本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種毛木耳蛋白質(zhì)提取物制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，人們的生活品質(zhì)也不斷提高，但人們得腫瘤癌癥的幾率也越來(lái)越高，毛木耳是木耳目(Auriculariales)，木耳科(Auriculariaceae)，木耳屬(Auricularia)中的毛木耳種(A.polytricha) 的真菌，是重要的食用菌，亦入藥。富含蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)元素和維生素，子實(shí)體背面絨毛層豐富的木耳多糖，具有較高的抗腫瘤活性，在目前的研究中以毛木耳栽培技術(shù)，毛木耳多糖提取工藝和多糖功能的研究，毛木耳蛋白質(zhì)提取工藝和毛木耳蛋白質(zhì)提取物功能的研究。
例如毛木耳蛋白質(zhì)提取物及其抗腫瘤的應(yīng)用，CN103285046A，該發(fā)明公開了毛木耳蛋白質(zhì)提取物及其抗腫瘤的應(yīng)用。該應(yīng)用是毛木耳蛋白質(zhì)提取物在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述毛木耳蛋白質(zhì)提取物，按照包括如下步驟的方法制備：1）將毛木耳子實(shí)體粉碎后用水浸提，收集水溶性物質(zhì)得到毛木耳水溶性提取物；2）對(duì)所述毛木耳水溶性提取物進(jìn)行飽和度為80% 的硫酸銨沉淀，收集沉淀，對(duì)所述沉淀用去離子水透析后，得到所述毛木耳蛋白質(zhì)提取物。該毛木耳蛋白質(zhì)提取物處理人肝癌HepG2 細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和人肺腺癌A-549 細(xì)胞72h 后，HepG2、MCF-7、A-549 細(xì)胞的增殖均明顯受到抑制，且IC50值分別為45μg/mL,20μg/mL,25μg/mL。
該發(fā)明的這種毛木耳蛋白質(zhì)提取物，制備方法較為簡(jiǎn)單，提取的純度較差，提取量較小。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種制備簡(jiǎn)單，蛋白活性高，提取效率高且提取蛋白質(zhì)純度較高的毛木耳蛋白質(zhì)提取物制備方法及其應(yīng)用。
為解決上述現(xiàn)有的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下方案：一種毛木耳蛋白質(zhì)提取物制備方法，包括以下步驟：
1）選取毛木耳用清水清洗，干燥，粉碎至220-250目，得毛木耳粉末；
2）毛木耳粉末中加入2-3倍的清水，攪拌，浸泡，再加入鹽酸濃度1-2%的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至2.4~3.2后浸泡，在回流條件下浸提2-3次，合并得浸提液；
3）在浸提液中加入飽和度為95-98%的乙醇，攪拌，浸泡，得沉淀物；
4）在沉淀物中加入去離子水后透析，干燥，得蛋白質(zhì)提取物。
作為優(yōu)選，步驟2中浸泡時(shí)采用超聲波助溶，超聲波助溶的頻率為30000-40000Hz，采用超聲波助溶提高毛木耳粉末在水中的溶解度。
作為優(yōu)選，步驟2中加入鹽酸水溶液浸泡時(shí)還需加入毛木耳粉重量3~7倍的提取劑，后浸泡1~2h，并攪拌5~15min，所述提取劑的成分及其重量份為：水5-60份、纖維素酶0.5-3.8份、果膠酶0-3份、金屬螯合劑0.1-3份、葡萄糖2-8份、有機(jī)酸0.2-25份、醋酸纖維素0.02-0.05份、三羥基聚醚0.01-0.04份、乙醇45-75份，通過(guò)纖維素酶和果膠酶破壞毛木耳粉末的細(xì)胞壁，提高蛋白質(zhì)的溶解度，并且提取劑可促進(jìn)纖維素酶和果膠酶作用效果縮短破壞毛木耳粉末的細(xì)胞壁的時(shí)間，而且醋酸纖維素和三羥基聚醚提高蛋白質(zhì)活性。
作為優(yōu)選，步驟2中加入鹽酸水溶液浸泡時(shí)還需加入0.1-0.2%的蛋白質(zhì)抑制劑，防止蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中降解。
作為優(yōu)選，蛋白酶抑制劑為二異丙基氟磷酸或碘乙酸或亮肽素中的一種或兩種。
作為優(yōu)選，步驟2中浸提時(shí)溫度為2-4℃，每隔25-30min攪拌一次，每次攪拌3-5min，提高浸提效率，在2-4℃的低溫下可在浸提時(shí)降低酶的活性起到滅酶作用，防止蛋白質(zhì)降解。
作為優(yōu)選，步驟3中加入乙醇的體積為浸提液體積的3-5倍，浸泡時(shí)溫度為2-4℃，采用高濃度的乙醇溶液防止蛋白質(zhì)溶解。
作為優(yōu)選，步驟4中透析的方法為：將沉淀物溶解在去離子水中液倒入截留分子為10ku～50ku的透析袋進(jìn)行透析，提高所提取的蛋白質(zhì)純度。
毛木耳蛋白質(zhì)提取物在抵抗肝癌、乳腺癌、肺癌的產(chǎn)品中應(yīng)用。
有益效果：本發(fā)明提供的這種毛木耳蛋白質(zhì)提取物制備方法及其應(yīng)用，制備簡(jiǎn)單，制備中加入蛋白酶抑制劑防止蛋白質(zhì)酶解以及在制備過(guò)程中降解，加入纖維素酶破壞毛木耳的細(xì)胞壁提高蛋白質(zhì)的溶解度，提高制備蛋白質(zhì)提取物的純度。
本發(fā)明采用了上述技術(shù)方案提供一種毛木耳蛋白質(zhì)提取物制備方法及其應(yīng)用，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的不足，設(shè)計(jì)合理，操作方便。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述：
實(shí)施例1：
一種毛木耳蛋白質(zhì)提取物制備方法，包括以下步驟：
1）選取毛木耳用清水清洗，干燥，粉碎至220目，得毛木耳粉末；
2）毛木耳粉末中加入2倍的清水，攪拌，浸泡，再加入鹽酸濃度1-2%的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0后浸泡，在回流條件下浸提3次，合并得浸提液；
3）在浸提液中加入飽和度為98%的乙醇，攪拌，浸泡，得沉淀物；
4）在沉淀物中加入去離子水后透析，干燥，得蛋白質(zhì)提取物。
步驟2中浸泡時(shí)采用超聲波助溶，超聲波助溶的頻率為40000Hz，采用超聲波助溶提高毛木耳粉末在水中的溶解度。
步驟2中加入鹽酸水溶液浸泡時(shí)還需加入毛木耳粉重量4倍的提取劑，后浸泡1h，并攪拌8min，所述提取劑的成分及其重量份為：水43份、纖維素酶2.8份、果膠酶2份、金屬螯合劑2.1份、葡萄糖6份、有機(jī)酸7份、醋酸纖維素0.028份、三羥基聚醚0.018份、乙醇66份，通過(guò)纖維素酶和果膠酶破壞毛木耳粉末的細(xì)胞壁，提高蛋白質(zhì)的溶解度，并且提取劑可促進(jìn)纖維素酶和果膠酶作用效果縮短破壞毛木耳粉末的細(xì)胞壁的時(shí)間，而且不會(huì)破壞蛋白質(zhì)活性。
步驟2中加入鹽酸水溶液浸泡時(shí)還需加入0.2%的蛋白質(zhì)抑制劑，防止蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中降解。
蛋白酶抑制劑為二異丙基氟磷酸或碘乙酸或亮肽素中的一種或兩種。
步驟2中浸提時(shí)溫度為4℃，每隔25-30min攪拌一次，每次攪拌3-5min，提高浸提效率，在4℃的低溫下可在浸提時(shí)降低酶的活性起到滅酶作用，防止蛋白質(zhì)降解。
步驟3中加入乙醇的體積為浸提液體積的3.7倍，浸泡時(shí)溫度為4℃，采用高濃度的乙醇溶液防止蛋白質(zhì)溶解。
步驟4中透析的方法為：將沉淀物溶解在去離子水中液倒入截留分子為20ku的透析袋進(jìn)行透析，提高所提取的蛋白質(zhì)純度。
毛木耳蛋白質(zhì)提取物在抵抗肝癌、乳腺癌、肺癌的產(chǎn)品中應(yīng)用。
實(shí)施例2：
選取毛木耳后通過(guò)本發(fā)明的制備方法：
1）選取毛木耳用清水清洗，干燥，粉碎至220目，得毛木耳粉末；
2）毛木耳粉末中加入2倍的清水，攪拌，浸泡，再加入鹽酸濃度1-2%的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.3后浸泡，在回流條件下浸提3次，合并得浸提液；
3）在浸提液中加入飽和度為98%的乙醇，攪拌，浸泡，得沉淀物；
4）在沉淀物中加入去離子水后透析，干燥，得蛋白質(zhì)提取物。
將制備的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：
選取癌細(xì)胞，人肝癌HepG2細(xì)胞（購(gòu)自美國(guó)ATCC）、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞（購(gòu)自美國(guó)ATCC）和人肺腺癌A-549細(xì)胞（購(gòu)自美國(guó)ATCC），人肝癌HepG2細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人肺腺癌A-549細(xì)胞按照常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行活化和傳代。其中，人肝癌HepG2細(xì)胞的傳代和活化培養(yǎng)基是DMEM- 高糖+1% 雙抗+10%FBS（在DMEM- 高糖（Hyclone，SH30022.01B）中加入青霉素和鏈霉素混合液（青霉素10000U/mL、鏈霉素10000μg/mL）和胎牛血清（FBS，Hyclone，SV30087.02），使前兩者最終體積百分含量為1%，F(xiàn)BS 的體積百分含量為10%得到的培養(yǎng)液），人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人肺腺癌A-549細(xì)胞的傳代和活化培養(yǎng)基是RPMI1640+1% 雙抗+10%FBS（在RPMI1640（Invitrogen，11875-093）中加入青霉素、鏈霉素混合液和胎牛血清（FBS），使前兩者最終體積百分含量為1%，F(xiàn)BS的體積百分含量為10%得到的培養(yǎng)液）。
在不同癌細(xì)胞內(nèi)加入不同劑量的毛木耳蛋白質(zhì)提取物，采用MTT法測(cè)定結(jié)果，結(jié)果如表一所示：
表一毛木耳蛋白質(zhì)提取物對(duì)三株癌癥細(xì)胞體外抑制率
本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明作舉例說(shuō)明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。