(yàn)時(shí)將100μL濃度為1×10⁶/mL的細(xì)胞懸液接種到96孔板上，繼續(xù)培養(yǎng)5-6小時(shí)。然后將相應(yīng)濃度的陽(yáng)性對(duì)照藥品、制備好的化合物分別加到懸液中。實(shí)驗(yàn)分為三組：空白對(duì)照組、LPS組、實(shí)驗(yàn)組。半小時(shí)后，將10μL的LPS加入到LPS組和實(shí)驗(yàn)組，使LPS的終濃度為1μg/mL。培養(yǎng)20小時(shí)后，用Griess法通過(guò)測(cè)定細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽的含量間接反映NO的生成量；取50μL細(xì)胞培養(yǎng)液，加入等量的Griess試劑，于540nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算亞硝酸鹽的濃度。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖如圖2所示。

TNF-α/PGE2測(cè)試：細(xì)胞處理方法同上，TNF-α/PGE2水平測(cè)試按照PGE2ELISA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖如圖3、4所示。

NO抑制率＝(陰性對(duì)照組NO產(chǎn)生量-實(shí)驗(yàn)組NO產(chǎn)生量)/陰性對(duì)照組NO生量×100％

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例17

知母皂苷元及其衍生物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞COX-2和iNOS蛋白水平研究

(1)實(shí)驗(yàn)材料

COX-2、iNOS抗體，GAPDH，HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自Santa Cruz，ECL化學(xué)發(fā)光液，顯影液購(gòu)自生工生物，其它試劑同上。

(2)Western Blot實(shí)驗(yàn)方法

RAW264.7細(xì)胞5×10⁵個(gè)/孔接接種于六孔板中，過(guò)夜后，對(duì)六孔板進(jìn)行不同的處理，設(shè)空白實(shí)驗(yàn)組，LPS刺激組，AA36藥物處理組(20μM、15μM、10μM、5μM)，AA36預(yù)處理30min后，LPS組及藥物處理組分別加入培養(yǎng)基稀釋的LPS，終濃度1μg/mL，培養(yǎng)24h后，去上清，D-Hank’s洗兩遍，每孔加裂解液100μL，冰上孵育30min，細(xì)胞裂解液于413000rpm離心15min，取上清，BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，加上樣緩沖液，100℃下變性5min，10％聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5％脫脂牛奶封閉1h后加入COX-2/iNOS一抗，4℃孵育過(guò)夜，于TBST緩沖液中，搖床上洗滌3×10min，上二抗，室溫孵育2h，于TBST緩沖液中，搖床上洗滌3×10min，加入化學(xué)發(fā)光劑，顯色。

(3)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

實(shí)施例18

知母皂苷元及其衍生物AA36對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響

(1)實(shí)驗(yàn)材料

ERK/JNK/p38/p-ERK/p-JNK/p-p38抗體(購(gòu)自Cell Signaling Technology)，其它試劑同上。

(2)Western Blot實(shí)驗(yàn)方法：同上。

(3)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

實(shí)施例19

知母皂苷元衍生物AA36對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NF-KB p65蛋白轉(zhuǎn)位的影響

(1)實(shí)驗(yàn)材料

NF-κB p65抗體(購(gòu)自Cell Signaling Technology)；熒光二抗(購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology)；DAPI(購(gòu)自Roche Diagnostics)；其它試劑同上。

(2)熒光免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞接種于玻璃爬片上，藥物處理結(jié)束后，D-Hank’s清洗三次，4％PFA固定15min，取爬片，組化封閉液100μL室溫孵育1h；p65一抗4℃孵育過(guò)夜；PBS緩沖液洗三次，每次10min；上熒光二抗，室溫孵育2h；PBS洗三次，每次10min；DAPI室溫然核15min，封片。

(3)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

采用本發(fā)明的知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物，其藥物組合物及其應(yīng)用，首次對(duì)該先導(dǎo)化合物進(jìn)行了系統(tǒng)的針對(duì)3位和26位兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)修飾，合成了一系列的新化合物，這些新合成的化合物通過(guò)針對(duì)AD相關(guān)靶點(diǎn)的活性測(cè)試，很多顯示出優(yōu)于先導(dǎo)化合物的活性。對(duì)于治療老年癡呆癥十分具有實(shí)用價(jià)值。彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中知母皂苷元結(jié)構(gòu)修飾的衍生物的不足，十分具有意義。

在此說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說(shuō)明書(shū)應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限制性的。