專利名稱：：知母中菝葜皂苷元及其衍生物的制備方法及其醫(yī)藥新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及知母中高純度菝葜皂苷元及其衍生物的制備方法及其醫(yī)藥新用途，具體涉及菝葜皂苷元及其衍生物在制備抗老年性癡呆，抗衰老，抗抑郁，抗癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：老年癡呆癥、腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病等是危害中老年人健康和生命的重大疾病，而這些疾病不少是青、中年時(shí)期的疾病的延續(xù)。目前，業(yè)內(nèi)對(duì)老年癡呆癥的治療主要還是以西藥為主，包括膽堿能藥物、腦細(xì)胞代謝激活劑、腦血循環(huán)促進(jìn)劑等，但這些藥物在具有療效的同時(shí)也伴隨著肝毒性和胃腸反應(yīng)等副作用。癌癥的治療主要以手術(shù)、放療及化療為主，但許多化學(xué)抗癌藥物在作用于靶細(xì)胞時(shí)往往累及正常細(xì)胞，造成嚴(yán)重的副反應(yīng)。心腦血管疾病屬于慢性疾病，需要長(zhǎng)期服藥，西藥雖然見(jiàn)效快，但毒副作用明顯，不適于長(zhǎng)期服用，因而毒副作用小的中藥顯然更符合患者的需求。我國(guó)藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥的先導(dǎo)化合物，是開(kāi)發(fā)新藥的天然寶庫(kù)，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開(kāi)發(fā)成安全性好、毒性低的新藥具有重要應(yīng)用價(jià)值和廣闊發(fā)展前景。百合科植物知母廣泛分布于我國(guó)黃河以北地區(qū)，其根莖中含有甾體皂苷、黃酮、木脂素、生物堿、多糖、甾醇和脂肪油等，其中皂苷為其主要成分。國(guó)內(nèi)外各學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)知母總皂苷及其苷元有很多藥理活性，其中包括抗老年性癡呆，抗腫瘤，抗心腦血管疾病，抗抑郁，抗衰老，抗病毒，降血糖等。目前，知母總甾體皂苷臨床應(yīng)用較多，且療效顯著，但單一成分的甾體皂苷直接應(yīng)用于臨床的藥物還沒(méi)有。近年來(lái)并沒(méi)有見(jiàn)報(bào)道對(duì)其中藥知母中菝葜皂苷元高純度的提取工藝研究，雖有些研究提取工藝的報(bào)道，但并不能進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，也未見(jiàn)其衍生物的制備方法和其醫(yī)藥用途的相關(guān)報(bào)道，因而制備菝葜皂苷元新衍生物，從而改善溶解度提高藥效是非常重要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供知母中菝葜皂苷元及其衍生物的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供菝葜皂苷元衍生物的醫(yī)藥新用途。本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的—、菝葜皂苷元衍生物的結(jié)構(gòu)通式如下4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中R為F，CI，Br，I，H，S04，S0nR2，0-C(0)-R<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中R為F，CI，Br，I，H，=0，S04，S0nR2，0_C(0)-&，0—單糖或多糖，含N的生物堿類物質(zhì)及其金屬鹽；R'為F，Cl，Br，I，H，=0，S04，S0nR2，0-C(0)-RpO—單糖或多糖，含N的生物堿類物質(zhì)及其金屬鹽。二、知母中高純度的菝葜皂苷元的制備方法具體步驟如下1、按知母藥材于20_80%的乙醇的重量份數(shù)比例1:4-1:6向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡12-24小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰1-4小時(shí)，之后濾渣取液；按所述知母藥材于20-80%的乙醇的重量份數(shù)比例1:6-1:8向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡12-24小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰1-4小時(shí)，之后濾渣取液；按所述知母藥材于20-80%的乙醇的重量份數(shù)比例1:8-1:10向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡12-24小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰1-4小時(shí)，之后濾渣取液；按所述知母藥材于水中的重量份數(shù)比例i:6-i:io向知母藥材中加入水，常溫浸泡12-24小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰l-4小時(shí)，之后濾渣取液。2、將分別通過(guò)上述操作的提取液混合一起后，減壓濃縮，直至不再有乙醇流出或無(wú)醇味為止。3、使?jié)饪s過(guò)的液體通過(guò)經(jīng)過(guò)活化的極性或非極性大孔吸附樹(shù)脂柱，使液體中的皂苷吸附到樹(shù)脂上，并棄去流出液，再用水清洗樹(shù)脂柱子，直至流出液顏色變淺，并棄出流出液，繼用20%-90%的乙醇清洗樹(shù)脂柱，直到樹(shù)脂柱子上的皂苷全部被洗脫下來(lái)為止，并收集洗脫液。4、按洗脫液的重量份數(shù)與礦酸(如鹽酸、硫酸等)的比例為io:i-i:i，向洗脫液中加入酸，然后加熱至沸騰，保持沸騰l-4小時(shí)，取出放涼，抽濾得固體物，將其放干，待用。5、將無(wú)水乙醇與氯仿或二氯甲烷等非極性溶劑(兩溶劑比例任意)的混合液加入至上述固體中，使其全部溶解，讓其自然析出晶體，抽濾得出晶體，按其同樣方法多次重結(jié)晶，最后得到白色晶體。mp194-195°C，Molish反應(yīng)陽(yáng)性，Liebermann-Burchard反應(yīng)陽(yáng)性?！–-NMR(300Hz，CDC13)數(shù)據(jù)如下6:30.6(C-l)，28.6(C-2)，66.0(C-3)，34.4(C-4)，37.0(C-5)，27.1(C-6)，27.0(C-7)，35.2(C-8)，40.1(C-9)，35.5(C-10)，21.4(C-11)，40.1(C-12)，40.2(C_13)，56.6(C-14)，32.2(C-15)，81.2(C-16)，63.2(C-17)，16.6(C-18)，24.2(C-19)，42.5(C-20)，14.9(C_21)，109.6(C_22)，26.4(C_23)，26.2(C_24)，27.5(C_25)，65.1(C_26)，16.3(C-27)。6、將樣品在減壓條件下加熱干燥。所述的乙醇為工業(yè)乙醇。三、菝葜皂苷元衍生物的制備方法如下1、菝葜皂苷元的酯化(1)菝葜皂苷元的甲?；?lt;formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>在氬氣保護(hù)下將菝葜皂苷元溶入重蒸干燥吡啶中，然后將一定濃度甲酸滴加至上述吡啶溶液中，滴加完畢攪拌。減壓蒸出吡啶，向剩余物中加入水，乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相堿洗，水洗，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜后，蒸出溶劑。柱色譜分離，以石油醚_丙酮梯度洗脫得到甲酯衍生化的菝葜皂苷元。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(2)菝葜皂苷元的其它酯化反應(yīng)在氬氣保護(hù)下將菝葜皂苷元溶入干燥二氯甲烷中，然后加入R-C(O)-OH，DMAP與DCC，一定溫度下攪拌，等反應(yīng)完結(jié)束后，過(guò)濾除去未反應(yīng)的DCC和反應(yīng)后生成的DCU與DMAP等雜質(zhì)。蒸出溶劑，將反應(yīng)物研細(xì)，用醚溶解攪拌，靜置過(guò)濾除去雜志，蒸出溶劑。柱色譜分離，以石油醚_丙酮梯度洗脫得到酯化衍生的菝葜皂苷元。2、菝葜皂苷元的鹵素取代(1)氯代在氬氣保護(hù)下將菝葜皂苷元溶入干燥二氯甲烷中，然后加入氯化鋅，最后加入亞硫酰二氯，一定溫度下攪拌。用飽和的碳酸氫鈉終止反應(yīng)，有機(jī)層水洗，干燥，蒸干溶劑。柱色譜分離，以石油醚_丙酮梯度洗脫得到氯代衍生化的菝葜皂苷元。(2)溴代在氬氣保護(hù)下，攪拌加入四氫呋喃溶解的NBS，之后滴加四氫呋喃溶解的三苯基磷，一定溫度下攪拌反應(yīng)，減壓蒸出溶劑，殘?jiān)盟兔严矗舫鋈軇?。柱色譜分離，以石油醚_丙酮梯度洗脫得到溴代衍生化的菝葜皂苷元。(3)碘代向容器中加入菝葜皂苷元，三苯基磷，咪唑，碘與甲苯，氬氣保護(hù)下攪拌，一定溫度下回流。反應(yīng)后，除去沉淀，加入化25203水溶液，除去水層，保留有機(jī)層。有機(jī)層水洗，無(wú)水硫酸鈉除水，減壓蒸出溶劑。柱色譜分離，以石油醚_丙酮梯度洗脫得到碘代衍生化的菝葜皂苷元。3、菝葜皂苷元的硫酸酯化及其金屬鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>在裝有電動(dòng)攪拌器與冷凝管的三頸瓶中加入新蒸吡啶和菝葜皂苷元。冷阱控溫并開(kāi)動(dòng)攪拌器。在攪拌下，向吡啶溶液中滴加入氯磺酸(緩慢滴加)。滴加完全后，攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，然后將溶液傾倒至冰水中，加入無(wú)水乙醇，析出沉淀，抽濾得到固體制得硫酸酯化金屬鹽衍生物。攪拌反應(yīng)完成后，加入氫氧化鈉溶液調(diào)至pH=7，放冷析出沉淀，抽濾得到固體制得硫酸酯化菝葜皂苷元衍生物。4、菝葜皂苷元的羥基消除成雙鍵在冷凝管的三頸瓶中加入二甲苯，菝葜皂苷元，NaHS(^—定溫度下攪拌回流反應(yīng)。反應(yīng)完成后，減壓蒸出溶劑，柱色譜分離，以石油醚-丙酮梯度洗脫得到脫去羥基成為雙鍵的菝葜皂苷元。5.菝葜皂苷元的羥基的氧化反應(yīng)向容器中加入菝葜皂苷元，丙酮，氬氣保護(hù)下攪拌，冰浴溫度滴加NBA。反應(yīng)后加入Na2S03水溶液，加入過(guò)量的水使其沉淀，過(guò)濾得產(chǎn)物。柱色譜分離，以石油醚_丙酮梯度洗脫得到羥基氧化的菝葜皂苷元。6、菝葜皂苷元及其三位羥基衍生物的F環(huán)開(kāi)環(huán)后生成的羥基被R'{R'為F，C1，Br，I等鹵族元素，=0，S04，S0nR(R為脂肪鏈或者芳香族化合物等)，0-C(0)-R(R為脂肪族和芳香族化合物或?yàn)?H和0成金屬鹽等)，0-單糖或多糖，含N的生物堿類物質(zhì)及其金屬鹽}取代8CN無(wú)水條件下，向容器中加入菝葜皂苷元或其三位羥基衍生物無(wú)水A1C13和無(wú)水乙醚，冰浴攪拌，滴入溶有LiAlH4的無(wú)水乙醚，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴下加入10%的硫酸萃取分離有機(jī)層，水層用醚多次萃取，合并有機(jī)液，過(guò)無(wú)水碳酸鈉干燥除水，減壓蒸出溶劑，柱色譜分離，以石油醚_丙酮梯度洗脫得到F環(huán)開(kāi)環(huán)的菝葜皂苷元或其三位羥基衍生物。所得開(kāi)環(huán)產(chǎn)物，可通過(guò)以上1，2，3，4，5等所述反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)得到其產(chǎn)物。四、菝葜皂苷元衍生物的醫(yī)藥新用途將菝葜皂苷元衍生物可與其他藥物和一定的藥物輔料制成固體或液體制劑，用于抗老年性癡呆，抗腫瘤，抗心腦血管疾病，抗抑郁，抗衰老，抗病毒，降血糖等臨床應(yīng)用及這些疾病的預(yù)防。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于所制備的菝葜皂苷元純度可達(dá)98%(高效液相色譜檢測(cè))，L0D《0.5%，且工藝成本較低，提取純化周期很短，適合大規(guī)模的生產(chǎn)知母皂苷元。本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、成本低2、雜質(zhì)含量低3、工藝穩(wěn)定，易于操作，易于實(shí)現(xiàn)4、生產(chǎn)過(guò)程對(duì)環(huán)境無(wú)污染五、本發(fā)明藥物組合物可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)配制技術(shù)和載體，配制成藥物組合物，可以制備成片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、注射劑，口服液及外用藥等劑型。還可以加入到茶或飲料中，制成保健茶或飲料。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)菝葜皂苷元及其衍生物可以用于制藥領(lǐng)域和保健品領(lǐng)域。具體實(shí)施例方式通過(guò)下面實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解這些實(shí)施例只是說(shuō)明本發(fā)明，而不是在任何方面限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:菝葜皂苷元提取(1)按知母藥材于20%的乙醇的重量份數(shù)比例1:6向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡12小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰1小時(shí)，之后濾渣取液；按所述知母藥材于40%的工業(yè)乙醇的重量份數(shù)比例1:8向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡14小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰2小時(shí)，之后濾渣取液；按所述知母藥材于60%的工業(yè)乙醇的重量份數(shù)比例1:10向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡20小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰4小時(shí)，之后濾渣取液；按所述知母藥材于水中的重量份數(shù)比例1:8向知母藥材中加入水常溫浸泡189小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰4小時(shí)，之后濾渣取液。(2)將分別通過(guò)上述操作的提取液混合一起后，減壓濃縮，直至不再有乙醇流出或無(wú)醇味為止。(3)使?jié)饪s過(guò)的液體通過(guò)經(jīng)過(guò)活化的極性或非極性的大孔吸附樹(shù)脂柱，使液體中的皂苷吸附到樹(shù)脂上，并棄去流出液，再用水清洗樹(shù)脂柱子，直至流出液顏色變淺，并棄出流出液，繼用30%.60%.80%的乙醇清洗樹(shù)脂柱，直到樹(shù)脂柱子上的皂苷全部被洗脫下來(lái)為止，并收集洗脫液。(4)按洗脫液的重量份數(shù)與硫酸的比例為3:l，向洗脫液中加入硫酸，然后加熱至沸騰，保持沸騰2小時(shí)，取出放涼，抽濾得固體物，將其放干，待用。(5)將無(wú)水乙醇與二氯甲烷(兩溶劑比例任意)的混合液加入至上述固體中，使其全部溶解，讓其自然析出晶體，抽濾得出晶體，按其同樣方法多次重結(jié)晶，最后得到白色晶體。(6)將樣品在減壓條件下加熱干燥。實(shí)施例2:菝葜皂苷元提取(1)按知母藥材于20%的乙醇的重量份數(shù)比例1:4向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡12小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰1小時(shí)，之后濾渣取液；按所述知母藥材于40%的工業(yè)乙醇的重量份數(shù)比例1:6向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡14小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰2小時(shí)，之后濾渣取液；按所述知母藥材于60%的工業(yè)乙醇的重量份數(shù)比例1:8向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡20小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰4小時(shí)，之后濾渣取液；按所述知母藥材于水中的重量份數(shù)比例1:6向知母藥材中加入水，常溫浸泡16小時(shí)，然后加熱至沸騰，保持沸騰2小時(shí)，之后濾渣取液。(2)將分別通過(guò)上述操作的提取液混合一起后，減壓濃縮，直至不再有乙醇流出或無(wú)醇味為止。(3)使?jié)饪s過(guò)的液體通過(guò)經(jīng)過(guò)活化的極性或非極性的大孔吸附樹(shù)脂柱，使液體中的皂苷吸附到樹(shù)脂上，并棄去流出液，再用水清洗樹(shù)脂柱子，直至流出液顏色變淺，并棄出流出液，繼用20%，50%，90%的乙醇清洗樹(shù)脂柱，直到樹(shù)脂柱子上的皂苷全部被洗脫下來(lái)為止，并收集洗脫液。(4)按洗脫液的重量份數(shù)與鹽酸的比例為9:l，向洗脫液中加入鹽酸，然后加熱至沸騰，保持沸騰2小時(shí)，取出放涼，抽濾得固體物，將其放干，待用。(5)將無(wú)水乙醇與三氯甲烷(兩溶劑比例任意)的混合液加入至上述固體中，使其全部溶解，讓其自然析出晶體，抽濾得出晶體，按其同樣方法多次重結(jié)晶，最后得到白色晶體。(6)將樣品在減壓條件下加熱干燥。實(shí)施例3:菝葜皂苷元的衍生物的制備方法1、菝葜皂苷元的甲?；痑.在氬氣保護(hù)下將lg菝葜皂苷元溶入重蒸干燥吡啶中，然后將70X甲酸(體積比)冰浴溫度下滴加至上述吡啶溶液中，滴加完畢后室溫?cái)嚢琛p壓蒸出吡啶，向剩余物中加入水，乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相IN的氫氧化鈉水洗，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜后，蒸出溶劑。柱色譜分離，以石油醚一丙酮梯度洗脫得到甲酯衍生化的菝葜皂苷元(la)O.88g，收率為80%.b.菝葜皂苷元的碳十六酸酯化反應(yīng)在氬氣保護(hù)下將lg菝葜皂苷元溶入干燥二氯甲烷中，然后加入0.6g碳十六酸，0.lgDMAP與0.lgDCC，350C下攪拌，等反應(yīng)完結(jié)束后，過(guò)濾出去未反應(yīng)的DCC和反應(yīng)后生成的DCU與DMAP等雜質(zhì)。蒸出溶劑，將反應(yīng)物研細(xì)，用乙醚溶解攪拌，靜置過(guò)濾除去雜志，蒸出溶劑。柱色譜分離，以石油醚-丙酮梯度洗脫得到酯化衍生的菝葜皂苷元(lb)0.94g，收率為60%。2、菝葜皂苷元的鹵素取代a.氯代在氬氣保護(hù)下將lg菝葜皂苷元溶入干燥二氯甲烷中，然后加入O.lg氯化鋅，最后加入2ml亞硫酰二氯，室溫下攪拌。用飽和的碳酸氫鈉終止反應(yīng)，有機(jī)層水洗，干燥，蒸干溶劑。柱色譜分離，以石油醚一丙酮梯度洗脫得到氯代衍生化的菝葜皂苷元(2a)0.47g，收率為45%。b.溴代在氬氣保護(hù)下，攪拌加入40ml四氫呋喃溶解的1.5gNBS，之后滴加40ml四氫吠喃溶解的1.6g三苯基磷，室溫下攪拌反應(yīng)，減壓蒸出溶劑，殘?jiān)盟兔严?，蒸出溶劑。柱色譜分離，以石油醚一丙酮梯度洗脫得到溴代衍生化的菝葜皂苷元(2b)0.38，收率為33%。c.碘代向容器中加入lg菝葜皂苷元，l.13g三苯基磷，0.29g咪唑，0.82g碘與50ml甲苯，氬氣保護(hù)下攪拌，12(TC溫度下回流。反應(yīng)后，除去沉淀，加入化25203水溶液，除去水層，保留有機(jī)層。有機(jī)層水洗，無(wú)水硫酸鈉除水，減壓蒸出溶劑。柱色譜分離，以石油醚一丙酮梯度洗脫得到碘代衍生化的菝葜皂苷元(2c)0.33g，收率為26%.3、菝葜皂苷元的硫酸酯化及其金屬鹽在裝有電動(dòng)攪拌器與冷凝管的三頸瓶中加入20ml新蒸吡啶和lg菝葜皂苷元。冷阱控溫-2(TC并開(kāi)動(dòng)攪拌器。在攪拌下，向吡啶溶液中滴加入2ml氯磺酸(緩慢滴加)。滴加完全后，攪拌反應(yīng)16h，然后將溶液傾倒至冰水中，加入100ml無(wú)水乙醇，析出沉淀，抽濾得到固體制得硫酸酯化金屬鹽衍生物。攪拌反應(yīng)完成后，加入氫氧化鈉溶液調(diào)至Ph=7，放冷析出沉淀，抽濾得到固體制得硫酸酯化菝葜皂苷元衍生物(3)0.83g，收率為70%。4、菝葜皂苷元的羥基消除成雙鍵HO在冷凝管的三頸瓶中加入二甲苯，1.467g菝葜皂苷元，O.6gNaHS04，135。C溫度下攪拌回流反應(yīng)。反應(yīng)完成后，減壓蒸出溶劑，柱色譜分離，以石油醚一丙酮梯度洗脫得到脫去羥基成為雙鍵的菝葜皂苷元(4)0.38g，收率為40X。IR圖譜特征B帶吸收大于C帶，得25位甲基構(gòu)型為S.Compd.Yield/%mp，MsM/Z[M+H]+13C_NMR(300MHz，CDC13)Sla80%44514.45，16.15，16.60，20.98，23.93，25.10，25.86，26.03，26.44，27.16，30.68X2,31.83，35.10，35.37，35.37，37.31，40.13，40.33，40.76.42.22，56.48，62.15，65.23，71.06，81.10，109.86，160.10lb60%65514.30，15.50，16.10，16.32，20.88，23.93，25.10，25.86，26.10，26.41，27.05，(29.0029.58)X14，30.65，30.79，31.91，34.04，34.98，35.29，40.21，40.62，42.11，56.36，62.06，65.07，70.36，80.98，109.71，173.412a45%43614.26，15.98，16.41，20.83，23.84，25.70，25.88，26.36，26.4927.01，27.73，29.88，31.66，33.46，36.44，36.81，39.79，40.1840.24，40.59，42.56，56.34，56.4462.03，65.06，80.91，109.652b69%48114.53，16.24，16.68，21.13，24.24，25.38，25.98，26.16，26.6626.68，27.28，30.99，31.30，31.95，34.4435.34，37.88，40.2540.45，40.87，42.33，52.43，56.60，62.31，65.33，81.19，109.912c30%52714.30，16.10，16.32，20.88，23.93，25.10，25.86，26.10，26.4127.05，29.36，30.65，30.79，31.91，34.04，34.98，35.29，40.1140.21，40.62，42.11，48.26，56.36，62.06，65.07，80.98，109.71370%49714.91，15.98，16.41，20.83，23.84，25.70，25.88，26.36，26.4927.01，27.73，29.99，31.66，34.46，36.44，36.81，39.79，40.1840.24，40.59，42.56，56.34，62.03，65.06，75.44，80.91，109.65440%39914.30，16.10，16.32，20.88，23.93，25.10，25.86，26.10，26.4127.05，30.65，30.79，31.91，34.04，34.98，35.29，40.11，40.2140.62，42.11，56.36，62.06，65.07，80.98，109.71，127.08，132.28實(shí)施例4:菝葜皂苷元衍生物的藥理作用實(shí)驗(yàn)1、配藥母藥濃度為10-2，依次稀釋為10-3，10-4，10-5，對(duì)應(yīng)終濃度為10-5，10-6，10-7，10-8ala，lb，2a，2b，2c，4的溶劑為氯仿，3的溶劑為DMSO。2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株的培養(yǎng)及處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株自實(shí)驗(yàn)室獲得，加入含10X小牛血清的DMEM培基制成細(xì)胞懸液，分種于培養(yǎng)瓶中置0)2(5%)培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)(37°C)。實(shí)驗(yàn)前2處換用含2%小牛血清的DMEM使細(xì)胞同步化，然后按實(shí)驗(yàn)要求加入不同的藥物和AnglIo①對(duì)照組(Con組)用10%DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞；②Angl1損傷組用含lumol/LAngll的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h;③AngII+藥物組先加入各藥物孵育lh后，加入lmol/LAngll繼續(xù)培養(yǎng)24h;空白組(Blank組)只加2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液；⑤氯仿對(duì)照組只加入和藥物溶劑相當(dāng)?shù)穆确拢荒銼0對(duì)照組只加入和藥物溶劑相當(dāng)?shù)哪銼O。3、MTTMTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒根據(jù)說(shuō)明使用。以每孔lOOumol種96孔板，至10000/孔密度，各組內(nèi)皮細(xì)胞給藥處理后，每孔加入IO微升MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4小時(shí)。每孔加入lOO微升Formanzan溶解液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育。直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan全部溶解。用酶標(biāo)儀595nm波長(zhǎng)測(cè)定0D值。4、13—半乳糖苷酶染色|3—半乳糖苷酶染料依據(jù)試劑盒(碧云天)進(jìn)行配制。以每孔1ml種12孔板.各組內(nèi)皮細(xì)胞給藥處理后，棄去上清，PBS沖洗1次，每次3min，4X多聚甲醛室溫固定15min，PBS沖洗3次，每次3min，X-半乳糖苷酶(X-gal)染液(染液含20mmol/LX-gal、40mmol/L醋酸_磷酸鈉、5mmol/L鐵氰化鉀、5mmol/L亞鐵氰化鉀、15mmol/L氯化鈉、2mmol/L氯化鎂)于37t:染色36h，顯微鏡下觀察，藍(lán)色為P-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色。隨機(jī)挑選2個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)全視野細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)計(jì)算陽(yáng)性率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，N二3)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>"—"為數(shù)據(jù)缺失，為藥物細(xì)胞毒作用過(guò)大，導(dǎo)致細(xì)胞死亡脫落。兩種藥物溶媒在最高濃度均對(duì)MTT和13-gal染色結(jié)果無(wú)明顯影響。結(jié)果綜合MTT和P-gal染色結(jié)果，以上各化合物皆具有抗衰老作用。實(shí)施例5:菝葜皂苷元衍生物片劑菝葜皂苷元衍生物400g，菝葜皂苷元80g，淀粉40g，10%的淀粉漿24g，干淀粉23g，硬脂酸鎂3g，制成1000片。將菝葜皂苷元衍生物400g、菝葜皂苷元衍生物40g過(guò)80目篩，與淀粉混勻，加淀粉漿制成軟材，以14目篩制粒后，置70°C-S(TC干燥后于12目篩整粒，加入淀粉及硬脂酸鎂混勻后，壓片，即得。實(shí)施例6:菝葜皂苷元衍生物膠囊菝葜皂苷元衍生物300g、知母總皂苷提取物100g，10X淀粉漿適量，制成硬膠囊IOOO粒。取上述藥物過(guò)80目篩，將10%淀粉漿與藥物混合制成軟材后，過(guò)14目篩制粒，與7(TC干燥至水分3%以下，填入空膠囊中，即得。實(shí)施例7:菝葜皂苷元衍生物滴丸菝葜皂苷元衍生物1份、PEG60009份。取PEG6000在油浴上加熱至約135。C，加入菝葜皂苷元衍生物洗粉，不斷攪拌使全部熔融，趁熱過(guò)濾，置貯液瓶，135t:下保溫，用管口內(nèi)、外分別為9.0mm，9.8mm的滴管滴制，滴速80滴/min，滴入含43%煤油的液體石蠟冷卻液中，冷凝成丸，以液體石蠟洗丸，至無(wú)煤油味，用毛邊紙吸去粘附的液體石蠟，即得。實(shí)施例8:菝葜皂苷元衍生物注射用粉針劑菝葜皂苷元衍生物90g知母總皂苷提取物20g，甘露醇lOOg.在無(wú)菌條件下將處方量取藥品和支持劑甘露醇，加注射用水，加熱溶解，加注射用活性炭，加熱濾過(guò)，-401:分裝1000支，冷凍后，升溫、凍干，即得。實(shí)施例9:菝葜皂苷元衍生物口服液菝葜皂苷元衍生物8.8g.知母總皂苷提取物2.0g，甘露醇10.0g，制成1000ml。將提取物和支持劑甘露醇，加適量水，加熱溶解，加入單糖漿，苯甲酸鈉，再加適量的水至1000ml，冷藏，過(guò)濾，封裝于10ml安瓶中，以IO(TC免菌30分鐘，即得。實(shí)施例10:菝葜皂苷元衍生物顆粒劑取菝葜皂苷元衍生物200g、淀粉200g、糊精100g、乙醇5ml，上述組分混合后，過(guò)篩，干燥，得到顆粒劑。實(shí)施例11:菝葜皂苷元衍生物注射劑菝葜皂苷元衍生物10g、氯化鈉0.9g、氫氧化鈉溶液適量鹽酸溶液適量注射用水至100ml，按處方量稱取各組分，加注射用水40ml，攪拌至完全溶解后，加入0.1%活性炭，6(TC保溫?cái)嚢?0min，趁熱過(guò)濾，除去沽性炭，補(bǔ)加汪封至全量。用O.45拼m濾膜粗濾，再用0.22iim的微孔濾膜過(guò)濾。灌封疹熱過(guò)濾，除去活性炭，補(bǔ)加注射用水IO(TC流通蒸氣中滅菌30min，即得菝葜皂苷元衍生物注射液。實(shí)施例12:外用制劑菝葜皂苷元衍生物10g卡波普9403g甘油20g三乙醇胺適量蒸餾水至100ml即得。取卡波姆3g加適量水溶脹后，加入甘油，研磨使?jié)櫇?，加三乙醇胺研磨成透明凝膠基質(zhì)。另取菝葜皂苷元衍生物，用適量水溶解，攪勻。將上述藥液加入凝膠基質(zhì)中，邊加邊研磨，加蒸餾水至1的ml，繼續(xù)攪拌均勻，得透明凝膠劑。實(shí)施例13:凍干制劑菝葜皂苷元衍生物10g、氯化鈉0.9、氫氧化鈉溶液適量、鹽酸溶液適量，注射用水至100ml，按處方量稱取各組分，加注射用水40ml，攪拌至完全溶解后，加入0.1%活性炭，6(TC保溫?cái)嚢?0min，趁熱過(guò)濾，除去活性炭，補(bǔ)加注射用水至全量獷用0.45ym。濾膜粗濾，再用。0.22iim的微孔濾膜過(guò)濾，冷凍干燥，即得注射用菝葜皂苷元衍生物。權(quán)利要求知母中菝葜皂苷元及其衍生物，其特征在于，結(jié)構(gòu)通式如式(I)、(II)所示式(I)中，R為F，Cl，Br，I，H，SO4，SOnR2，O-C(O)-R1，式(II)中，R為F，Cl，Br，I，H，＝O，SO4，SOnR2，O-C(O)-R1，O-單糖或多糖，含N的生物堿類物質(zhì)及其金屬鹽；R′為F，Cl，Br，I，H，＝O，SO4，SOnR2，O-C(O)-R1，O-單糖或多糖，含N的生物堿類物質(zhì)及其金屬鹽，R1為脂肪族和芳香族化合物或?yàn)镺H和O成金屬鹽，R2為脂肪鏈。F2009102585150C00011.tif2.知母中菝葜皂苷元及其衍生物的制備方法，其特征在于用含水乙醇或和水提泡知母藥材，獲得總皂苷提取液；將提取液混合后，減壓濃縮；將濃縮液通過(guò)經(jīng)過(guò)活化的極性或非極性的大孔吸附樹(shù)脂柱，棄去流出液，再用水清洗樹(shù)脂柱子，并棄去流出液，繼續(xù)用20%_90%的乙醇清洗樹(shù)脂柱，并收集洗脫液；按洗脫液的重量份數(shù)與礦酸的比例為io:i-i:i，向洗脫液中加入酸，然后加熱至沸騰，再取出放涼，得固體物；將非極性溶劑的混合液加入至上述固體中，使其全部溶解，讓其自然析出晶體，抽濾得出晶體，按其同樣方法多次重結(jié)晶，最后得到白色晶體；干燥樣品。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的知母中菝葜皂苷元及其衍生物的制備方法，其特征在于所述的總皂苷提取液通過(guò)如下方法獲得按知母藥材于20%_80%工業(yè)乙醇的重量份數(shù)比例i:4i:6向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡，再加熱至沸騰后濾渣取液；按所述知母藥材于20%-80%工業(yè)乙醇的重量份數(shù)比例1:61:8向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡，然后加熱至沸騰后濾渣取液；按所述知母藥材于20%_80%工業(yè)乙醇的重量份數(shù)比例i:8i:io向知母藥材中加入乙醇，常溫浸泡，再加熱至沸騰后濾渣取液；按所述知母藥材于水中的重量份數(shù)比例i:6i:io向知母藥材中加入水，常溫浸泡，再加熱至沸騰后濾渣取液。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的知母中菝葜皂苷元及其衍生物的制備方法，其特征在于所述的乙醇為工業(yè)乙醇。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的知母中菝葜皂苷元及其衍生物的制備方法，其特征在于所述的礦酸優(yōu)選鹽酸、硫酸。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的知母中菝葜皂苷元及其衍生物的制備方法，其特征在于所述的非極性溶劑優(yōu)選無(wú)水乙醇、氯仿、二氯甲烷中的兩種。7.菝葜皂苷元及其衍生物在制備抗老年性癡呆，抗衰老，抗抑郁，抗癌藥物及保健品中的應(yīng)用。8.菝葜皂苷元及其衍生物可以和藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合制成臨床上可接受的片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、注射劑，口服液及外用藥劑型。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及知母中高純度菝葜皂苷元及其衍生物的制備方法及其醫(yī)藥新用途。將知母藥材用含水乙醇或和水提取，采用大孔吸附樹(shù)脂吸附洗脫，酸水解，重結(jié)晶，制備高純度菝葜皂苷元純度達(dá)98％。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明成本低，產(chǎn)物雜質(zhì)含量低，制備工藝穩(wěn)定，易于操作，易于實(shí)現(xiàn)，生產(chǎn)過(guò)程對(duì)環(huán)境無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還通過(guò)化學(xué)合成方法合成一系列菝葜皂苷元衍生物，藥理實(shí)驗(yàn)證明其有抗衰老活性。通過(guò)其藥理活性開(kāi)發(fā)菝葜皂苷元及其衍生物在制備抗老年性癡呆，抗衰老，抗抑郁，抗腫瘤藥物中的新用途。文檔編號(hào)C07J71/00GK101768202SQ20091025851公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2009年12月12日優(yōu)先權(quán)日2009年12月12日發(fā)明者宋少江申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)