專利名稱：Peg修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途，具體涉及制備治療病毒、細(xì)菌引起的感染藥物中的用途，尤其涉及PEG修飾的重組人源過氧化氫酶在制備治療病毒、細(xì)菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染藥物中的用途。
背景技術(shù)：
過氧化氫酶廣泛存在于各種需氧生物和一些厭氧生物中，是體內(nèi)過氧化酶體的組成之一和最標(biāo)志性的酶，約占過氧化物酶體酶量的40%左右。有研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶特異高效地將過氧化氫分解成水和氧氣。在正常的生理活動中，細(xì)胞有氧呼吸所消耗的O2約10%被還原成H2O2，進(jìn)而產(chǎn)生一系列活性氧自由基，而過氧化氫酶的正常生理功能就是清除體內(nèi)生成的過氧化氫，并抑制過氧化氫向其他活性氧自由基轉(zhuǎn)化。正常狀態(tài)下，體內(nèi)活性氧生成和清除處在一個平衡的狀態(tài)，而在病理狀態(tài)下，機(jī)體氧化還原狀態(tài)的平衡被打破，抗氧化體系受到抑制，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)過量的活性氧自由基存在，進(jìn)而引起機(jī)體的氧化損傷。有研究證實(shí)，在若干病理狀態(tài)下，生物體內(nèi)的過氧化氫酶含量均有所下降，如糖尿病人體內(nèi)的過氧化氫酶含量顯著低于正常人，阿爾茨海默病病人腦內(nèi)的過氧化氫酶活力也受到抑制。還有研究表明在體外腫瘤模型中，過氧化氫酶活力的減弱是腫瘤發(fā)展進(jìn)程中一個非常重要的因素。目前，有關(guān)上述方面的研究已有不少報道，如采用轉(zhuǎn)基因的方法使小鼠線粒體過氧化氫酶高表達(dá)可延長小鼠生命，延緩心臟病和白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展，減輕氧化損傷。有研究認(rèn)為誘導(dǎo)體內(nèi)過氧化氫酶的表達(dá)可作為抗氧化治療上的一個新的途徑。有很多報導(dǎo)指出，外源性過氧化氫酶對疾病，尤其是氧化性疾病的進(jìn)程有一定的緩解作用。研究結(jié)果證 實(shí)，小鼠靜脈注射外源過氧化氫酶極大地降低了過氧化氫誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，維持血液循環(huán)的過氧化氫酶活性能抑制肺部腫瘤轉(zhuǎn)移，高表達(dá)過氧化氫酶可使晶狀體上皮細(xì)胞的抗氧化耐受性增強(qiáng)；所述的過氧化氫酶抑制了氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)的人動脈平滑肌細(xì)胞增殖。上述報道均顯示了過氧化氫酶在氧化損傷方面的研究方興未艾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供PEG修飾的重組人源過氧化氫酶新的藥物用途，涉及PEG修飾的重組人源過氧化氫酶在制備治療病毒、細(xì)菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染的藥物中的用途。具體而言，本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途，其特征是將基因工程表達(dá)的人源過氧化氫酶用PEG修飾后，用于治療由氧自由基(ROS)引起的氧化損傷性疾病；所述氧化損傷性疾病具體包括病毒、細(xì)菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染。本發(fā)明通過動物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶對病毒包括流感病毒、SARS病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒，細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷博氏菌有明顯的抑制作用。本發(fā)明中，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，為經(jīng)PEG修飾、DNA序列為人源過氧化氫酶cDNA在畢赤酵母中表達(dá)并經(jīng)純化的產(chǎn)物；
所述的重組人源過氧化氫酶具有序列I的序列。本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶通過下述方法制備
將人源過氧化氫酶和活化的PEG 5000以一定的摩爾比投入到硼酸緩沖液，4°C混合均勻后攪拌反應(yīng)12h，每2h取樣一次，檢測混合物中的過氧化氫酶活力；反應(yīng)完成后通過Sephacryl S-300樹脂柱，用20mmol/L的pH 7.0的PBS洗脫，分別收集修飾和未修飾得組份，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；所述PEG修飾的人源過氧化氫酶透析后分裝入滅菌的安培瓶，冷凍干燥，用O. 05M的PBS緩沖液溶解，O. 22um濾膜過濾。本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶進(jìn)行了抗氧化作用動物實(shí)驗(yàn)
采用ICR小鼠(由上海伊萊克斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供)，流感病毒感染引起機(jī)體一系列氧化損傷，通過鼻腔給與PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)，檢測體重變化、死亡保護(hù)、局部病理切片，并進(jìn)行抗氧化能力評價，數(shù)據(jù)均采用SPSS15. O軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，可有效對抗流感病毒H1NUFM1導(dǎo)致的急性肺炎，使肺部病毒滴度減少、抗氧化能力和動物免疫保護(hù)增強(qiáng)、減緩急性肺炎的病理進(jìn)程，從而使肺組織損傷減輕和小鼠體重下降，最終降低小鼠的死亡率，延長存活時間。本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶可與藥學(xué)尚可接受的載體，制成藥物制齊 ，所述的藥物制劑制成鼻腔吸入劑、腹腔注射劑及外用制劑，通過鼻腔吸入給藥、腹腔給藥或外用藥等給藥方式，用于治療由氧自由基(ROS)引起的氧化損傷性疾病，具體涉及治療病毒、細(xì)菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染。為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施方式對本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。


圖I顯示了畢赤酵母表達(dá)的人源過氧化氫酶分離純化情況，其中，A為SDS-PAGE鑒定圖，I為發(fā)酵液上清硫酸銨濃縮液，2為發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨濃縮后、疏水柱脫鹽后、上柱于Q-S柱、純度已經(jīng)達(dá)80%，3為將Q-S柱分液、再經(jīng)羥基磷灰石、純度達(dá)95% ;B為westen-blot鑒定圖，I為發(fā)酵液上清濃縮液，2為Q-S離子交換柱純化后的人源過氧化氫酶，3為羥基磷灰石柱分后的人源過氧化氫酶。圖2顯示了人源過氧化氫酶的PEG修飾產(chǎn)物的分離純化情況，其中，I為未修飾的人源過氧化氫酶，2為修飾后混合物，3為上樣樣品，4為分離出的未經(jīng)修飾的人源過氧化氫酶，5為PEG修飾的人源過氧化氫酶,6為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上而下依次為94kD、66kD、43kD。圖3顯示了感染病毒濃度對死亡率的影響。
圖4是感染后感染病毒后體重變化曲線圖。圖5顯示了肺組織病理學(xué)分析(X 100)，其中，A為N組的肺組織切片，可觀察到完整正常的肺組織結(jié)構(gòu)；B為V組的肺組織切片，重度間質(zhì)性肺炎，可觀察到嚴(yán)重的組織血管水腫，炎癥細(xì)胞浸潤和肺萎陷；(為R組的肺組織切片，無肺萎陷，但是血管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤；D為C組的肺組織切片，輕度肺萎陷，血管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤；E為H組的肺組織切片，肺萎陷有所改善，組織結(jié)構(gòu)大體完整；F為M組的肺組織切片，肺萎陷有所改善，但是血管周圍有嚴(yán)重的炎癥；G為L組的肺組織切片，嚴(yán)重細(xì)胞浸潤和肺萎陷肺病變基本無改善。圖6是病毒血凝滴度測定圖，其中，與V組相比，p〈0. 05，**: p〈0. 01。圖7顯示了抗氧化能力，其中，A為各組肺組織過氧化氫酶活力，與V組相比，p〈0. 05 ;B為各組清除超氧陰離子和超氧自由基能力，與V組相比，p<0.05, p<0.01 ；C為各組MDA含量，與V組相比，p<0. 05,林:ρ〈0·01。
圖8是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬能力比較圖，與V組相比，ρ〈0·05，**: ρ〈0·01。圖9顯示了對免疫系統(tǒng)的保護(hù)，其中，A為各組肺指數(shù)比較，與V組相比，ρ〈0·05，**: ρ〈0.01 ;Β 為各組胸腺指數(shù)比較，與 V 組相比，ρ〈0·05，**: ρ〈0·01。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I PEG修飾的重組人源過氧化氫酶對流感病毒所致急性肺炎的作用 I、PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的制備
采用畢赤酵母表達(dá)的人源過氧化氫酶，將發(fā)酵液4°C離心，收集上清，用硫酸銨沉淀粗酶液，然后依次上苯基纖維素疏水柱、Q-Sepharose FF和羥基磷灰石，獲得95%純度的目的蛋白，將純化的人源過氧化氫酶和活化的PEG 5000以一定的摩爾比投入到硼酸緩沖液，4°C混合均勻后攪拌反應(yīng)2h，將修飾反應(yīng)混合物取適當(dāng)?shù)牡鞍琢可蠘佑陬A(yù)先裝好的Sephacryl S-300樹脂,用20mmol/L的pH 7.0的PBS洗脫,流速lml/min ;核酸蛋白檢測儀于280nm處監(jiān)測洗脫液蛋白含量，并用自動收集儀收集各流分，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；收集的PEG修飾的人源過氧化氫酶透析后分裝入滅菌的安培瓶，冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)溆谩?、PEG修飾的重組人源過氧化氫酶鼻腔滴劑的制備
將冷凍干燥的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶用O. 05M的PBS緩沖液溶解，O. 22um濾膜過濾，備用。3、動物實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)動物采用ICR小鼠，體重16-18g;病毒株采用流感病毒Al (HlNl)鼠肺適應(yīng)株FMl。流感病毒感染小鼠將小鼠雌雄各隨機(jī)分組，設(shè)正常對照組(N組)、病毒對照組(V組)、未修飾人源過氧化氫酶組(C組)、利巴韋林組(R組)、PEG修飾的人源過氧化氫酶高中低(H、M、L)三組。病毒組和給藥組小鼠用乙醚麻醉后鼻腔感染STCID5tl病毒；感染后2h開始第一次給藥，一天給藥兩次，共給藥4天；第五天殺剖，采血和取肺。4、檢測指標(biāo)病毒TCID5tl體重變化、死亡率、肺部病理，并進(jìn)行抗氧化能力評價。(I)感染和給藥后各組小鼠體重和死亡率變化
如圖4所示，感染和給藥后，每天稱量各組中小鼠的體重，結(jié)果顯示，正常小鼠體重隨時間的延長日漸上升，病毒感染組體重明顯下降；結(jié)果表明，PEG修飾的人源過氧化氫酶對抑制體重下降及死亡率的作用具有量效關(guān)系。( 2 )肺指數(shù)和肺病變率
結(jié)果如表I所示，正常組小鼠肺部無病變，肺指數(shù)較?。徊《靖腥竞蟾鹘M肺指數(shù)均顯著上升，平均肺重增至正常水平的3倍。肺部病理學(xué)評分，病毒感染后第5天，肺部平均淤血面積超過了總表面積的75%。結(jié)果表明，所述PEG修飾的人源過氧化氫酶能顯著緩解肺部淤血水腫等病變，將病變區(qū)域面積減少至50%以下，顯示出了劑量依賴性。表I
權(quán)利要求
1.PEG修飾的重組人源過氧化氫酶在制備治療病毒、細(xì)菌引起的感染藥物中的用途，所述的重組人源過氧化氫酶具有序列I的序列。
2.按權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的感染是病毒、細(xì)菌及燒傷感染引起的急性肺炎及燒傷感染。
3.按權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的病毒選自流感病毒、SARS病毒、呼吸道合胞病毒或冠狀病毒。
4.按權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)菌選自金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌或肺炎克雷博氏菌。
5.按權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，為經(jīng)PEG修飾、DNA序列為人源過氧化氫酶cDNA在畢赤酵母中表達(dá)并經(jīng)純化的產(chǎn)物。
6.按權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的藥物制成鼻腔吸入劑、腹腔注射制劑或外用制劑。
7.按權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶通過下述方法制備 采用畢赤酵母表達(dá)的人源過氧化氫酶，將發(fā)酵液4°C離心，收集上清，用硫酸銨沉淀粗酶液后，依次上苯基纖維素疏水柱、Q-Sepharose FF和羥基磷灰石，獲得95%純度的目的蛋白，將純化的人源過氧化氫酶和活化的PEG 5000以一定的摩爾比投入到硼酸緩沖液，4°C混合均勻后攪拌反應(yīng)2h,將修飾反應(yīng)混合物取適當(dāng)?shù)牡鞍琢可蠘佑陬A(yù)先裝好的SephacrylS-300樹脂，用20mmol/L的pH 7.0的PBS洗脫，流速lml/min ;核酸蛋白檢測儀于280nm處監(jiān)測洗脫液蛋白含量，并用自動收集儀收集各流分，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；收集的PEG修飾的人源過氧化氫酶透析后分裝入滅菌的安培瓶，冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途。本發(fā)明中，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，為經(jīng)PEG修飾、DNA序列為人源過氧化氫酶cDNA在畢赤酵母中表達(dá)并經(jīng)純化的產(chǎn)物；其可有效對抗流感病毒H1N1、FM1導(dǎo)致的急性肺炎，使肺部病毒滴度減少、抗氧化能力和動物免疫保護(hù)增強(qiáng)、減緩急性肺炎的病理進(jìn)程，降低死亡率，延長存活時間。本發(fā)明所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶可制成鼻腔吸入劑、腹腔注射制劑或外用制劑，用于治療病毒、細(xì)菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染。
文檔編號A61P17/02GK102772789SQ20111011988
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者馮美卿, 史訓(xùn)龍, 葉麗, 周偉, 周珮, 施志惠, 朱海燕, 李繼楊, 黃海 申請人:復(fù)旦大學(xué)