本發(fā)明涉及引物及探針，具體涉及用于檢測鮑類皰疹病毒的引物組及探針序列。

背景技術：

鮑皰疹病毒（abaloneherpes-likevirus，abhv）作為鮑低溫病毒病的主要病原，造成了自1999年春季開始的中國南方鮑主養(yǎng)區(qū)養(yǎng)殖雜色鮑的惡性流行病，對我國雜色鮑養(yǎng)殖業(yè)造成了毀滅性的打擊。該病傳染性強，可感染各規(guī)格雜色鮑，但極少引起盤鮑等發(fā)病，具有種屬特異性；該病來勢兇猛，從癥狀出現(xiàn)到全池死亡通常只要3天時間。目前，針對該病毒病尚無有效的治療方法，病毒的早期準確檢測對疾病的預防和控制尤為重要，因此建立一種簡便、快速、靈敏、準確的病毒檢測方法對病毒病的防控具有重要意義。目前，常用的是以聚合酶鏈式反應（pcr）為代表的病原檢測技術。但是此過程需要精密的儀器和專業(yè)的試驗場地，耗時長，時效性低，不能滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場診斷的需求。重組酶聚合酶擴增（rpa）是近幾年出現(xiàn)的一種可在室溫下進行的核酸快速檢測技術，無需溫控設備，反應可在15分鐘內迅速完成，具有和pcr一樣的靈敏度和特異性，非常適宜水產(chǎn)病原的現(xiàn)場快速檢測。rpa檢測所用的引物組和探針是其核心組分，它們決定著rpa的檢測效果。但rpa引物和探針的設計難度較大，沒有類似pcr引物的專業(yè)設計軟件，檢測的靈敏度和特異性完全依賴于引物設計者的經(jīng)驗和大量的試驗驗證。有時從數(shù)十套候選引物探針組合中都難以篩選到1套可用的檢測序列，因此引物設計是rpa檢測方法成敗的關鍵。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種用于檢測鮑類皰疹病毒的引物組以及探針序列。

本發(fā)明的引物組和探針序列是根據(jù)病毒的orf38（genbankaccessionno.jx453331.1）基因序列進行設計的。

本發(fā)明提供的用于檢測鮑類皰疹病毒的引物組以及探針序列，其中，所述的引物組為：

fp:ctttcttaccgctttcaatctgatccgtgg

rp:gaacaggggtaattgtatagcaactgcgta

探針序列：

gcgtacagtaaaacgaaaaccatggcaca（dt-fam）gc（thf）ca（dt-bhq1）tgaaaacatccaagc（c3spacer）。

本發(fā)明的目的之二是提供使用上述引物組和探針序列在制備用于rpa檢測鮑類皰疹病毒的試劑的應用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供一套用于鮑類皰疹病毒的熒光定量rpa（qrpa）檢測引物和探針組，以它們?yōu)榛A開發(fā)的熒光定量rpa檢測方法具有靈敏度高、特異性強、反應迅速、儀器設備要求低等優(yōu)點，非常適用于水產(chǎn)動物病原檢測。abhv-qrpa檢測體系的檢測靈敏度與qpcr相似，但檢測時間僅為20±0.50分鐘，時間相比qpcr大大縮短；反應溫度為恒溫37℃，無需升降溫系統(tǒng)，適于野外實地操作。

附圖說明

圖1是實施例一中擴增產(chǎn)物的電泳圖。

圖2是abhv-qrpa檢測體系擴增曲線圖；

不同的曲線代表10⁷?10的不同濃度質?？截悢?shù)，每條擴增曲線是三次重復測量的平均值。

圖3是abhv-qrpa檢測體系的標準曲線；

體現(xiàn)了abhv-qrpa檢測體系中不同濃度標準品達到熒光閾值對應的循環(huán)數(shù)。

圖4是abhv-qrpa與abhv-qpcr檢測結果的散點圖；

體現(xiàn)了abhv-qrpa與abhv-qpcr檢測結果之間的相關性。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于以下的實施例。

實施例1引物組和探針的設計和特異性檢測

根據(jù)病毒的orf38（genbankaccessionno.jx453331.1）基因序列設計引物組和探針，其中目標基因序列為：

tgaacaggggtaattgtatagcaactgcgtacagtaaaacgaaaaccatggcacatgccattgaaaacatccaagcaaacacccaaggcaagtttgttgttcctttatgcaaacagattctcaaaacgactaaagaaaccacggatcagattgaaagcggtaagaaaga。

fp:ctttcttaccgctttcaatctgatccgtgg

rp:gaacaggggtaattgtatagcaactgcgta

探針序列：

gcgtacagtaaaacgaaaaccatggcaca（dt-fam）gc（thf）ca（dt-bhq1）tgaaaacatccaagc（c3spacer）。

特異性檢測：建立含有abhv的陽性對照、ddh2o的陰性對照、蝦病毒（wssv）基因組dna對照、卵形鯧鲹基因組dna對照、東風螺基因組dna對照、牡蠣基因組dna對照、水體dna對照和嗜水氣單胞菌基因組dna對照，以這些基因組dna作為模板，進行檢測。

鮑皰疹病毒基因組dna，蝦病毒（wssv）基因組dna、卵形鯧鲹基因組dna、東風螺基因組dna和牡蠣基因組dna提取使用海洋動物組織提取試劑盒（東盛，廣東，中國），具體操作按照說明書上指示進行。

水體dna和嗜水氣單胞菌基因組dna提取使用細菌dna提取試劑盒（magen，蘇州，中國），具體操作按照說明書上指示進行。

反應體系：

rehydrationbuffer（twistdx試劑盒（tabas03kit））:14.8ul

rpafp（10μm）:1.2μl

rparp（10μm）:1.2μl

ddh2o:4.6μl

dna（50~500ng）:2μl

mgac（280nm）:1.2μl

反應條件：37℃孵育30分鐘。

反應結束后，反應物通過瓊脂糖凝膠電泳（1.5%的瓊脂糖）的結果進行判斷，結果顯示，這些基因組dna和陰性對照均沒有擴增信號，而陽性對照有明顯的擴增信號（圖1）?？梢?，本發(fā)明建立的引物組和探針特異性強。

實施例2靈敏度驗證

標準曲線模板由上海英濰捷基公司合成。該模板是由目標基因片段和pmd18-tvector載體連接而成。載體序列已公開：http://wenku.baidu.com/view/385564bdf121dd36a32d8271.html。

采用絕對定量法進行檢測：將構建的質粒標準品用tebuffer作10倍梯度稀釋，構建不同濃度梯度10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²和10制作標準曲線，用ddh2o作為陰性對照，每個濃度重復三次。運用實時熒光定量pcr儀（eppendorf）進行rpa擴增反應。

反應體系：

rehydrationbuffer（twistdx試劑盒，taexo02kit）:14.7μl

rpafp（10μm）:1.1μl

rparp（10μm）:1.1μl

probe（10μm）:0.3μl

ddh2o:4.6μl

dna（50~500ng）:2μl

mgac（280nm）:1.2μl

反應條件：37℃孵育30分鐘。

根據(jù)各個濃度擴增結果建立各個濃度的擴增曲線以及擴增效率，統(tǒng)計結果，建立標準曲線，結果參見圖2和圖3。從圖2可見，該檢測方法對abhv的檢測限為100拷貝。

實施例3可行性驗證

為了進一步確定本發(fā)明qrpa檢測體系的可靠性，我們隨機抽出50只雜色鮑，同時對其體內的abhv含量分別進行qrpa與qpcr檢測。結果顯示(參見圖4)，兩個診斷方法的檢測結果呈現(xiàn)出較好的相關性（r²>0.8）

鮑肌肉組織dna提取使用海洋動物組織提取試劑盒，具體操作按照說明書指示進行。

qrpa檢測方法、引物組和探針同實施例2。

qpcr檢測方法采用的是已經(jīng)報道的taqman^?pcr技術（corbeils,williamslmetal,.developmentandvalidationofataqman?pcrassayfortheaustralianabaloneherpes-likevirusserge.diseasesofaquaticorganisms.2010)，所用引物和探針序列分別為：

f：aacccacacccaatttttga

r：cccaaggcaagtttgttgtt

probe：6fam-ccgctttcaatctgatccgtgg-tamra。

本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。凡是依據(jù)本發(fā)明的實質技術對以上實施例所作的任何細微修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術方案的范圍內。

序列表

<110>中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所

<120>用于檢測鮑類皰疹病毒的引物組以及探針序列

<160>7

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>引物fp

<400>1

ctttcttaccgctttcaatctgatccgtgg30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>引物rp

<400>2

gaacaggggtaattgtatagcaactgcgta30

<210>3

<211>48

<212>dna

<213>探針序列

<400>3

gcgtacagtaaaacgaaaaccatggcaca（dt-fam）gc（thf）ca（dt-bhq1）tgaaaacatccaagc（c3spacer）48

<210>4

<211>169

<212>dna

<213>orf38

<400>4

tgaacaggggtaattgtatagcaactgcgtacagtaaaacgaaaaccatggcacatgcca60

ttgaaaacatccaagcaaacacccaaggcaagtttgttgttcctttatgcaaacagattc120

tcaaaacgactaaagaaaccacggatcagattgaaagcggtaagaaaga169

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>引物f

<400>5

aacccacacccaatttttga20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>引物r

<400>6

cccaaggcaagtttgttgtt20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>引物r

<400>7

6fam-ccgctttcaatctgatccgtgg-tamra22