本發(fā)明涉及一種活性多肽，具體涉及一種從雜色蛤軟體酶解物中分離得到的具有抑制二肽基肽酶-4(DPP-4)活性的多肽，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

二肽基肽酶-4(Dipeptidylpeptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)是一種絲氨酸蛋白酶，能迅速裂解和失活腸促胰島素、神經(jīng)肽和細(xì)胞因子。DPP-4可特異性切斷GLP-1(胰高血糖素樣肽-1)肽鏈N端2位上的丙氨酸或脯氨酸殘基，從而使GLP-1失活。GLP-1作為一種重要的腸促胰島素，除能促進(jìn)胰島素分泌及抑制胰高血糖素分泌外，還具有增加飽膩感、減緩胃排空時間、抑制胰島β細(xì)胞凋亡和促進(jìn)β細(xì)胞增殖等作用。由于可被DPP-4迅速降解，GLP-1的體內(nèi)半衰期極短(小于2min)，若能抑制DPP-4活性則可有效延長GLP-1的作用時間，從而有利于降低血糖水平，具有治療高血糖的作用。

現(xiàn)代研究表明，活性肽與蛋白質(zhì)及單一氨基酸相比，具有更強(qiáng)的生物活性和營養(yǎng)價值?；钚噪膶傩詮?qiáng)、生物活性高、毒副作用小，易被消化吸收，具有多種功能，作為預(yù)防和治療疾病的醫(yī)藥產(chǎn)品進(jìn)行研究有著巨大的開發(fā)潛力。而食源性的DPP-4抑制劑控制高血糖起效快、作用強(qiáng)、安全性高，目前己經(jīng)在臨床治療糖尿病中發(fā)揮了重要的作用。

雜色蛤(Ruditapes philippinarum)是廣泛分布于江蘇沿海的一種重要雙殼經(jīng)濟(jì)貝類。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為其貝殼和軟體部份均可入藥，蛤蜊肉咸、冷、無毒，歸胃、肝、膀胱經(jīng)，宋代《嘉祐本草》中關(guān)于蛤蜊有記載：“潤五臟，止消渴，開胃，解酒毒。主老癖能為寒熱者，及婦人血塊，宜煮食之”?，F(xiàn)代研究表明蛤蜊酶解肽具有抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是在雜色蛤現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)之上，通過大量實驗篩選，采用現(xiàn)代生化技術(shù)手段，對雜色蛤中的抑制二肽基肽酶活性成分進(jìn)行跟蹤評價，通過酶解、乙醇沉淀、離子交換色譜和反相高效液相色譜法等純化方法制備得到一種二肽基肽酶-4的抑制肽，該抑制肽具有很好的抑制二肽基肽酶-4的作用，具有很好的抗高血糖的功效。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種二肽基肽酶-4抑制肽，該抑制肽具有下述的氨基酸序列：Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly-Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp(苯丙氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸)。

本發(fā)明提供的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法，其包括以下步驟：

(1)雜色蛤酶解物的制備：

將雜色蛤軟體洗凈泥沙，加水煎煮，分離煎煮液與肉渣，瀝干；取肉渣，加3至8倍量水勻漿后，加入生物酶酶解，酶解結(jié)束后,于沸水浴滅活，然后加入無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置，再離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到凍干粉；

(2)離子交換色譜純化：

取步驟(1)酶解得到的凍干粉，用去離子水溶解后，經(jīng)離子交換色譜分離，流動相：A相為水，B相為0.8mol/L的氯化鈉溶液，梯度洗脫，流速：2mL/min；檢測波長：220nm；經(jīng)過離子交換色譜分離得到不同組分的酶解物，分別測定各組分對二肽基肽酶-4的抑制活性，取活性最好的部分，冷凍干燥，得凍干粉；

(3)反向色譜分離純化：

取步驟(2)分離后的凍干粉以甲醇溶解，經(jīng)過反相高效液相色譜分離，流動相：A相為體積濃度0.1％甲酸；B相為甲醇，梯度洗脫；流速：10mL/min；柱溫：30℃，檢測波長為220nm，共分離收集到四組成分，然后進(jìn)行冷凍干燥，經(jīng)DPP-4抑制活性測定后得到活性最好的二肽基肽酶抑制肽，其氨基酸序列為Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly-Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp。

作為優(yōu)選方案，以上所述的二肽基肽酶抑制肽的制備方法，所述的酶為中性蛋白酶，所述中性蛋白酶活性為10000至50000U/g。

作為優(yōu)選方案，以上所述的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法，步驟(1)生物酶的加入重量為肉渣重量的0.01％-2.0％，酶解的溫度為37至50℃，酶解的pH為7至9，酶解反應(yīng)時間為2至6h。

作為更加優(yōu)選方案，以上所述的二肽基肽酶抑制肽的制備方法，所述的酶的加入重量為肉渣重量的0.1-1％，酶解的溫度為40～60℃，酶解的pH為6～9，酶解反應(yīng)時間為1-5h。

作為特別優(yōu)選方案，以上所述的二肽基肽酶抑制肽的制備方法，所述的酶的加入重量為肉渣重量的2％，酶解的溫度為45℃，酶解的pH為7.5，酶解反應(yīng)時間為4h。本發(fā)明通過大量試驗篩選最佳的酶解工藝。

酶解工藝的篩選實驗：

1、酶解溫度考察：取雜色蛤軟體肉渣稱重，加3倍量水勻漿，分別加入中性蛋白酶，加酶量為肉渣量的2％，以pH 7.5，酶解反應(yīng)時間4h的條件下，考察溫度因素對酶解產(chǎn)物DPP-4抑制活性影響實驗，分別考察40℃、45℃、50℃、55℃和60℃酶解得到的雜色蛤酶解物對DPP-4的抑制率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，45℃條件下的雜色蛤酶解產(chǎn)物DPP-4抑制活性最佳。

表1 溫度對中性蛋白酶酶解雜色蛤酶解物抑制DPP-4活性的影響

2、酶解pH值的考察：

取雜色蛤軟體肉渣稱重，加3倍量水勻漿，分別加入中性蛋白酶，加酶量為肉渣重量的2％，以溫度45℃，酶解4h條件下，考察酶解反應(yīng)pH對酶解產(chǎn)物抑制DPP-4活性的影響實驗，考察的pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5和9.0時，酶解得到的雜色蛤酶解物對ACE的抑制活性，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，pH7.5時，雜色蛤酶解產(chǎn)物ACE抑制活性最佳。

表2 pH對中性蛋白酶酶解雜色蛤酶解物抑制DPP-4活性的影響

3、中性蛋白酶加入量的考察：

取雜色蛤軟體肉渣稱重，加3倍量水勻漿，分別加入中性蛋白酶，在pH＝7.5、溫度45℃條件下酶解4h，考察加酶量對酶解產(chǎn)物DPP-4抑制活性的影響實驗，考察酶-底物比(酶-底物比按加酶量占肉渣重量的百分比計)分別為0.5％、1％、1.5％、2％和2.5％時酶解得到的雜色蛤酶解物抑制DPP-4活性，結(jié)果見表3，加酶量2％時，雜色蛤酶解產(chǎn)物DPP-4抑制活性最佳。

表3 加酶量對中性蛋白酶酶解雜色蛤酶解物抑制DPP-4活性的影響

4、酶解時間考察：

取雜色蛤軟體肉渣稱重，加3倍量水勻漿，各取適量勻漿液加入中性蛋白酶，加酶量為肉渣重量的2％，在pH 7.5，溫度45℃下，考察酶解反應(yīng)時間對酶解產(chǎn)物抑制DPP-4活性的影響實驗，分別考察1.0h、2.0h、3.0h、4.0h和5.0h酶解得到的雜色蛤酶解物的抑制DPP-4活性，結(jié)果見表4，結(jié)果表明，酶解時間4小時，得到的酶解物ACE抑制活性最強(qiáng)。

表4 不同酶解時間對中性蛋白酶酶解雜色蛤酶解物抑制DPP-4活性的影響

經(jīng)過活性跟蹤評價驗證結(jié)果表明，采用中性蛋白酶作為水解酶，并且加入量為雜色蛤肉渣重量的2％，酶解的溫度為45℃，酶解的pH為7.5，酶解反應(yīng)時間為4h時，具有最佳的酶解效果，可以將具有二肽基肽酶-4抑制活性的多肽分解出來，有利于后續(xù)進(jìn)一步純化得到活性肽，具有很好的技術(shù)效果。

本發(fā)明所述的二肽基肽酶-4抑制肽在制備防治糖尿病等高血糖疾病藥物中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明提供的二肽基肽酶-4抑制肽和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明通過大量試驗對雜色蛤中具有抑制二肽基肽酶-4活性的多肽成分進(jìn)行跟蹤篩選，通過優(yōu)選工藝的酶解、離子交換樹脂分離和反相高效液相色譜分離純化，獲得具有很好的抑制二肽基肽酶-4活性的多肽。并且本發(fā)明對活性多肽進(jìn)行氨基酸序列分析，確定氨基酸序列為Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly-Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp。本發(fā)明工藝設(shè)計合理，可操作性強(qiáng)，為低值貝類開發(fā)新的臨床用途，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的二肽基肽酶-4抑制肽的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。

實施例1

二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法，其包括以下步驟：

(1)雜色蛤酶解物的制備：

將雜色蛤軟體洗凈泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次40分鐘，分離煎煮液與肉渣，瀝干；取肉渣，加3倍量水勻漿后，加入酶活性為50000U/g的中性蛋白酶酶解，中性蛋白酶的加入重量為肉渣重量的2％，酶解的溫度為45℃，酶解的pH為7.5，酶解反應(yīng)時間為4h；酶解結(jié)束后,于沸水浴滅活，然后加入一定量的無水乙醇進(jìn)行醇沉，最終形成60％的醇溶液，并在4℃下靜置24小時，離心后取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到凍干粉。

(2)離子交換色譜純化：

取步驟(1)酶解得到的凍干粉以去離子水溶解后，通過AKTA 900FPLC系統(tǒng)進(jìn)行離子交換分離純化，流動相為：A相：水，B相：0.8mol/L的氯化鈉溶液；洗脫條件為：0.8mol/L氯化鈉溶液0％(0～40min)，0.8mol/L氯化鈉溶液0％～100％(40～140min)；流速：2mL/min；檢測波長：220nm。酶解物被分離成不同組分，按實施例4方法分別測定各組分DPP-4抑制活性，取活性最好的部分，冷凍干燥，得凍干粉。

(3)反向色譜分離純化：

取步驟(2)分離后的凍干粉以甲醇溶解，經(jīng)過反相高效液相色譜分離，流動相為：A相：0.1％甲酸；B相：甲醇，洗脫程序為：B相甲醇體積由2％至10％(0～10min)，B相甲醇體積由20％至40％(10～20min)，B相甲醇體積由40％至100％(20～25min)；流速：10mL/min；柱溫：30℃，檢測波長為220nm，共分離收集到四組成分，然后進(jìn)行冷凍干燥，經(jīng)DPP-4抑制活性篩選，得到活性最好的二肽基肽酶-4抑制肽。

實施例2 二肽基肽酶-4抑制肽的序列分析

取實施例1制備得到的二肽基肽酶-4抑制肽，采用nano-LC-ESI-MS/MS分析多肽的氨基酸序列，質(zhì)譜條件為：ESI源，掃描方式：正離子模式，質(zhì)量掃描范圍：50～1000m/z；分析得到活性多肽分子量為1456.59Da，質(zhì)譜檢測圖如圖1所示，測定得到氨基酸序列為：Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly-Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp。

實施例3 二肽基肽酶-4抑制肽的合成

根據(jù)實施例2獲得的氨基酸序列，采用固相合成的方法，合成二肽基肽酶-4抑制肽Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly-Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp，合成后的多肽通過HPLC分析純度為98％，質(zhì)譜測定分子量為1456.59Da,與純化多肽分子量一致，二級質(zhì)譜碎片與純化多肽碎片一致。

實施例4 二肽基肽酶-4抑制肽活性測試

本發(fā)明采用比色法測定二肽基肽酶-4抑制活性，具體步驟如下：取實施例1和實施例3分別制備得到的抑制肽溶于Tris-HCI緩沖液(含20mmol/L Tris,pH 8.0,0.1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA)制成相應(yīng)的樣品液。二肽基肽酶-4(DPP-4)、Gly-Pro-PNA分別用Tris-HCl緩沖液(含20mmol/L Tris,pH 8.0,0.1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA)配置成8U/L的DPP-4溶液和1.6mmol/L的Gly-Pro-PNA(底物)溶液。將25μL樣品與25μL底物混勻，37℃孵育10min,再加入50μL DPP-4溶液，在37℃孵育1小時，后加入1mol/L醋酸鈉緩沖液(PH 4.0)100μL,405nm處測定吸光度值(A)，并計算抑制率。同時用Tris-HCI緩沖液代替樣品做空白對照。

DPP-4抑制率(％)＝[(A陰性對照-A空白對照)-(A樣品-A樣品空白)]/(A陰性對照-A空白對照)×100％

式中：A為吸光度值。

測定得到本發(fā)明實施例1和實施例3制備得到的二肽基肽酶-4抑制肽的體外抑制IC50均為15.73μM，可用于開發(fā)成為將血糖的藥物或保健品，和現(xiàn)有技術(shù)相比取得了很好的預(yù)料不到的技術(shù)效果。

本發(fā)明從雜色蛤中提取純化制備得到具有二肽基肽酶-4抑制活性的多肽，具有很好的抗高血糖活性，并且安全性能高，具有廣闊的應(yīng)用前景。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京中醫(yī)藥大學(xué)

<120> 一種二肽基肽酶-4抑制肽及其制備方法與其應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Phe Asp Phe Trp Asp Gly Arg Asp Gly Glu

1 5 10

Val Asp

12